李彩梅；张德有；马锐；许宁；杨旭琴；沈永才；王曦；刘英微；陈兴；李津
目的 比较不同新生牛血清对体外培养的BHK-21细胞的影响.方法 以不同厂家和同一厂家不同批次的共6种新生牛血清培养BHK-21细胞,观察细胞传代后在不同血清培养条件下的形态、增长倍数和细胞维持时间.结果 6号血清培养的细胞生长状态好,增长倍数高,维持细胞存活时间长;3号血清培养效果次之;2号、4号和5号血清培养的细胞至第4天仍未长满单层;1号血清培养的细胞基本未生长.结论 不同厂家和同一厂家不同批次的新生牛血清对BHK-21细胞体外培养的效果存在差异.
作者：孙招金；陈柄企；王玲；叶贺佳；童菊芸；罗开健 刊期： 2012年第07期
目的 构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)过氧化物氧化还原酶(Peroxiredoxin,Prx)基因重组真核表达质粒,并在HEK293T细胞中进行表达.方法 以重组质粒pET-30a(+)/TgPrx为模板,PCR扩增TgPrx基因片段,插入真核表达载体p3×Flag-CMW-14,构建重组表达质粒p3×Flag-CMW-14/TgPrx,转染HEK293T细胞,RT-PCR和Western blot检测TgPrx基因的转录和蛋白的表达.结果 PCR扩增出591bp的TgPrx基因片段;重组真核表达质粒p3×Flag-CMW-14/TgPrx经PCR、双酶切及测序证明构建正确;转染重组表达质粒的HEK293T细胞可检测到TgPrx基因的转录和蛋白的表达.结论 成功构建了重组真核表达质粒p3×Flag-CMW-14/TgPrx,并在HEK293T细胞中正确表达,为进一步研制核酸疫苗奠定了基础.
作者：郝海霞；王海龙；殷丽天；孟晓丽；申金雁；殷国荣 刊期： 2012年第07期
目的 克隆海藻糖合成酶(Trehalose synthase,Tres)基因,并在大肠杆菌中表达重组酶.方法 以长白山温泉The rmus thermophilus SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增Tres基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-Tres,转化E.coli BL21(DE3),分别采用IPTG和乳糖诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot和薄层色谱(Thin layer chromatography,TLC)分析.结果 重组表达质粒pET-30a(+)-Tres经双酶切及测序证实构建正确;IPTG和乳糖均能诱导重组蛋白的表达,且乳糖诱导的蛋白表达量较高;表达的重组酶Tres相对分子质量约为110 000,可与鼠抗6×His单克隆抗体特异性结合;粗酶液的酶活力为8 760 U/μg,是野生菌酶活的10倍;重组酶水解麦芽糖产物经TLC分析证实,其具有较强的海藻糖合成酶活性.结论 已成功在大肠杆菌中表达了重组Tres,为大规模生产海藻糖奠定了基础.
作者：尚宏丽；顾英；付莉；张挺 刊期： 2012年第07期
目的 探讨水痘减毒活疫苗(以下简称水痘疫苗)的豚鼠异常毒性检查法.方法 按照《中国药典》三部(2010版)规定,对本公司生产的41批水痘疫苗进行豚鼠异常毒性检查;分别对本公司生产的水痘疫苗在不同实验室、4个不同厂家的水痘疫苗、本公司生产的不同批号水痘疫苗及不同体重的豚鼠注射本公司生产的水痘疫苗后进行异常毒性检查.注射前每只豚鼠称重,应为250～350 g.每只豚鼠腹腔注射供试品5.0nl,观察7d.结果 观察期内,豚鼠全部健存,且无异常反应,到期时每只豚鼠体重均增加.其中,同一实验室的豚鼠在注射同一批水痘疫苗后出现体重增加差异;不同实验室的豚鼠体重增加有差异,每天称重影响豚鼠体重的增加;在注射疫苗后的第1、2天,多数豚鼠体重出现略微下降,随后开始逐渐增加.结论 本公司生产的水痘疫苗安全性良好,建议采用清洁级以上的豚鼠进行异常毒性检查,同时规定实验动物的性别和注射前的观察期限,并设立阳性、阴性对照,对生物制品的安全性作出更为合理的评价.
