杨会强;倪谦枝;刘杰;汪伟;孙艳;李玉华
目的 构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响.方法 以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-c-ski,经Pme Ⅰ线性化后,转化感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ线性化后,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,经扩增及纯化后测定病毒滴度.将纯化的重组腺病毒感染乳腺癌CAFs,采用Western blot法检测感染细胞中c-Ski蛋白的表达水平;MTT法和细胞计数法检测重组腺病毒对CAFs细胞增殖活力的影响.结果 重组腺病毒质粒经Pac Ⅰ酶切鉴定证明构建正确;转染HEK-293细胞48 h后可见大量绿色荧光蛋白的表达,纯化的重组腺病毒的滴度为3.11×1010IFU/ml;感染重组腺病毒的乳腺癌CAFs中c-Ski蛋白的表达水平明显高于空病毒组和空白对照组(P<0.001),且增殖活力明显高于空白对照组(P<0.05).结论 成功构建了表达c-ski基因的重组腺病毒质粒,其可明显促进CAFs的增殖,为进一步研究c-Ski对CAFs增殖分化等生物学功能的影响及作用机制提供了实验依据.
作者:王黎阳;赵浏阳;彭琼乐;孙艳;柳满然 刊期: 2013年第12期
目的 采用DoE设计方法对人可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(soluble tumour necrosis factor αreceptors Ⅰ,sTNFα-RⅠ)的聚乙二醇(PEG)修饰工艺参数进行优化,以期获得稳定、可控的工艺参数.方法 采用UNICORN(DoE)软件中Central Composite Face Centered(CCF)模型对sTNFα-RⅠ的3个PEG修饰工艺参数,即溶液pH值(pH)、反应时间(Time)和PEG与蛋白质量比(PEGrate)进行优化,设置4个响应值(多PEG修饰蛋白峰面积、单PEG修饰蛋白峰面积、未修饰蛋白峰面积及单PEG修饰蛋白峰面积与多PEG修饰蛋白峰面积比值)揭示其化学反应过程,确定参数操作空间;应用蒙特-卡罗模拟法(Monte-Carlo Simulation)对优化参数进行风险评估.结果 3因子17组试验结果的重复性较好,中心点重复组响应值介于低值和高值之间,且随机分布,符合DoE试验设计的要求;4个响应值所对应的回归系数(R2)均>0.75,预测准确性(Q2)>0.5,模型有效性(Model Validity)>0.25,重复性(Reproducibility)>0.5,模型预测与实验值之间偏差较小,具有可靠的预测准确性;17组试验结果标准残差在允许范围(-4~4)之间,线性较好,预测值与观测值之间相关性较好,建立的模型拟合度高,可较为准确地预测试验结果.溶液pH值对多PEG修饰产量影响较小,随着Time和PEGrate的升高,多PEG修饰产物增加,单PEG修饰产物经二次或多次修饰形成多PEG修饰产物,减少Time和PEG用量可减少多PEG修饰产物;单PEG修饰产物随着pH上升,产量有所增加,与Time呈二次项关系,在Time· PEGrate交互作用中,减少PEG用量可增加单PEG修饰产物量;减少Time和降低PEG用量可提高单PEG修饰产物与多PEG修饰产物的比值,有利于下游纯化.确定了工艺参数的操作空间,当pH为5.5时,反应时间控制在30 h以上,PEG与蛋白质量比控制在3.7以下,符合预设值;pH在6.5时,反应时间控制在22~35 h之间,PEG与蛋白质量比控制在2.5 ~4.0之间,符合预设值;蒙特-卡罗模拟法对在佳操作参数(反应时间34.1h,溶液pH值6.5,PEG与蛋白质量比2.5)时模型预测的响应值(单PEG修饰产物峰面积值5 635.82和单PEG修饰产物与多PEG修饰产物比值3.226 5)的风险评估,10万次模拟试验可信度分别为99.825%和99.982%,试验风险较小,工艺可控.结论 确定了sTNFd-R Ⅰ蛋白PEG修饰稳健的工艺参数.
