孙宇；乔凤娟；王昊；孙炳欣
目的 原核表达鸡干扰素γ(chicken interferon γ,ChIFNγ),并对其抗传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)活性进行检测.方法 PCR法扩增ChIFNγ基因,克隆至载体pET-28a中,转化感受态E.coliBL21,经IPTG诱导表达,His-binding-resin柱进行纯化.取200 ng纯化蛋白,加至鸡胚成纤维细胞,37℃孵育24 h,接种IBDV,攻毒48 h观察细胞病变情况.将纯化蛋白经腹腔注射14日龄雏鸡,200 μg/只,24 h后再注射1次,48 h后用IBDV进行感染,103 TCID5o/只,感染48 h后无菌取鸡法氏囊组织,进行病理学及qRT-PCR检测.结果 纯化蛋白相对分子质量约18 000,可与抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,浓度约0.8 mg/mL.加入纯化蛋白的鸡成纤维细胞病变明显减轻;注射纯化蛋白雏鸡的法氏囊组织病变减轻,病毒载量明显降低(P＜0.001).结论 本实验成功表达了ChIFNγ重组蛋白,且于体内、外均有抑制IBDV的作用,为该蛋白的应用提供了实验依据.
作者：禹航；李晓婷；刘知伟；张宇；姚丽莉；宋佰芬 刊期： 2018年第12期
目的 探讨不同信号肽对GLP-1-Fc融合蛋白表达的影响.方法 对含7种不同信号肽(A～G)GLP-1-Fc融合蛋白的谷氨酰胺缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHOK1SV GS-KO)进行流加培养,评估含各信号肽细胞的比生长率,并检测融合蛋白的表达量、反相纯度、电荷异质性组成、降解比例及糖型.同时对含优信号肽GLP-1-Fc融合蛋白的细胞进行高密度发酵,并检测生物活性.结果 含信号肽E的重组细胞比生长率略低,相应的融合蛋白表达量也略低,但反相纯度较高,酸性异构体比例较低,主峰含量高,且降解比例较低,糖型GOF/GOF含量高,整体质量较好,因此确定其为佳信号肽.含信号肽E的细胞在1L和7L细胞反应器中发酵,RP-HPLC纯度分别高达89.66％和89.76％,生物活性与市售参比制剂一致.结论 信号肽的筛选和优化需综合评估信号肽对融合蛋白表达量和产物关键质量属性的影响.
作者：陈英；肖海鹏；张奕敏；黄成潭；龚庆伟；马利；陈小锋；李文佳 刊期： 2018年第12期
目的 建立篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒的工艺.方法 对细胞接种密度、载体装量、培养基种类、病毒培养温度、pH、MOI等培养条件进行优化,通过测定葡萄糖消耗量、病毒滴度、宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量,分析并确定脊髓灰质炎病毒的适培养工艺参数.结果 载体装量400～ 600 g,细胞接种密度1×106个/mL时,葡萄糖消耗量大,平台期持续2～3d,此时细胞接种病毒佳.以0.01～0.3 MOI接种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,采用199培养基于(33±0.5)℃,pH7.4～7.6条件下培养时,病毒滴度高,HCP残留量较低,为适培养工艺.结论 初步建立了基于篮式生物反应器的脊髓灰质炎病毒高效制备工艺.
作者：梁宏阳；赵玉秀；于守智；张弓；刘超；刘小娟；张晋；张达伦；王辉 刊期： 2018年第12期
目的 分析雾化吸入低剂量蓖麻毒素(ricin toxin,RT)对小鼠肺组织损伤修复的影响.方法 采用改良寇氏法检测小鼠雾化吸入不同剂量RT(1.312、2.2、3.704、6.2、10.44 μg/kg)的LC50,确定RT雾化染毒剂量.小鼠雾化吸入1/30 LC50剂量RT后,分别在第0.5、1、2、3、4、5、6、7天,分离肺组织,HE染色观察小鼠肺组织病理学变化,免疫组化方法检测肺组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达.结果 小鼠雾化吸入RT的LC50为(4.95±0.14) μg/kg;雾化染毒后,小鼠肺组织损伤程度及MMP-2、MMP-9蛋白的表达趋势一致.第1、2天时,肺组织血管周围弥漫性水肿,MMP-2、MMP-9蛋白的表达高于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);第3、4天时,肺泡结构完全破坏,第3天MMP-2蛋白的表达达到高,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01),第4天MMP-9蛋白的表达达到高,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);至第7天时,肺损伤程度基本恢复至正常状态,MMP-2、MMP-9蛋白的表达也呈下降趋势.结论 雾化吸入1/30 LC50剂量RT后,可引起小鼠肺组织损伤,且损伤可在7d内修复.
