龙方懿；印国兵；刘智敏；吴婷婷；贾朝莉；杨俊艳；刘小花
目的 探讨TPX2基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 构建3个靶向TPX2基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒,转染A549细胞,RT-PCR检测TPX2基因mRNA的转录水平;筛选干扰效果佳的质粒转染的细胞,RT-PCR检测增殖相关基因CDK4和CyclingD1 mRNA的转录水平,Western blot检测TPX2蛋白的表达水平,显微镜下观察细胞的生长情况,MTT法检测细胞的增殖活力.结果 TPX2 shRNA-3质粒干扰效果佳,有效沉默TPX2基因后,A549细胞中TPX2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均受到明显抑制(P＜0.01),与空白对照组比较,抑制率分别为73.8％和82.8％;CDK4和CyclingD1基因mRNA的转录水平也明显降低(P＜0.01或＜0.05),与空白对照组比较,抑制率分别为76.7％和67.3％;A549细胞的生长和增殖也明显受到抑制,转染后72 h,增殖抑制率可达61.55％(P＜0.05).结论 成功构建了靶向TPX2基因的shRNA表达质粒,其在mRNA和蛋白水平有效抑制A549细胞TPX2基因的表达后,细胞生长受到抑制,增殖能力减弱.
作者：唐熹；张徽；刘莹 刊期： 2012年第07期
目的 筛选产磷脂酶A1(Phospholipase A1,PLA1,EC3.1.1.32)的菌株,并优化其发酵条件.方法 从富油土壤中筛选产PLA1的菌株,并对PLA1活力高的菌株进行分子生物学鉴定及发酵条件的优化.结果 筛选出的5个菌株中Dx208菌株PLA1活力高,摇瓶发酵酶活力达4.52 U/ml.根据该菌株的形态特征分析和16SrDNA基因序列,初步鉴定其为链霉菌属(Streptomyces)的灰色链霉菌(Streptomyces griseus).该菌株的佳发酵条件为:初始pH7.0,培养温度30℃,发酵时间5d,摇床转速200r/min,发酵液中PLA1活力可达7.15 U/ml,为优化前的1.58倍.结论 已筛选出1株高产PLA1的菌株,并优化了其发酵条件,为PLA1的生产及应用奠定了基础.
作者：赵梦梦；薛正莲；苏燕南；赵世光；陈涛 刊期： 2012年第07期
目的 探讨低氧对分化型甲状腺癌KAT、WRO细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenehymal transition,EMT)的影响.方法 以氯化钴(CoCl2)模拟细胞低氧微环境,采用MTT法检测细胞的增殖活力,筛选CoCl2的适作用浓度;倒置显微镜观察低氧下细胞的形态特征;Western blot检测低氧0、3、6、12h后KAT和WRO细胞中HIF-1a蛋白的表达及低氧6h后KAT和WRO细胞上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和间质细胞波形蛋白(Vimentin)的表达.结果 CoCl2适作用浓度为150 μmol/L,低氧使KAT和WRO细胞逐渐获得了间质细胞的形态特征.低氧6h后,KAT和WRO细胞中HIF-1a蛋白的表达达峰值,与低氧0h组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).低氧组KAT细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显低于正常组(P＜0.01),Vimentin蛋白的表达水平与正常组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);低氧组WRO细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显低于正常组(P＜0.oi),Vimentin蛋白的表达水平明显高于正常组(P＜0.01).结论 HIF-1a可能通过下调E-cadherin、上调Vimentin而促进分化型甲状腺癌细胞KAT和WRO发生上皮间质转化,使其获得侵袭、转移潜能.
作者：贾朝莉；刘智敏；曾得康；杨俊艳；龙方懿；刘小花 刊期： 2012年第07期
Exosomes是一种由活细胞分泌到细胞外的膜性小囊泡,来源于多囊体,大小为50-100nm.Exosomes表面有大量与其结构和功能密切相关的蛋白质和脂质成分,多种细胞均可分泌Exosomes.Exosomes具有多种重要功能,尤其对肿瘤的免疫治疗具有重要作用.树突细胞和肿瘤细胞来源的Exosomes在肿瘤免疫治疗方面具有良好的治疗效果,已成为近年来肿瘤学研究的一个热点.本文对Exosomes的生物起源、生物学特性、生理功能及其在肿瘤诊断和免疫中的作用机制作一综述.