作者:王保成;蔡峰;李坤;李春阳;张珂;秦娇荣 刊期: 2013年第12期
目的 探讨过表达脑红蛋白(neuroglobin,NGB)对水溶性β-淀粉样蛋白片段1-42(beta-amyloid l-42,Aβ1-42)诱导的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用及其机制.方法 将质粒pEGFP-NGB转染经Aβ1-42诱导损伤的SH-SY5Y细胞,MTT法检测NGB对损伤细胞存活率的影响;JC-1染色法检测NGB对损伤细胞线粒体膜电位的影响;免疫细胞化学法及Western blot法分别检测损伤细胞中细胞色素C(cytochrome C,cytoC)和caspase-3、caspase-9的表达水平.结果 过表达NGB可明显提高Aβ1-42诱导损伤的SH-SY5Y细胞的存活率(P<0.05),抑制损伤细胞线粒体膜电位的降低(P<0.01),使损伤细胞内cytoC和caspase-3、caspase-9蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05).结论 NGB可通过抑制与细胞凋亡密切相关的cytoC、caspase-3和caspase-9等蛋白的表达而发挥其神经保护作用.本实验为阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的治疗提供了实验依据.
作者:张雄;孙洁芸;高敏娜;李昱 刊期: 2013年第12期
目的 探讨不同种类与剂量乙型肝炎疫苗在青年中的免疫效果及安全性.方法 在江西省上饶市卫生学校抽取乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阴性、健康状况良好的15~20岁学生910名,随机分为A、B、C3组,按照0、1、6月免疫程序,分别经上臂外侧三角肌全程接种3针10 μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)、20 μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)和10 μg/ml重组乙型肝炎疫苗(酵母),全程免疫后1个月采集接种者静脉血,分离血清,采用放射免疫法检测抗-HBs水平,并进行安全性观察.结果 全程免疫后1个月,A组与C组抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和分布相近,差异均无统计学意义(P>0.05);B组的抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和≥500 mIU/ml的分布均明显高于A组和C组(P均<0.01),抗-HBs GMC< 10和10~ 499 mlU/ml的分布显著低于A组和C组(P<0.01或<0.001).有1名接种者在接种后0.5h有局部疼痛症状,第2天疼痛消失,未见其他局部及全身不良反应.结论 接种高剂量乙肝疫苗的抗-HBs阳转率和抗-HBs GMC水平均高于低剂量乙肝疫苗,提示青年应接种高剂量乙肝疫苗,以建立有效的防御乙肝的免疫屏障.
作者:郑俐敏;黄素玲;孙志坚 刊期: 2013年第12期
目的 探讨癌基因c-myc对食管癌有丝分裂检查点效应蛋白BubR1的调控作用.方法 将Bub1b基因启动子亚克隆至载体pSEAP2-Basic中,构建重组质粒pSEAP2-Bub1b-P2000,在Lipofectamine 2000的介导下,分别转染过表达c-myc的HEK-293细胞(经Ad-c-myc感染)和ECA-109细胞;转染6h后,经c-myc抑制剂10058-F4作用ECA-109细胞.SEAP化学发光法检测各组细胞的ALP活性;采用RT-PCR和Western blot法分别检测抑制c-myc表达的ECA-109细胞中Bub1b基因mRNA转录和BubR1蛋白的表达水平.结果 重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定构建正确;重组质粒转染过表达c-myc的HEK-293细胞和抑制c-myc表达ECA-109细胞的ALP活性明显升高(P<0.000 1);抑制c-myc表达可明显下调ECA-109细胞中Bub1b基因mRNA转录和BubR1蛋白的表达水平(P<0.05).结论 癌基因c-myc对食管癌细胞中BubR1的表达有正调控作用,为进一步研究BubR1在食管癌中发挥的作用奠定了基础.
作者:宋培培;胡敏;湛晓琴;章帆;施琼;翁亚光 刊期: 2013年第12期
目的 制备抗甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY),并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量.方法 用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAVIgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性.以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较.结果 亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78%;效价高为1∶16000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71 (enterovirus 71,EV71)均不反应;纯化的抗HAV IgY在25~ 70℃条件下处理15 min及经pH 3.0~ 10.0的Tris-HCL缓冲液处理2h,其抗体效价基本无影响.建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62~2 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7.结论 制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量.