作者：王燕；黄燕霞；许娜；孙成彪；边红；万家余；李乐天；刘文森 刊期： 2018年第12期
目的 建立检测重组戊型肝炎疫苗类病毒颗粒(hepatitis E virus-like particle,HE-VLP)纯度的高效分子排阻色谱法(size-exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC),并对该方法进行验证及应用.方法 利用TSK G5000 PW色谱柱(7.5 mm×30cm)和LC-20AT高效液相色谱系统检测HE-VLP纯度,并对该方法的专属性、线性、重复性、中间精密度、耐用性进行验证,确定检测限及定量限.应用建立的方法检测戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)疫苗原液以及纯化工艺过程中粗纯液、超滤液、超滤透过液、层析纯化液纯度;将蛋白原液与铝佐剂进行吸附制备疫苗半成品,应用建立的方法检测游离蛋白含量.结果 空白溶剂在设定的积分范围内无特异峰出现;样品浓度在50 ～ 500 μg/mL时,溶液浓度与吸收峰峰面积呈线性相关,相关系数R2=0.999;6次重复进样峰面积相对标准偏差(RSD)为0.47％;不同实验人员间隔7d对相同样品进行5次检测,RSD均小于2.0％;将样品浓度2 μg/mL,进样体积20 μL,即0.04 μg定为检测限,将样品浓度4μg/mL,进样体积20μL,即0.08 μg定为定量限;耐用性试验中,PBS浓度在0.05～0.001 mol/L范围内,保留时间RSD为0.89％,峰面积RSD为0.94％.该方法可在20 min内完成检测,原液纯度均不低于95％;随着蛋白纯化步骤的进行,纯度逐步显著提高;吸附完全性检测显示灵敏度较为理想.结论 建立的SEC-HPLC法各项指标均符合要求,可用于HE-VLP蛋白的纯度检测.
作者：吴清胜；李媛媛 刊期： 2018年第12期
B群链球菌(group B streptococcus,GBS)也称无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),是引发女性生殖道感染的重要原因之一,同时也引发胎膜早破、宫内感染等疾病,导致早产及晚期流产等,并可通过脐带或产道传染给新生儿,已成为新生儿感染的一个主要原因.根据荚膜多糖不同可分为10个血清型:Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ型.据新的研究报道,全球37个国家的73 791名孕妇中GBS的感染率平均为17.9％,非洲高为22.4％,美洲为19.7％,欧洲为19.0％,东南亚低为11.1％.全球由侵袭性GBS引起婴幼儿(0～ 89 d)的感染中,非洲地区高为1.21/1 000活产儿,东南亚低为0.02/1 000活产儿.尽管全球各国流行血清型分布有一定的差异,但主要引起GBS疾病的血清型分布也基本一致,主要为Ⅲ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ和Ⅴ五个血清型,可引起90％以上的婴幼儿侵袭性疾病.本文通过综述全球GBS流行病学及血清型的流行分布情况,为国内GBS候选疫苗的开发选型提供参考.
作者：陈玉秋；钱雯 刊期： 2018年第12期
目的 观察甲型肝炎灭活疫苗(L-A-1株)接种恒河猴的安全性和免疫原性.方法 将效价为640和1280 EL.U/mL两个剂量的甲型肝炎灭活疫苗(L-A-1株)与进口疫苗(1440 EL.U/mL)分别经后肢肌肉注射恒河猴,每组5只,首免后4周加强免疫1次.接种后每天观察动物接种局部有无红肿、硬结等异常反应;于免疫前、首免后1～ 10周定时采血,检测血清抗-甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗体和丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)水平;于初次免疫后第2天连续收集粪便1周,检测粪便中HAV含量;于免疫前及加强免疫后4周分别进行肝穿刺取肝组织,病理学检查.结果 接种疫苗后各组恒河猴均未见异常反应;血清ALT水平未见异常升高;于首免后2周抗-HAV抗体阳转率达100％,加强免疫后血清抗-HAV抗体几何平均滴度持续升高,均在首免后7周达到峰值,随后略有下降,9～10周抗体滴度又略升高,甲型肝炎灭活疫苗(640 EL.U/mL)组抗体滴度峰值略低于甲型肝炎灭活疫苗(1280 EL.U/mL)组和进口疫苗组,但差异无统计学意义(P＞0.05);恒河猴粪便中未检测到有HAV排出;肝组织未见病理学改变.结论 甲型肝炎灭活疫苗(L-A-1株)接种恒河猴具有良好的安全性和免疫原性.