作者：冯业童；刘朋飞 刊期： 2012年第07期
目的 建立一种以丙酮酸氧化酶法为反应原理的丙氨酸氨基转移酶( Alanine aminotransferase,ALT)干化学检测方法,并制备试纸条.方法 试纸条由扩散层、底物层和显色层组成,包被有反应试剂,用反射式光度计测定ALT活性.对制备的试纸条进行各项验证.结果 试纸条测定罗氏低、高值质控品的批内变异系数分别为7.4％和4.9％;线性范围为10～1000U/L;试纸条测定肝素锂抗凝全血及其血浆的结果差异无统计学意义(P＞0.05);标本中胆红素≤257 mol/L,抗坏血酸≤50 mg/L,丙酮酸≤0.5 mmol/L时,ALT测定结果不受影响;建立的干化学法与国际临床化学联合会(IFCC)推荐的方法相关性良好(r＝0.988 9);试纸条的95％置信区间参考范围为0～40U/L.结论 建立的于化学法反应迅速,结果准确,操作简便,适用于ALT的即时检验.
作者：田漪；陈汉艳；王缦 刊期： 2012年第07期
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在蚕蛹中高效表达狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)糖(G)蛋白.方法 从狂犬病病毒CVS-11株总RNA中扩增G基因片段,插入供体质粒pFastBac I-G中,构建重组供体质粒pFastBac I-G,转化大肠杆菌DH 10Bac,构建重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-G,将其转染BmN细胞,获得含G基因的重组杆状病毒.将重组病毒感染蚕蛹,收集血淋巴,进行Western blot分析.结果 重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-G经PCR鉴定证明构建正确;狂犬病病毒糖蛋白在重组杆状病毒感染的BmN细胞中和蚕蛹中获得正确表达,在蚕蛹中表达的重组蛋白可与His标记的单克隆抗体和狂犬病病毒阳性血清特异性结合.结论 成功构建了重组狂犬病病毒糖蛋白杆状病毒,并在蚕蛹中获得了表达,表达产物具有良好的抗原性.
作者：赵丽丽；孙伟洋；冯昊；胡桂秋；李岭；李露；郭鹤；赵平森；王化磊；杨松涛；夏咸柱 刊期： 2012年第07期
目的 检测人卵巢癌组织中前胸腺素α(Prothymosin α,PTMA)的表达、分布,并分析其与肿瘤分级的相关性.方法 利用卵巢癌组织微阵列,从2块巢癌组织标本和1块癌旁正常组织标本中共获取172份卵巢癌组织和8份癌旁正常组织,对每份肿瘤组织进行病理分级和确定组织类型.采用Western blot法检测卵巢癌和癌旁正常组织中PTMA蛋白的表达水平;免疫组化法检测卵巢癌组织中PTMA蛋白表达的分布.结果 172份卵巢癌组织标本中,病理分级I级22份,Ⅱ级67份,Ⅲ级83份,除4份为子宫内膜腺癌外(均为Ⅱ级),其余均为乳头状腺癌.癌旁正常组织中PTMA的表达量明显低于卵巢癌组织,且差异有统计学意义(P＜0.01).8份癌旁正常组织标本中,5份(62.5％)细胞核染色阳性,多出现在卵巢上皮细胞中,3份染色阴性;172份卵巢癌组织标本中,164份(95.3％)为阳性表达,其中细胞核表达44份,细胞质表达40份,混合表达80份;肿瘤分级与PTMA的分布明显相关(P＜0.01),卵巢癌Ⅲ级多为混合型分布;卵巢癌I级PTMA蛋白的表达水平明显高于卵巢癌Ⅱ、Ⅲ级,且差异有统计学意义(P＜0.01).结论 与癌旁正常组织相比,卵巢癌组织中PTMA蛋白的表达增强,在不同分级的肿瘤组织中,PTMA蛋白的表达分布有变化,为进一步研究其在卵巢癌组织中异常表达的临床意义奠定了基础.