作者:夏青娟;李树林;孟凡东;赵淑杰;徐晓霞;惠琪;刘令九 刊期: 2013年第12期
目的 采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析重组酿酒酵母表达的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结构性状.方法 采用HPLC法,分别以磷酸盐缓冲液和含去垢剂SDS的磷酸盐缓冲液为流动相,分析3批重组酿酒酵母表达的纯化HBsAg VLP的出峰规律.结果 3批纯化的HBsAg样品在不含SDS的流动相条件下,均只在(15.39±0.01) min处出现单一的相对分子质量2 000 000的HBsAg VLP峰,峰面积积分百分含量为(100.00±0.0)%.3批纯化的HBsAg样品在含SDS的流动相条件下,在(15.07±0.02) min处出现相对分子质量2 000 000的HBsAg VLP峰,峰面积积分百分含量为(55.07±0.05)%;在(28.62±0.04) min处出现1个相对分子质量24 000的P24亚基多肽峰,峰面积积分百分含量为(44.93±0.04)%.结论 HBsAg在常规保存条件下为P24亚基通过非共价键或(和)共价键聚合形成的相对分子质量为2 000 000的大分子蛋白颗粒,在含SDS的条件下,HBsAg颗粒可部分解聚为P24亚基.
作者:孙玉杰;马锐;马晓宇;刘旭;王瑜;盛玉博;王辉;黄浩;陈兴 刊期: 2013年第12期
目的 采用层析法纯化C群脑膜炎球菌多糖,以替代冷酚抽提法,并对制备的多糖蛋白结合物进行初步安全性和免疫原性评价.方法 采用温和的表面活性剂去氧胆酸钠对C群脑膜炎球菌多糖进行前处理,并用Capto adhere 和Capto DEAE阴离子交换凝胶柱串联,对多糖进行柱层析纯化,再通过脱盐去除残留的去氧胆酸钠,获得精制多糖.对缓冲液中的去氧胆酸钠浓度、缓冲液pH值、样品的前处理时间及离子交换流速进行优化,并对建立的层析纯化工艺进行放大,纯化3批多糖,按照《中国药典》三部(2010版)要求检测各项质控指标,并通过核磁共振-氢谱检测纯化后的多糖结构.将层析法和苯酚法纯化的多糖分别与破伤风类毒素结合,制备多糖蛋白结合物,对结合物进行异常毒性、小鼠急性毒性试验和免疫原性检测.结果 经优化,确定缓冲液的去氧胆酸钠浓度为1.0%,pH值为8.0,样品前处理时间为6h,离子交换流速为2.0ml/min.放大工艺制备的3批C群脑膜炎球菌多糖各项检测指标均合格,多糖回收率均大于70%,明显高于苯酚法制备的多糖.核磁共振-氢谱显示,层析法与苯酚法纯化的多糖主要峰基本一致,层析法未改变多糖结构.层析法纯化的多糖制备的多糖蛋白结合物异常毒性试验合格,小鼠急性毒性试验结果与苯酚法纯化多糖制备的多糖蛋白结合物比较,差异无统计学意义(P>0.05),免疫小鼠后均具有良好的免疫原性.结论 层析法分离杂蛋白操作简便,省时省力,工艺易于放大,且减少了对环境的污染,可替代苯酚抽提法用于C群脑膜炎球菌多糖的纯化.
作者:王雪薇;刘钰;陈敬;焦小玲;王平;张燕斌;林海涛;刘梅影 刊期: 2013年第12期
目的 建立检测白喉毒素突变体CRM197细菌内毒素(bacterial endotoxin)含量的动态显色法(kinetic chromogenic assay,KCA).方法 按照《中国药典》三部(2010版)要求,用细菌内毒素检查用水(bacterial endotoxin,BET)稀释细菌内毒素工作标准品制备细菌内毒素标准曲线系列溶液,各浓度均设3个平行孔,分别与动态显色鲎试剂(kinetic chromogenic analysis tachypleus amebocyte lysate,KCA TAL)反应,绘制标准曲线,验证标准曲线的可靠性,确定佳线性范围、测定范围及低检测限(limit of quantitation,LOQ),验证方法的精密性和准确性,并进行初步应用.结果 标准曲线的回归方程为:y=-0.263x+2.741,R2=0.997,相关系数的绝对值|r|≥0.980,阴性对照的反应时间大于标准曲线低点的反应时间,各复孔的变异系数(CV)<10%;内毒素浓度在0.02~2.50EU/ml时,线性关系良好,LOQ为0.02 EU/ml;3个浓度(2.50、0.50、0.02 EU/ml)标准内毒素检测结果的CV均<5%,加入高、中、低3个浓度(2.50、0.50、0.02 EU/ml)标准内毒素的3批供试品检测结果的CV均<10%,回收率在95% ~ 143%之间;采用建立的方法检测10批次CRM197样品的细菌内毒素含量,回收率在77%~118%之间,其中8批样品的内毒素含量合格.结论 动态显色法检测CRM197中内毒素的含量精密性和准确性良好,能快速、定量检测样品中的内毒素含量,抗干扰能力强,可用于CRM197研制过程中的质量控制.