作者：徐艳玲；岳立广；黄果勇；徐晓霞；夏青娟；潘海东；黄琴；刘令九 刊期： 2018年第12期
目的 真核表达牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gC结构蛋白,并对其反应原性进行鉴定.方法 以GenBank中登录的IBRV基因序列合成gC基因全长,构建重组真核表达质粒pCDNA4-gC-His,并进行双酶切鉴定.将鉴定正确的质粒转染MDBK细胞,收集上清,镍柱纯化带有His标签的重组gC蛋白,经Dot blot和间接免疫荧光法鉴定其反应原性.结果 质粒pCDNA4-gC-His经双酶切鉴定证明构建正确,表达的重组gC蛋白相对分子质量约54 000,纯化后的浓度为0.03 mg/mL,可与IBRV免疫的兔多抗发生反应.结论 成功构建了真核表达质粒pCDNA4-gC-His,并能在MDBK细胞系中正确表达,表达的蛋白与天然IBRV gC蛋白具有相同的反应原性,为后续免疫学诊断方法的建立奠定了基础.
作者：张帆；刘行波；倪宏波 刊期： 2018年第12期
渔用疫苗是防治鱼类养殖疾病有效的方法之一.其中,灭活疫苗是主要的商品化疫苗,其制备的关键为病原的有效灭活.正确的灭活方法不仅可使病原完全失去活性,还能不破坏抗原,从而制备高效疫苗.化学试剂灭活是常用的灭活方法.本文介绍了当前渔用疫苗中常见的灭活剂种类、特点、灭活机制、研究应用现状等,并对灭活剂的未来研究方向进行了展望.
作者：王璐瑶；李宁求 刊期： 2018年第12期
目的 分析2014年以来辽宁省流行的水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)基因型别,区分疫苗株与野毒株,为水痘防控奠定理论基础.方法 应用PCR法对VZV基因组第22个开放阅读框(open reading frame 22,ORF22)基因进行特异性扩增,并对PCR产物进行序列测定,结合单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)方法确定病毒的基因型别.扩增ORF38、ORF54、ORF62基因,测序后寻找目标片段中是否存在相应限制性酶切位点,以区分疫苗株与野毒株.结果 辽宁省2014～2018年共采集到68份临床诊断水痘病例的疱疹液样本,其中VZV-013-2015样本序列与DUMAS株一致,为Clade 1基因型,其余样本序列均为Clade 2基因型,与疫苗株Voka一致.辽宁省VZV分离株在69349位点Pst Ⅰ(+),95241位点Bgl Ⅰ(+),106262位点Sma Ⅰ(-).结论 Clade 2基因型为辽宁省VZV病毒流行优势基因型;辽宁省VZV均为野毒株感染.
作者：王艳；郝爽；王文思；侯春阳；方兴；姚文清 刊期： 2018年第12期
目的 评价改进抽提工艺制备的冻干甲型肝炎减毒活疫苗的稳定性.方法 采用改进抽提工艺及原抽提工艺分别制备3批冻干甲型肝炎减毒活疫苗,将疫苗于(5±3)和(25±2)℃放置不同时间,对疫苗的外观、水分、滴度及pH等指标进行检定.结果 两组疫苗在(5±3)和(25±2)℃保存不同时间后,外观均为白色疏松体,复溶后无异物;水分、滴度及pH差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 改进抽提工艺对该疫苗的稳定性无影响.
