李卫泊；尹昱；蔡建辉；张峻岭；谢绍建；薛平；周保军；严丽
目的 利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)安徽分离株制备油乳剂灭活疫苗,并进行免疫试验.方法 PRRSV经Marc-145细胞传代增殖,制备油乳剂灭活疫苗;物理性状、无菌试验及安全性试验合格后,经肌肉注射免疫健康仔猪,并进行攻毒;分别检测免疫仔猪的血清抗体水平及保护力,并进行免疫程序及与市售疫苗的免疫效果的比较试验.结果 制备的灭活疫苗的适宜免疫剂量为2 ml/头,免疫后14 d血清抗体水平可达高峰;使用同一病毒攻毒,保护率为80%(4/5).采用灭活疫苗2次免疫及灭活疫苗与弱毒疫苗交替2次免疫,免疫效果均较好.制备的灭活疫苗免疫效果与1号市售灭活疫苗相比,差异无统计学意义,且优于2号市售灭活疫苗.结论 已成功制备了PRRSV安徽分离株油乳剂灭活疫苗,该疫苗安全可靠,免疫效果好,适于推广使用.
作者：王星晨；李郁；王桂军；孙裴；魏建忠；杨德康；张玮 刊期： 2010年第04期
目的 建立人性腺激素释放激素类似物-绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38的质控方法和质量标准.方法 采用HeLa细胞/结晶紫比色法测定GP38蛋白的生物学活性,并进行精密性和回收率验证;反相高效液相色潜法(RP-HPLC)测定其纯度,用自编CPM软件进行肽图比较分析;其他检测项目按<中国药典>三部(2005版)规定进行.结果 GP38蛋白生物学活性测定方法经验证,原液试验内变异系数(CV)为10%,试验间CV值为20%;成品试验内CV值为12%,试验间CV值为21%.用该法对GP38蛋白原液和成品进行检测,其生物学活性分别为(3 736±483)和(1 777±260)U/ml.原液经RP-HPLC分析,纯度为(97.1±0.2)%,符合其质量标准大于95.0%的规定.用自编CPM软件分析肽图结果显示,相同酶切条件重复检测的相似度大于0.99,不相同次酶切、相同条件重复检测的相似度大于0.90.其他各项检测结果均符合<中国药典>三部(2005版)的相关要求.结论 所建立的质控方法和质量标准可用于GP38蛋白产品的常规检定.
作者：史新昌；韩春梅；李响；刘兰；丁有学；饶春明 刊期： 2010年第04期
目的 探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HAS)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响.方法 根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HAS)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HAS的表达量.结果 经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HAS中.经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HAS,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L.结论 共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础.
作者：屈琳；雷楗勇；张琦；丁月娣；马晓峰；陈蕴；金坚 刊期： 2010年第04期
目的 以艾滋病病毒(HIV)为研究对象,建立感染性疾病RNA病毒性病原体的生物信息学检测方法.方法 应用DNase-非序列依赖的单引物扩增技术,将艾滋病患者血清过滤后,经DNase处理去除血清中的内源DNA,提取血清病毒RNA,反转录合成病毒RNA的双链cDNA,Taq I酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基闪;PCR产物克隆后,酶切鉴定并测序,经GenBank BLAST软件进行序列分析.结果 非序列依赖的单引物扩增HIV患者血清中外源基因得到多个DNA片段;重组克隆质粒经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切,可见插入片段存在;将所有PCR产物测序,序列与已知病原基因序列一致.结论 应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测RNA病毒性病原体.
作者：于庭；包洪；刘爱忠；于艳辉；滕春燕 刊期： 2010年第04期
目的 原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Ab1基因OD域融合蛋白.方法 将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化.结果 所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,诱导6 h蛋白表达量达高,约为10%;Western blot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%.结论 已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础.