作者:邓杰;张珂;袁涛;李春阳 刊期: 2013年第12期
哮喘是仅次于癌症的世界第二大致死、致残疾病,造成的经济负担超过结核病和艾滋病的总和.严重的哮喘目前尚不能治愈,迫切需要新的有效的疾病干预手段.临床研究显示,白细胞介素-13 (inteffeukin-13,IL-13)与哮喘密切相关,动物模型研究也表明,IL-13在哮喘病理机制中处于核心位置.目前,IL-13单克隆抗体治疗哮喘在国外已处于Ⅱ期临床试验,以疫苗形式诱导持续的IL-13中和抗体,对哮喘这样的慢性疾病而言较之单抗更具应用潜能.本文对抗IL-13疫苗治疗哮喘的研究进展作一综述.
作者:唐增华 刊期: 2013年第12期
目的 建立重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准.方法 分别采用分子筛高效液相色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SE-HPLC)、反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)和还原毛细管电泳(reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate,rCE-SDS) 测定3批重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白成品的纯度;采用AlphaScreen组氨酸检测试剂盒进行重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白受体配体结合试验测定效价;采用ELISA法进行鉴别试验;蛋白含量、pH值、渗透压摩尔浓度、Tween-20、不溶性微粒、外观、澄清度、生物学活性、水分、内毒素、无菌试验、异常毒性、渗透压等项目的检测按《中国药典》三部(2010版)规定进行.结果 SE-HPLC、RP-HPLC及rCE-SDS测定3批供试品的纯度分别为>98%、>80%和>99%;重组抗血管生成素肽-Fc融合蛋白对血管生成素(angiopoietin,Ang)与酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains,Tie)结合的抑制作用呈剂量依赖性,3批供试品与标准品的剂量反应曲线相同,呈典型的倒S型,R2均>0.98,结合效价均在平均值的正负25%区间内;3批供试品的S/N值均>1.60;其他项目检测结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定.结论 建立的质控方法具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定.
作者:范文红;韩春梅;李响;毕华;丁有学;刘兰;饶春明;王军志 刊期: 2013年第12期
氨基酸分析是蛋白质一级结构分析的有力工具,氨基酸分析在重组蛋白类生物制品的质量控制中发挥着重要作用,其应用主要包括:氨基酸含量及组成分析、蛋白精确定量及消光系数计算,为重组蛋白的结构确证及功能研究提供依据.本文就氨基酸分析在重组蛋白类生物制品质量控制中的应用作一综述.
作者:毕华;史新昌;饶春明 刊期: 2013年第12期
目的 比较不同截留分子量超滤膜包浓缩狂犬病病毒(rabies virus,RV)的效果.方法 将RV固定毒3aG-V株按0.01 MOI比例接种至Vero细胞中,制备RV原液,分别用截留分子量100 KD和300 KD的膜包超滤浓缩60倍,B-丙内酯灭活后,验证病毒液浓缩过程膜下液的病毒灭活效果;采用Sepharose 4FF凝胶层析纯化灭活的病毒浓缩液,Lowry法测定病毒浓缩液和纯化液中的蛋白质含量;酶联免疫法测定病毒浓缩过程膜下液、浓缩液和纯化液中的RV抗原含量.结果 100 KD和300 KD的超滤膜包均能有效截流RV,3次试验膜下液RV抗原含量均为0 IU/ml,观察期内小鼠均健存.300 KD膜包超滤的浓缩液和纯化液比100 KD超滤膜包超滤的浓缩液和纯化液中杂蛋白含量低,抗原含量高.结论 截留分子量300 KD的膜包比100 KD的膜包更适用于RV的浓缩.