作者：张卓梅；何飞 刊期： 2012年第07期
目的 克隆鲍曼不动杆菌blaNDM-1基因,对NDM-1进行生物信息学分析,表达并纯化重组NDM-1蛋白.方法 PCR扩增鲍曼不动杆菌NDM-1的blaNDM-1基因,克隆至pMAL-p2X质粒,构建重组原核表达质粒pMAL-p2X::NDM-1,对NDM-1进行生物信息学分析.将重组表达质粒转化大肠杆菌Tb1,IPTG诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白MBP-NDM-1.结果 重组表达质粒pMAL-p2X::NDM-1经双酶切和测序证实构建正确;生物信息学分析表明,NDM-1的相对分子质量为28 487.86,等电点为5.89,1～28氨基酸为NDM-1的信号肽序列,与其他亚型金属β-内酰胺酶同源性很低;表达的重组蛋白相对分子质量约73000,主要以可溶形式表达;纯化后的重组蛋白浓度为1.72mg/ml.结论 表达并纯化了可溶性重组蛋白MBP-NDM-1,为后续NDM-1活性功能及其抑制剂的研究奠定了基础.
作者：夏力亮；孙洋；张瑞；陈硕；邱少富；王中强；柳楠；刘军；祝令伟；纪雪；宋宏斌；冯书章 刊期： 2012年第07期
目的 探讨p16基因对骨肉瘤U-2OS细胞的抑制效应.方法 将p16基因真核表达质粒pcDNA3-HA-p 16和pcDNA3-HA质粒分别转染U-2OS细胞,并设未转染阴性对照组,采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,PI单染法分析细胞周期的分布,DNA ladder法结合PI单染法检测细胞的凋亡情况.结果 p16基因可显著抑制U-2OS细胞的增殖(P＜0.05),且在一定范围内呈剂量效应关系;p16基因可使U-2OS细胞G1期比例显著升高(P＜0.05),S期比例显著降低(P＜0.05);p16基因可使U-2OS细胞凋亡率明显上升(P＜0.05),细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳后呈典型的DNA ladder.结论 p16基因可显著抑制U-2OS细胞增殖,使细胞阻滞于G1期,并促进细胞凋亡.
作者：夏羿凡；余娴；冯丽；袁斌 刊期： 2012年第07期
目的 分析含RGD序列的多肽ERC(N5)与整合素αvβ3结合的能力,并探讨其对肝癌HepG2细胞增殖与凋亡的影响.方法 利用流式细胞术检测HepG2细胞表面整合素αvβ3的含量以及ERC(N5)与FITC-αvβ3抗体LM609竞争结合HepG2细胞的情况;用ERC(N5)处理HepG2细胞,CCK-8法检测细胞增殖活力,光学显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞凋亡率.结果 HepG2细胞表面αvβ3的含为47.0％;浓度为8、16、32和64 μmol/L的ERC(N5)均能抑制LM609与HepG2细胞的结合及细胞的增殖活力,且呈剂量依赖性(P＜0.05);与对照组相比,经16 μmol/L ERC(N5)处理的细胞可见形态发生明显改变,细胞凋亡率明显升高.结论 ERC(N5)可特异结合整合素αvβ3,并通过抑制αvβ3的作用来抑制肝癌HepG2细胞增殖,并诱导细胞凋亡.
作者：刘海桃；孙栋栋；杨利军；张栋；杨涛 刊期： 2012年第07期
目的 比较不同新生牛血清对体外培养的BHK-21细胞的影响.方法 以不同厂家和同一厂家不同批次的共6种新生牛血清培养BHK-21细胞,观察细胞传代后在不同血清培养条件下的形态、增长倍数和细胞维持时间.结果 6号血清培养的细胞生长状态好,增长倍数高,维持细胞存活时间长;3号血清培养效果次之;2号、4号和5号血清培养的细胞至第4天仍未长满单层;1号血清培养的细胞基本未生长.结论 不同厂家和同一厂家不同批次的新生牛血清对BHK-21细胞体外培养的效果存在差异.
作者：孙招金；陈柄企；王玲；叶贺佳；童菊芸；罗开健 刊期： 2012年第07期
目的 克隆海藻糖合成酶(Trehalose synthase,Tres)基因,并在大肠杆菌中表达重组酶.方法 以长白山温泉The rmus thermophilus SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增Tres基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-Tres,转化E.coli BL21(DE3),分别采用IPTG和乳糖诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot和薄层色谱(Thin layer chromatography,TLC)分析.结果 重组表达质粒pET-30a(+)-Tres经双酶切及测序证实构建正确;IPTG和乳糖均能诱导重组蛋白的表达,且乳糖诱导的蛋白表达量较高;表达的重组酶Tres相对分子质量约为110 000,可与鼠抗6×His单克隆抗体特异性结合;粗酶液的酶活力为8 760 U/μg,是野生菌酶活的10倍;重组酶水解麦芽糖产物经TLC分析证实,其具有较强的海藻糖合成酶活性.结论 已成功在大肠杆菌中表达了重组Tres,为大规模生产海藻糖奠定了基础.