作者：陈哲文；金于兰；马相虎；张建光；朱玉美；王亮 刊期： 2012年第07期
目的 筛选产磷脂酶A1(Phospholipase A1,PLA1,EC3.1.1.32)的菌株,并优化其发酵条件.方法 从富油土壤中筛选产PLA1的菌株,并对PLA1活力高的菌株进行分子生物学鉴定及发酵条件的优化.结果 筛选出的5个菌株中Dx208菌株PLA1活力高,摇瓶发酵酶活力达4.52 U/ml.根据该菌株的形态特征分析和16SrDNA基因序列,初步鉴定其为链霉菌属(Streptomyces)的灰色链霉菌(Streptomyces griseus).该菌株的佳发酵条件为:初始pH7.0,培养温度30℃,发酵时间5d,摇床转速200r/min,发酵液中PLA1活力可达7.15 U/ml,为优化前的1.58倍.结论 已筛选出1株高产PLA1的菌株,并优化了其发酵条件,为PLA1的生产及应用奠定了基础.
作者：赵梦梦；薛正莲；苏燕南；赵世光；陈涛 刊期： 2012年第07期
目的 观察淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)基因真核表达质粒不同免疫途径诱导的小鼠特异性体液免疫应答效果.方法 将NspA基因真核表达质粒pcNspA通过肌肉、滴鼻和阴道3种途径免疫BALB/c小鼠,分别于0、2、3、4周各免疫1次,末次免疫后2周,收集各组小鼠血清、支气管肺泡洗液和阴道洗液,采用间接ELISA方法检测特异性抗体效价;并检测抗体介导的补体溶菌活性.结果 滴鼻免疫和肌肉免疫pcNspA质粒均可诱导小鼠体内产生较高水平的特异性IgG和IgA抗体,而且滴鼻免疫组在支气管肺泡洗液和阴道洗液中均可检测到特异性sIgA抗体,而阴道免疫组仅在阴道局部检测到较低水平的特异性sIgA抗体;滴鼻免疫组小鼠血清具有溶菌活性.结论 淋病奈瑟菌NspA基因真核表达质粒可诱导小鼠体内产生特异性抗体,并具有抗菌活性;滴鼻免疫可能是其更有效的免疫途径.
作者：李国才；蒋桂花；焦红梅；陈红菊；潘兴元；严华；季明春 刊期： 2012年第07期
目的 克隆牛布氏菌virB8基因并在大肠杆菌中进行表达.方法 从牛布氏菌S19基因组DNA中PCR扩增virB8基因片段,插入pEASY-E1载体中,构建重组表达质粒pEASY-virB8,转化E. coli BL.21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经HisTrapTM FF纯化后,进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定.结果 扩增的virB8基因大小为720 bp;重组表达质粒pEASY-virB8经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,表达量占菌体总蛋白的17.3％;纯化的重组蛋白纯度为85％,Lowry法测定蛋白浓度为1.52 mg/ml,可与鼠抗His单抗特异性结合.结论 成功克隆了牛布氏菌virB8基因,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为新型疫苗的研发及布氏菌鉴别诊断方法的建立提供了有效的候选抗原.
作者：张瑞；王秀然；夏力亮；李晓艳；王兴龙；王景龙；冉会玲；钱晶 刊期： 2012年第07期
目的 构建猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV )E2蛋白基因重组人5型腺病毒,并进行鉴定.方法 通过巢式PCR从猪瘟活疫苗中扩增CSFV E2全基因序列,克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA的多克隆位点处,构建重组穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA-E2,将其线性化后与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,进行重组腺病毒的包装.细胞完全病变后,采用RT-PCR法检测E2基因mRNA的转录;细胞病变法检测病毒滴度;连续传代后检测病毒的稳定性;Western blot法检测E2蛋白的表达;以105.82 TCID50重组腺病毒经腹腔免疫小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清猪瘟抗体效价.结果 重组穿梭质粒paeAd5 CMVK-NpA-E2经双酶切及测序证明构建正确;重组腺病毒rAd5v-MxE2转染的293AD细胞可检测到E2基因的转录和蛋白的表达;重组腺病毒的滴度为105.82 TCID50/ml;第5、30代重组腺病毒均可扩增出目的基因条带,病毒滴度无明显变化;重组腺病毒免疫小鼠后,可产生CSFV抗体.结论 成功构建了CSFV E2基因重组人5型腺病毒,其免疫原性良好,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础.