作者:赵永强;杨丽;白春杰;刘瑞 刊期: 2013年第12期
杆状病毒-昆虫细胞表达系统是生物领域四大表达系统之一.近年,随着Cervarix(R)、Provenge(R)和FluBlok(R)的批准上市,杆状病毒-昆虫细胞表达系统的发展也取得了里程碑式的重大突破.同时,随着技术的快速发展,杆状病毒-昆虫细胞技术平台在疫苗研发和生产中的应用日益广泛而深入.本文拟对杆状病毒-昆虫细胞技术的起源、发展及其在人用重组蛋白疫苗生产中的应用作一综述.
作者:王伟善;吴浩飞 刊期: 2013年第12期
目的 原核表达、纯化猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),并检测其生物学活性.方法 以提取的猪外周血淋巴细胞基因组RNA为模板,PCR扩增猪IL-2基因,插入原核表达载体pBV220,构建重组表达质粒pBV220/IL-2.将重组表达质粒转化感受态大肠埃希菌DH5α,经含Amp的LB平板筛选后,将重组菌于LB培养液中培养,分别于不同培养时间进行活菌计数,绘制重组菌的生长曲线;42℃诱导表达重组蛋白,经尿素纯化后,采用CTLL细胞/MTT比色法检测其生物学活性.结果 重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;重组菌的佳开始诱导时间为重组菌发酵培养10 h;重组蛋白相对分子质量约17 400,表达量占菌体总蛋白的19%,纯化后纯度达95%;重组蛋白的生物学活性可达3×105 IU/ml.结论 原核表达并纯化了具有生物学活性的重组猪IL-2蛋白,为其进一步研究和产业化生产奠定了基础.
作者:李凤华;朱战波;江国托 刊期: 2013年第12期
目的 采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定钩端螺旋体疫苗中的苯酚含量.方法 色谱条件:色谱柱:Novo-Pak C-18层析柱(3.9mm× 150mm,4μm),流动相:甲醇-超纯水(40∶60,v∶v),流速:1.0 ml/min,检测波长:270 nm,柱温:30℃,进样量:10μl.对建立的方法进行线性范围、精密性、重现性、准确性验证及初步应用.结果 苯酚浓度在18.552 ~ 129.864 μg/ml范围内,色谱峰面积与苯酚浓度呈良好的线性关系(r=0.999 7);苯酚对照品溶液连续进样6次,主峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.25%,保留时间的RSD为0.10%;用建立的方法检测6份钩端螺旋体疫苗样品中苯酚含量的RSD为0.5%;准确性试验的总平均回收率为100.6%,RSD为1.0%; HPLC法和溴量滴定法测定4批钩端螺旋体疫苗样品中苯酚含量的结果基本一致.结论 HPLC法可以更准确地测定苯酚含量,且该方法操作简便、快速,精密性高,重现性好,无干扰,适用于钩端螺旋体疫苗成品中苯酚含量的检测.
作者:张瑾;王瑾;杨英超;张影;薄淑英;王国柱;辛晓芳 刊期: 2013年第12期
目的 评价国产第四代HIV血液筛查试剂的质量.方法 利用HIV-1 p24抗原国家参考品和HIV抗体国家参考品,对2012年3月~2013年3月间7个厂家(A~G)生产的33批第四代HIV血液筛查试剂进行评价.分析A(进口)、B、C试剂对HIV-1 p24抗原弱阳性国家参考品P5检测的S/CO值的变化趋势,及其对HIV-1 p24抗原弱阳性国家参考品P5、强阳性HIV-2型抗体国家参考品18号和中等强度阳性HIV-2型抗体国家参考品19号检测的批间变异系数,计算不同试剂的低检出量理论值.结果 各试剂均符合国家参考品的要求,除A(进口)和C试剂外均有非特异阳性出现.国内、外试剂检测结果均较稳定,未见超过±3 SD的异常结果.P5、18号、19号参考品的批间变异系数均不高于25%,A(进口)试剂的批间精密性优于国产同类试剂.p24抗原参考品低检出量均值为3.2 IU/ml.82%(27/33)试剂优于HIV-1 p24抗原低检出量国家标准要求,70%(23/33)的试剂优于HIV抗体低检出量国家标准要求.结论 2012年3月~ 2013年3月期间国产第四代HIV血液筛查试剂均符合国家现行标准,但与进口试剂相比,国产第四代HIV血液筛查试剂在低检出量和批间精密性上尚有提高的空间.