作者：尚宏丽；顾英；付莉；张挺 刊期： 2012年第07期
目的 制备一种携带肝癌DR5单克隆抗体(DR5mAb)的载多烯紫杉醇靶向脂质超声微泡(Docetaxei-loaded lipid microbubbles,DLLM),并检测其体外寻靶能力.方法 采用机械振荡法制备载多烯紫杉醇的DLLM,并制备生物素化的肝癌DR5mAb,通过生物素-亲和素连接方法,将DR5mAb连接于载多烯紫杉醇的DLLM表面,制备DR5- DLLM.检测DR5-DLLM的粒径、浓度、Zeta电位、包封率、载药量、稳定性及其体外寻靶能力.结果 DR5-DLLM的平均粒径为1 232 nm,Zeta电位为-9.86 mV,平均浓度为3.1×109个/ml,微泡的包封率为73.5％,平均载药量为25.3％.60Co射线灭菌前后以及4℃、-20℃保存14 d,微泡的形态、包封率、载药量未见明显改变.靶向微泡组的HepG2细胞周围可见DR5-DLLM微泡紧密结合,而非靶向微泡DLLM组未见特异性微泡结合.结论 成功制备了携带肝癌DR5mAb的载多烯紫杉醇靶向脂质超声微泡,该微泡能够与HepG2细胞牢固结合,有望成为一种新型、高效、可用于超声分子显像的肝癌靶向药物载体.
作者：杨健；康娟；曾妍；吴小翎；梅浙川；王志刚 刊期： 2012年第07期
目的 分析引起吉林省2011年手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)流行的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71 )VP1区基因的特征.方法 对2011年分离自吉林省8个市(州)HFMD病例的35株EV71分离株的VP1编码区基因进行RT-PCR扩增及序列测定,应用Bioedit和MEGA 4.0软件对VP1基因进行同源性和基因亲缘关系分析.结果 吉林省201 1年的35株EV71分离株均属于C4a基因亚型;其VP1区基因的核苷酸序列同源性在95.9％～100％之间,分属于3个进化枝,形成3个传播链,与2008年安徽阜阳株亲缘关系近,VP1区基因核苷酸序列同源性达97.6％～99.3％,与2007年的北京株和2003年的浙江株亲缘关系相对较远;2011年吉林省各市中,既存在3个EV71传播链共流行的市,同时监测到2个EV71传播链共流行的市,还发现3个只有单一EV71传播链的市,每个传播链均在5个市流行传播.结论 2011年在吉林省内,3个C4a基因亚型EV71的传播链同时循环传播引起HFMD的流行,未发现优势传播链.
作者：范明；周剑惠；张燕；魏雷雷；王爽；张云仙；苟伟民；马学军；齐忠；孙宇；赵海霞；孙伟；陈创 刊期： 2012年第07期
目的 构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)过氧化物氧化还原酶(Peroxiredoxin,Prx)基因重组真核表达质粒,并在HEK293T细胞中进行表达.方法 以重组质粒pET-30a(+)/TgPrx为模板,PCR扩增TgPrx基因片段,插入真核表达载体p3×Flag-CMW-14,构建重组表达质粒p3×Flag-CMW-14/TgPrx,转染HEK293T细胞,RT-PCR和Western blot检测TgPrx基因的转录和蛋白的表达.结果 PCR扩增出591bp的TgPrx基因片段;重组真核表达质粒p3×Flag-CMW-14/TgPrx经PCR、双酶切及测序证明构建正确;转染重组表达质粒的HEK293T细胞可检测到TgPrx基因的转录和蛋白的表达.结论 成功构建了重组真核表达质粒p3×Flag-CMW-14/TgPrx,并在HEK293T细胞中正确表达,为进一步研制核酸疫苗奠定了基础.