作者：杨洋；高博；宫婷；李业伟；孙程龙；张守峰；刘晔；扈荣良 刊期： 2012年第07期
目的 了解大理地区志贺菌耐药性分布及其对氟喹诺酮类药物的耐药机制.方法 对2010～2011年从大理地区各医院收集的粪便标本进行分离培养和血清型鉴定;K-B琼脂扩散法检测分离的志贺菌对12种常见抗菌药物的耐药性;E-test法检测环丙沙星和萘啶酸对耐药菌株的小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC);经PCR和DNA测序检测耐药菌株基因突变;R质粒接合试验检测氟喹诺酮类药物耐药性与R质粒介导的相关性.结果 共分离到68株志贺菌,其中福氏志贺菌41株,宋内志贺菌25株,鲍氏志贺菌2株;志贺菌对萘啶酸耐药率高,其次为复方磺胺甲噁唑、氨苄西林,对头孢曲松和头孢噻肟较敏感,对喹诺酮类显示出不同程度的耐药率;环丙沙星对志贺菌的MIC在0.008～ 32 μg/ml之间,萘啶酸对志贺菌的MIC均≥1μg/ml,有4株MIC≥256 μg/ml;6株对氟喹诺酮类药物耐药的菌株中均存在gyrA基因Ser83→Leu和par口C基因Ser80→Ile的突变,其中有2株存在gyrA基因Asp87→Asn的突变,2株存在Asp87→Gly的突变,3株存在parC基因Gln91→His的突变;R质粒介导与氟喹诺酮类药物耐药无关.结论 治疗细菌性痢疾首选头孢曲松和头孢噻肟,志贺菌gyrA和parC基因突变与对氟喹诺酮类药物耐药性密切相关,与R质粒介导无关.
作者：王国富；薛士鹏；吴利先 刊期： 2012年第07期
目的 克隆鲍曼不动杆菌blaNDM-1基因,对NDM-1进行生物信息学分析,表达并纯化重组NDM-1蛋白.方法 PCR扩增鲍曼不动杆菌NDM-1的blaNDM-1基因,克隆至pMAL-p2X质粒,构建重组原核表达质粒pMAL-p2X::NDM-1,对NDM-1进行生物信息学分析.将重组表达质粒转化大肠杆菌Tb1,IPTG诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白MBP-NDM-1.结果 重组表达质粒pMAL-p2X::NDM-1经双酶切和测序证实构建正确;生物信息学分析表明,NDM-1的相对分子质量为28 487.86,等电点为5.89,1～28氨基酸为NDM-1的信号肽序列,与其他亚型金属β-内酰胺酶同源性很低;表达的重组蛋白相对分子质量约73000,主要以可溶形式表达;纯化后的重组蛋白浓度为1.72mg/ml.结论 表达并纯化了可溶性重组蛋白MBP-NDM-1,为后续NDM-1活性功能及其抑制剂的研究奠定了基础.
作者：夏力亮；孙洋；张瑞；陈硕；邱少富；王中强；柳楠；刘军；祝令伟；纪雪；宋宏斌；冯书章 刊期： 2012年第07期
目的 分析引起吉林省2011年手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)流行的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71 )VP1区基因的特征.方法 对2011年分离自吉林省8个市(州)HFMD病例的35株EV71分离株的VP1编码区基因进行RT-PCR扩增及序列测定,应用Bioedit和MEGA 4.0软件对VP1基因进行同源性和基因亲缘关系分析.结果 吉林省201 1年的35株EV71分离株均属于C4a基因亚型;其VP1区基因的核苷酸序列同源性在95.9％～100％之间,分属于3个进化枝,形成3个传播链,与2008年安徽阜阳株亲缘关系近,VP1区基因核苷酸序列同源性达97.6％～99.3％,与2007年的北京株和2003年的浙江株亲缘关系相对较远;2011年吉林省各市中,既存在3个EV71传播链共流行的市,同时监测到2个EV71传播链共流行的市,还发现3个只有单一EV71传播链的市,每个传播链均在5个市流行传播.结论 2011年在吉林省内,3个C4a基因亚型EV71的传播链同时循环传播引起HFMD的流行,未发现优势传播链.
作者：范明；周剑惠；张燕；魏雷雷；王爽；张云仙；苟伟民；马学军；齐忠；孙宇；赵海霞；孙伟；陈创 刊期： 2012年第07期
目的 比较WorkBeads 40/10000 Bus low系列3146VL、3147L、3148H、3149VH4型不同丁基密度的疏水层析柱与BIA CIM Monoliths C4纯化汉逊酵母表达的HBsAg的效果.方法 将HBsAg溶于不同的上样缓冲液中,分别上样于4型WorkBeads预装层析柱和C4丁基层析柱,用不同的洗脱缓冲液洗脱,分别收集上样流穿峰和洗脱峰,测定HBsAg含量,并计算HBsAg的流穿率和洗脱率,筛选佳上样缓冲液和洗脱缓冲液.结果 3147L型柱适于HBsAg纯化工艺,含4％硫酸铵的20 mmo1/LPB是理想的上样缓冲液,20 mmol/L PB和含30％异丙醇的20 mmol/L PB均不是理想的洗脱缓冲液.CIMMonoliths C4佳上样缓冲液是含3％硫酸铵的50 mmol/LMOPS和含4％硫酸铵的20 mmol/L PB;含0.1％ Triton-100的50 mmol/L MOPS是佳的洗脱缓冲液.结论 可多次重复使用的WorkBeads系列介质和可耐受高流速的快速纯化介质CIMMonoliths C4均可用于汉逊酵母表达的HBsAg的纯化.