作者：李莉；侯丽娟；王拥军；王瑛辉；任广；杨利民；夏强；丛丹；常万柳；周延彬 刊期： 2018年第12期
目的 探讨白色念球菌对小鼠阴道内β-防御素-2表达的影响.方法 将白色念球菌按约500个/(0.5 mL·只)注入小鼠阴道,建立阴道感染模型,于建模0、24、48和72 h经尾部采血,检测白细胞数量;建模72 h将小鼠断颈处死,取其阴道组织,通过免疫荧光和Western blot检测β-防御素-2的表达.结果 随着感染时间的增加,小鼠血液中白细胞数显著增加(P＜0.05),小鼠阴道内β-防御素-2的表达水平显著增加(P＜0.05).结论 白色念球菌可显著提高小鼠阴道内β-防御素-2的表达,为β-防御素-2的进一步研究奠定了基础.
作者：毕小朵；杨轶男 刊期： 2018年第12期
目的 融合蛋白表达癌胚抗原(carcinoembroynic antigen,CEA)/CD16双特异纳米抗体,并对其进行纯化及鉴定.方法 将CEA/CD16基因克隆至pGEX4T1载体,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.表达蛋白GST-CEA/CD16经GST亲和层析分离纯化、TEV酶切及Ni-NTA和Q-Sepharose FF纯化,获得目的蛋白,并对目的蛋白进行活性分析.结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确.表达的融合蛋白相对分子质量约为58 000,主要以可溶性形式存在于菌体裂解上清中.融合蛋白经纯化后获得目的蛋白产率为5 mg/L,并具有介导NK细胞杀伤CEA阳性细胞的能力,且呈剂量依赖性.结论 成功表达了GST-CEA/CD16融合蛋白,纯化后表达产率较高,且具有较好的生物学活性,表明GST融合表达方式应用于双特异抗体具有可行性.
作者：董斌；王忠；骆阳；李庆；段涛；孟民杰；田素娟 刊期： 2018年第12期
目的 评价两种部位接种吸附无细胞百白破、灭活脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗(简称五联疫苗)的安全性.方法 上海市奉贤区各预防接种门诊采用逢单月经大腿前外侧肌接种,双月经上臂三角肌接种的原则,在受种者监护人知情同意下,收集2015年1月1日～2017年6月30日期间婴幼儿接种五联疫苗后的安全性相关资料,分析不同接种部位的不良反应发生情况.结果 共收集调查接种五联疫苗婴幼儿2 928人,接种7 243剂次,累计发生不良反应1 186人次,不良反应发生率为16.37％.大腿前外侧肌接种的不良反应发生率(10.80％)明显低于上臂三角肌(23.89％),且差异有统计学意义(P＜0.05),其中局部反应、全身反应的轻、中、重度症状发生率也均明显低于上臂三角肌(P＜0.05).两种不同部位接种第1剂次疫苗后不良反应的发生率均明显高于其他剂次(P＜0.05).结论 两种不同部位接种五联疫苗引起不良反应的发生率较低,均具有良好的安全性,大腿前外侧肌接种相对更安全,是五联疫苗的首选接种部位.
作者：李瑞平；胡斌；高彩红；俞辉红；沈群英；曹美芳；吴芳 刊期： 2018年第12期
狂犬病病毒(rabies virus,RABV)是传染性强、死亡率高、受到人们广泛关注的一种烈性病毒.狂犬病疫苗作为目前唯一能预防和控制狂犬病的制剂,其研发和生产日益成为热点.佐剂是能增强或改变抗原特异性免疫应答从而辅助疫苗发挥作用的物质.目前上市的狂犬病疫苗主要为铝佐剂疫苗及无佐剂疫苗,但上述两种疫苗均存在较大的局限性,在一定程度上影响了狂犬病疫苗的使用效果,因此本文在对RABV及其致病机理进行综述的基础上,对狂犬病疫苗佐剂进行探讨.
作者：赵祥月；普梦笛 刊期： 2018年第12期
目的 验证多糖样品中微量蛋白的Micro-BCA检测方法.方法 根据分析方法质量源于设计(the quality of analytical method is derived from design,AQbD)的开发流程,选择Micro-BCA法进行多糖微量蛋白含量的检测,并对方法的专属性、精密性及准确度进行验证,确定方法的检测限(detection limit,DL)及定量限(quantitative limit,QL).结果 多糖样品不影响该方法的检测,选择无机盐类纯化缓冲液,通过使标准品与样品的基质均一化,可消除基质效应,得到准确的检测效果.BSA浓度在10～40 μg/mL范围内线性良好,线性相关系数(R2)＞0.99;试验内及试验间检测结果的相对标准偏差(RSD)均＜3％;试验内及试验间回收率均在(100±5)％之间;重复3次检测DL均值为0.4 μg/mL,QL均值为1.1μg/mL.结论 多糖样品微量蛋白Micro-BCA检测方法的检测通量高,与工艺缓冲液兼容性好,且具有良好的精密性及准确度.