作者：郝海霞；王海龙；殷丽天；孟晓丽；申金雁；殷国荣 刊期： 2012年第07期
基因转移载体主要分为病毒和非病毒载体,研究其生物分布特点对于寻找毒性靶器官,评价生殖系转移危险具有重要参考价值.本文对不同种类基因转移载体的生物分布特点作—综述,为基因转移载体的选择、毒性评价等提供参考.
作者：苗玉发 刊期： 2012年第07期
目的 比较WorkBeads 40/10000 Bus low系列3146VL、3147L、3148H、3149VH4型不同丁基密度的疏水层析柱与BIA CIM Monoliths C4纯化汉逊酵母表达的HBsAg的效果.方法 将HBsAg溶于不同的上样缓冲液中,分别上样于4型WorkBeads预装层析柱和C4丁基层析柱,用不同的洗脱缓冲液洗脱,分别收集上样流穿峰和洗脱峰,测定HBsAg含量,并计算HBsAg的流穿率和洗脱率,筛选佳上样缓冲液和洗脱缓冲液.结果 3147L型柱适于HBsAg纯化工艺,含4％硫酸铵的20 mmo1/LPB是理想的上样缓冲液,20 mmol/L PB和含30％异丙醇的20 mmol/L PB均不是理想的洗脱缓冲液.CIMMonoliths C4佳上样缓冲液是含3％硫酸铵的50 mmol/LMOPS和含4％硫酸铵的20 mmol/L PB;含0.1％ Triton-100的50 mmol/L MOPS是佳的洗脱缓冲液.结论 可多次重复使用的WorkBeads系列介质和可耐受高流速的快速纯化介质CIMMonoliths C4均可用于汉逊酵母表达的HBsAg的纯化.
作者：李彩梅；张德有；马锐；许宁；杨旭琴；沈永才；王曦；刘英微；陈兴；李津 刊期： 2012年第07期
目的 探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgi α-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响.方法 构建GMⅡ基因真核过表达质粒EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine 2000转染BGC-823细胞,用400 mg/LG418筛选稳定转染的细胞.采用RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞中GMⅡ基因mRNA的转录水平以及蛋白的表达水平,Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞术(Annexin V/PI双染)检测过表达GMⅡ后细胞的凋亡情况.结果 转染重组质粒EX-E2372-M03后,BGC-823细胞GMⅡ基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平明显增加(P＜0.05);细胞凋亡率明显降低(P＜0.05).结论 过表达GMⅡ可能通过抑制胃癌细胞的凋亡,进而促进胃癌的发生发展.
作者：李钒；杨雅莹；易永芬 刊期： 2012年第07期
目的 探讨miR-450a腺病毒对体外培养小鼠早期胚胎发育的影响.方法 取小鼠2、4、8细胞期胚胎,用含不同浓度miR-450a腺病毒(0.01、0.1、1 ng/ml)的M16培养液培养,并设不含miR-450a腺病毒的对照组.倒置显微镜观察胚胎发育情况,并计算2、4、8细胞期的胚胎发育率.结果 miR-450a腺病毒可明显抑制受精卵细胞的正常分裂,导致小鼠胚胎发育异常,且随着miR-450a腺病毒浓度的增加,胚胎发育率明显下降(P＜0.05),在较高浓度miR-450a腺病毒培养过程中,有部分胚胎死亡、退化.结论 miR-450a腺病毒对体外培养的小鼠早期胚胎发育具有抑制作用,为胚胎发育异常的研究提供了新的思路.
作者：杨丹丹；刘晨；蒋凤兵；李宝林；白慧丽；施琼 刊期： 2012年第07期
目的 构建深黄被孢霉高产诱变菌株抑制消减杂交文库.方法 采用抑制消减杂交( Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以深黄被孢霉高产诱变菌株(高产菌株)和原始菌株为材料,构建消减cDNA文库.以高产菌株cDNA为试验组,原始菌株cDNA为对照组,进行两次消减杂交和两次抑制性PCR,将第2次PCR产物与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌TG1,通过蓝白斑筛选阳性克隆,并进行PCR鉴定.结果 文库的插入片段集中在250～750bp之间,所长出的菌落中91％为白色克隆,挑取96个克隆进行PCR筛选,获得78个阳性克隆,其中单一扩增条带的克隆约占82％.结论 利用SSH技术成功构建了深黄被孢霉高产诱变菌株差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选和鉴定深黄被孢霉高产诱变菌株特异表达基因奠定了基础.
作者：王丹枫；于长青 刊期： 2012年第07期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