作者：李彩梅；张德有；马锐；许宁；杨旭琴；沈永才；王曦；刘英微；陈兴；李津 刊期： 2012年第07期
目的 探讨TPX2基因沉默对人肺腺癌A549细胞增殖的影响.方法 构建3个靶向TPX2基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒,转染A549细胞,RT-PCR检测TPX2基因mRNA的转录水平;筛选干扰效果佳的质粒转染的细胞,RT-PCR检测增殖相关基因CDK4和CyclingD1 mRNA的转录水平,Western blot检测TPX2蛋白的表达水平,显微镜下观察细胞的生长情况,MTT法检测细胞的增殖活力.结果 TPX2 shRNA-3质粒干扰效果佳,有效沉默TPX2基因后,A549细胞中TPX2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均受到明显抑制(P＜0.01),与空白对照组比较,抑制率分别为73.8％和82.8％;CDK4和CyclingD1基因mRNA的转录水平也明显降低(P＜0.01或＜0.05),与空白对照组比较,抑制率分别为76.7％和67.3％;A549细胞的生长和增殖也明显受到抑制,转染后72 h,增殖抑制率可达61.55％(P＜0.05).结论 成功构建了靶向TPX2基因的shRNA表达质粒,其在mRNA和蛋白水平有效抑制A549细胞TPX2基因的表达后,细胞生长受到抑制,增殖能力减弱.
作者：唐熹；张徽；刘莹 刊期： 2012年第07期
目的 探讨建立新生期BALB/c小鼠非致死性肺炎链球菌感染模型的方法.方法 将新生期BALB/c小鼠随机分为肺炎链球菌感染1次组(于新生期第7天分别经鼻腔滴注肺炎链球菌D39株107、108、109、1010 CFU菌液各10μ1)、感染2次组(于新生期第6、7天连续2d经鼻腔滴注肺炎链球菌D39株107、108、109、1010 CFU菌液各10μ1)和对照1、2组(于第7天和第6、7天分别经鼻腔滴注PBS液10μ1),每组20只.后1次鼻腔滴注后24h随机抽取10只小鼠处死,取肺组织匀浆,进行细菌培养及鉴定,HE染色观察肺组织病理改变.剩余10只观察感染后5d的体重变化及存活情况.结果 感染2次109 CFU肺炎链球菌组小鼠出现安静少动,皮肤苍白,体重增长下降;感染率与存活率均＞85％;病理显示肺部出现炎症改变,肺泡间隔增厚,血管周围和支气管周围有一定程度的炎症细胞浸润,以中性粒细胞为主.结论 新生期第6、7天感染109 CFU肺炎链球菌可能是成功建立新生期BALB/c小鼠非致死性肺炎链球菌感染模型的较好方法.
作者：杨婷；罗征秀；符州；刘昌林；王莉佳；罗健；刘恩梅 刊期： 2012年第07期
目的 探讨p16基因对骨肉瘤U-2OS细胞的抑制效应.方法 将p16基因真核表达质粒pcDNA3-HA-p 16和pcDNA3-HA质粒分别转染U-2OS细胞,并设未转染阴性对照组,采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,PI单染法分析细胞周期的分布,DNA ladder法结合PI单染法检测细胞的凋亡情况.结果 p16基因可显著抑制U-2OS细胞的增殖(P＜0.05),且在一定范围内呈剂量效应关系;p16基因可使U-2OS细胞G1期比例显著升高(P＜0.05),S期比例显著降低(P＜0.05);p16基因可使U-2OS细胞凋亡率明显上升(P＜0.05),细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳后呈典型的DNA ladder.结论 p16基因可显著抑制U-2OS细胞增殖,使细胞阻滞于G1期,并促进细胞凋亡.