作者:宋爱京;许四宏;李秀华;聂建辉;赵晨燕;刘强;黄维金;王佑春 刊期: 2013年第12期
目的 采用多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留DNA.方法 采用滤芯(滤板)澄清、鱼精蛋白处理、核酸酶处理、Sepharose 4FF层析纯化或澄清、核酸酶、Sepharose 4FF层析纯化结合的方法去除Vero细胞培养的狂犬病病毒液中的Vero细胞DNA,检测Vero细胞DNA残留量、抗原含量、核酸酶残留量及疫苗效价.结果 0.45 μm UB玻璃纤维澄清病毒液,抗原损失率较小;鱼精蛋白去除Vero细胞DNA,抗原损失量较大;核酸酶处理后,病毒液中Vero细胞DNA残留量仍高于1 ng/ml;经Sepharose 4FF层析纯化,能有效去除浓缩后经核酸酶处理的病毒液中的核酸酶及一定量的Vero细胞DNA;采用多种方法结合去除病毒液中Vero细胞残留DNA,DNA残留量<100 pg/ml,疫苗效价≥4.0 IU/ml,均达到《中国药典》三部(2010版)要求.结论 多种方法结合能有效去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量,且疫苗效力达到《中国药典》三部(2010版)要求.
作者:刘杰;刘辉;杨会强;康庄;孙艳;毛川成;何敏;李玉华 刊期: 2013年第12期
目的 建立猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用.方法 根据GenBank中登录的PPV NADL-2株序列,针对VP2区设计引物,以提取的PPV核酸为模板,进行荧光定量PCR扩增;优化反应体系及反应条件,并进行专属性、重复性和敏感性验证.用建立的荧光定量PCR法检测辛酸沉淀及L、P、S公司生产的纳米膜过滤器去除制品中PPV的效果.结果 优化后的荧光定量PCR反应体系:Eva Green预混液7.5μl,上下游引物各0.5μl,模板DNA 1μl,补加dH2O至15 μl;反应条件:95 ℃ 3 min,95℃10s和60℃10s,共40个循环;模板浓度的对数值与循环数的相关性较好(R2=0.999),扩增效率为102.5%.该方法可特异性扩增PPV,而对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、牛细小病毒(bovine parvovirus,BPV)、鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)及猪肾细胞PK-15无扩增反应;试验内CV为0.79%~2.81%,试验间CV为1.23% ~2.21%,均<5%,低检测限为102 copies/μl.辛酸沉淀可使样品中PPV浓度下降5 Logs;不同公司生产的20 nm膜滤器过滤量及过滤效果均有明显差异,其中S公司生产的滤器效果好,可使样品中的PPV滴度下降4Logs.结论 已成功建立了PPV荧光定量PCR检测方法,为快速、准确的检测病毒去除工艺对PPV的去除效果奠定了基础.
作者:郑朝共;许锬;容新宗;黄琰 刊期: 2013年第12期
目的 探讨肺炎链球菌减毒活菌疫苗候选菌株R6的安全性及保护效果.方法 将不同剂量的R6和强毒力菌株D39分别经鼻腔感染BALB/c小鼠,通过小鼠毒力试验、定植试验和肺部组织形态观察,评价R6的安全性.将1.0×108 cfu的R6菌株与CT佐剂混合后,经黏膜免疫BALB/c小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清中IgG亚型及细胞因子,通过主动、被动保护试验及免疫小鼠体内定植试验,观察R6对免疫小鼠的保护效果.结果 不同剂量的R6鼻腔攻毒后,小鼠存活率为100%,显著高于D39阳性对照组(P<0.001),心脏血和脑匀浆标本未见细菌生长,鼻腔灌洗液和肺匀浆中的菌量均显著低于D39阳性对照组(P<0.01),肺部炎症反应较轻,且较快恢复正常.R6菌株与CT佐剂混合后经黏膜免疫的小鼠可产生以IgG1和IgG2b亚型为主的高效价血清IgG,且特异性的细胞因子IL-4、IL-10和IL-17A水平明显升高;可主动保护60%的小鼠抵抗D39的感染,明显高于市售23价肺炎链球菌疫苗(44%),但免疫血清不具有被动保护作用;免疫R6的小鼠可明显减少19F菌株在其呼吸系统的定植.结论 肺炎链球菌减毒活疫苗候选菌株R6具有良好的安全性和保护效果,为该疫苗的研发提供了实验依据.
作者:王一平;徐绣宇;王虹;尹一兵;孟江萍 刊期: 2013年第12期