作者：何勇智；张涛 刊期： 2018年第12期
目的 初步建立明胶微球缓释系统冻干工艺,并检测其溶解和释放效果.方法 制备明胶微球,复溶后,分别加入终浓度0.5％蔗糖、0.5％葡萄糖及终浓度0.5％及0.25％明胶作为保护剂,进行冻干后,再分别加入100 mL蒸馏水复溶,比较复溶效果,筛选适保护剂;将小鼠分为冻干IFN明胶微球缓释系统组(IFN-FGMS组)、IFN明胶微球缓释系统组(IFN-GMS组)、IFN组,每组10只,分别经后肢肌肉注射,2.5×104 IU/(mL·只),每隔1h经眼眶静脉丛采血,连续27 h,分离血清,检测IFNα2b活性.结果 终浓度0.5％蔗糖及0.5％葡萄糖组可见不溶团块,终浓度0.5％明胶组微溶,0.25％明胶组明胶微球澄清透明,确定0.25％明胶为适冻干保护剂.IFN-FGMS组达峰时间Tmax分别为IFN-GMS和IFN组的1.5和3倍,血药峰浓度分别为IFN-GMS和IFN组的82.7％和62.8％,血药浓度半衰期为IFN-GMS和IFN组的1.6和5.4倍.结论 冻干微球缓释系统的缓释作用明显优于未冻干微球缓释系统.
作者：郝建丽；黄文宇；邱野；王晓波；付博 刊期： 2018年第12期
目的 利用组织芯片法对自制细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)单克隆抗体进行临床评价.方法 通过CK19抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选,免疫组化初筛获得CK19单克隆抗体细胞株.进一步制备腹水并纯化CK19抗体,对该抗体及商品化对照抗体进行组织芯片法评价.结果 经过细胞融合共筛出1株较好的杂交瘤细胞株2H5,纯化后的抗体纯度达95％,SDS-PAGE分析可见相对分子质量约55 000和25 000的重链和轻链条带,该抗体与对照抗体经组织芯片法评价,两者相关系数r=0.9947.结论 经组织芯片法评价,自制CK19单克隆抗体与对照抗体相比无明显差异,为后续开展大量临床组织研究提供了依据.
作者：闫敏；袁永；宋军营；曾华辉；张钟允；刘文弟；翟晋豫；张振强 刊期： 2018年第12期
目的 分析长春市2016年腹泻监测病例中诺如病毒(norovius,NV)分子流行病学特征.方法 收集2015年12月～2016年10月长春市3家监测点医院的腹泻病例粪便样本201份,采用Real-time PCR法检测,阳性样本进行核苷酸序列测定,选取GenBank数据库中同源性较接近的参考株,应用MEGA 6.0软件构建系统进化树.结果 201份粪便样本中,Real-time PCR检测NV阳性样本36份,阳性检出率为17.9％,均为GⅡ型;测序共获得28份结果,均为GⅡ型.系统进化树分析表明,28份样本中GⅡ.4型16份(57.1％),GⅡ.3型6份(21.4％),GⅡ.17型6份(21.4％).结论 2016年长春市存在多种NV基因型感染,GⅡ.4型略占优势.
作者：孙宇；乔凤娟；王昊；孙炳欣 刊期： 2018年第12期
扩展蛋白(expansins)又称为膨胀素,是来源于植物界普遍存在的一类可以使植物细胞壁松动的蛋白.当其作用于纤维素时,可以破坏纤维素链间氢键而使纤维素以非溶解方式(形态发生)降解,因而其在生物燃料生产的纤维素生物质转化中具有重要的潜在应用价值.本文对扩展蛋白的来源及分类,其结构与纤维素降解功能关系及其促纤维素降解作用的研究进展作一综述.
作者：由林鹭；张贺朋 刊期： 2018年第12期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