作者：夏羿凡；余娴；冯丽；袁斌 刊期： 2012年第07期
目的 探讨低氧对分化型甲状腺癌KAT、WRO细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenehymal transition,EMT)的影响.方法 以氯化钴(CoCl2)模拟细胞低氧微环境,采用MTT法检测细胞的增殖活力,筛选CoCl2的适作用浓度;倒置显微镜观察低氧下细胞的形态特征;Western blot检测低氧0、3、6、12h后KAT和WRO细胞中HIF-1a蛋白的表达及低氧6h后KAT和WRO细胞上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和间质细胞波形蛋白(Vimentin)的表达.结果 CoCl2适作用浓度为150 μmol/L,低氧使KAT和WRO细胞逐渐获得了间质细胞的形态特征.低氧6h后,KAT和WRO细胞中HIF-1a蛋白的表达达峰值,与低氧0h组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).低氧组KAT细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显低于正常组(P＜0.01),Vimentin蛋白的表达水平与正常组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);低氧组WRO细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显低于正常组(P＜0.oi),Vimentin蛋白的表达水平明显高于正常组(P＜0.01).结论 HIF-1a可能通过下调E-cadherin、上调Vimentin而促进分化型甲状腺癌细胞KAT和WRO发生上皮间质转化,使其获得侵袭、转移潜能.
作者：贾朝莉；刘智敏；曾得康；杨俊艳；龙方懿；刘小花 刊期： 2012年第07期
目的 从兔肋软骨膜中分离间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),并进行鉴定.方法 取3～4周龄新西兰大白兔,采用机械消化法和酶消化法结合的两步消化法获取肋软骨膜细胞,体外培养观察其生长形态;免疫组化法鉴定其表型特征;并检测其诱导成骨、成脂的分化潜能.结果 从肋软骨膜中分离的原代细胞聚集成团,以圆形和多角形为主,从第2代开始细胞形态均一,以梭形为主,呈漩涡状排列,并开始表达CD29和CD90,不表达CD34和Ⅱ型胶原,现已传至15代,生长良好;第3代细胞经诱导可分化为成骨细胞或脂肪细胞.结论 从兔肋软骨膜中可获得干细胞,其具有与MSCs相似的特性.
作者：李敏；刘俊；姜蓉；汪维伟 刊期： 2012年第07期
目的 探讨低氧诱导因子-1α( Hgpoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、锌指转录抑制因子Twist和钙黏蛋白E(E-cadherin)在人乳腺癌中的表达及其意义.方法 采用免疫组化SP法检测术前未接受过放疗、化疗及激素治疗的69名患者乳腺癌组织标本中HIF-1α、Twist和E-eadherin的表达,并分析三者表达的相关性.结果 在69份乳腺癌组织标本中,HIF-1α、Twist 和E-cadherin的阳性表达率分别为71.01％(49/69)、57.97％(40/69)和50.72％(35/69);HIF-1α、Twist和E-cadherin的阳性表达率与TNM分期和腋淋巴结转移有关(P＜0.05或P＜0.01),与患者年龄、肿瘤大小和病理类型无关(P＞0.05).HIF-1α与Twist的表达呈显著正相关(r＝0.286,P＜0.05),Twist与E-cadherin的表达呈显著负相关(r＝－0.371,P＜ 0.01).结论 HIF-1α、Twist和E-cadherin在乳腺癌中的表达情况可作为监测乳腺癌发展的指标.
作者：龙方懿；印国兵；刘智敏；吴婷婷；贾朝莉；杨俊艳；刘小花 刊期： 2012年第07期
目的 探讨ATP结合盒转运子A1 (ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)和血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)在人脑胶质母细胞瘤中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组化法检测ABCA1和HO-1蛋白在44份人脑胶质母细胞瘤及14份瘤旁正常脑组织标本中的表达情况,分析ABCA1和HO-1的表达与患者临床病理特征之间的相关性.结果 ABCA1和HO-1蛋白在胶质母细胞瘤中表达的阳性率(77.3％和75％)与瘤旁正常组织(均为7.1％)相比,差异均有统计学意义(P均＜0.001),且ABCA1与HO-1的表达呈正相关(rs＝0.313,P＜0.05);患者性别、年龄、手术切除范围、肿瘤大小、有无复发、术后放化疗情况与ABCA1、HO-1蛋白的表达无相关性(P＞0.05).结论 ABCA1和HO-1蛋白在胶质母细胞瘤中高表达可能对胶质母细胞瘤的发生、发展具有一定的作用.
作者：王晨；余天平；滕志朋；刘斌；李昱 刊期： 2012年第07期
基因转移载体主要分为病毒和非病毒载体,研究其生物分布特点对于寻找毒性靶器官,评价生殖系转移危险具有重要参考价值.本文对不同种类基因转移载体的生物分布特点作—综述,为基因转移载体的选择、毒性评价等提供参考.
作者：苗玉发 刊期： 2012年第07期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