作者：季茂胜；黄峥兰；黄世峰；曾建明；刘钉宾；罗红伟；曹唯希；冯文莉 刊期： 2010年第04期
目的 应用30 L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA).方法 将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30 L生物反应器中,并采用Biocommand Plus 软件系统实时监控.先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养.在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性.采用Lysine-Sepharose 4B和Zn~(2+)-Sepharose 4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度.结果 整个培养过程持续51 d,包括生长培养6 d,表达培养45 d,平均日灌流量为46.7 L,高达60 L,共收获表达培养液约2 100 L;rht-PA的平均表达水平为15.15 mg/L,高可达19.25 mg/L,生物学活性平均约为8 000 IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达高水平(15.97 g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×10~5 IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上.结论 应用30 L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达.
作者：梅建国；沈志强；庄金秋 刊期： 2010年第04期
目的 构建肠道病毒71型(EV71)P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,并检测3CD蛋白酶的切割作用和表达产物的抗原性.方法 采用RT-PCR法从阜阳分离的EV71中扩增P1和3CD基因,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-P1-3CD、pShuttle-CMV-P1和pShuttle-CMV-3CD;经同源重组获得重组腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和rAd-3CD,分别转染293细胞,RT-PCR法检测目的基因的转录,免疫荧光法检测目的蛋白的表达.结果 3种重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明构建正确;RT-PCR检测表明,3个重组腺病毒均已转录目的基因mRNA;免疫荧光检测仅观察到rAd-P1-3CD表达产物具有特异性,而rAd-P1、rAd-3CD未能检测到特异性表达产物.结论 已成功构建EV71 PI和3CD基因双顺反子重组腺病毒,表达产物具有EV71特异抗原性,提示P1产物只有在被3CD蛋白酶切割后才体现抗原性.
作者：戈小琴；李鸿钧；王文举；谢天宏；张光明；孙茂盛 刊期： 2010年第04期
鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)及草鱼性腺细胞(CO)可用于鱼类疱疹病毒、草鱼出血病病毒、鲤春病毒血症病毒等常见鱼类病毒的分离培养.探讨EPC及CO细胞的适宜冻存条件,可减少由于细胞在体外传代次数增加和外界环境的改变而引起的细胞生物学特性变化,从而提高上述病毒的分离效率.比较两种细胞的冻存效果,也可以从侧面了解两种细胞在培养特性上的差异.为此,本文进行了不同血清浓度和冻存方法对细胞贴壁率的影响试验,现报道如下.
作者：朱霞；迟源；王好；周井祥 刊期： 2010年第04期
目的 探讨表达鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的重组腺病毒Ad-HN对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用.方法 应用Ad-HN感染HepG-2细胞,采用MTT法检测Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制作用;Annexin V染色法结合流式细胞仪检测细胞凋亡;AO/EB染色法和DAPI染色法对Ad-HN感染的肿瘤细胞及细胞核进行形态学观察;底物显色法检测Caspasel、Caspase3、Caspase6和Caspase8活性的变化.结果 Ad-HN能够有效抑制HepG-2细胞的增殖,当感染剂量为100 MOI,作用时间为48 h时,Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制率达峰值(17.20%～35.04%);Annexin V染色结果显示,Ad-HN感染48 h后HepG-2细胞凋亡率为29.39%;Ad-HN感染导致HepG-2细胞呈现细胞浓缩、细胞核皱缩进而碎裂等凋亡特征;Ad-HN感染可显著上调HepG-2细胞的Caspase酶活性.结论 Ad-HN能够诱导HepG-2细胞凋亡,并对HepG-2细胞产生抑制效应.
作者：温中梅；李霄；刘妍；高鹏；阚式绂；王卓越；王宇航；彭丽萍；金宁一 刊期： 2010年第04期
目的 采用冷冻干燥法制备1型糖尿病噬菌体展示疫苗.方法 将正交试验筛选的不同冻干保护剂与1型糖尿病噬菌体展示疫苗混合,优化冻干曲线进行冻干.检测冻干前后噬菌体疫苗的滴度,并通过各项指标对冻干后的疫苗进行评价.结果 经筛选,佳保护剂配方为:10.85%海藻糖+17.37%甘氨酸(w/v);佳冻干曲线为:SI:-40℃ 4 h,1.5℃/min;S2:-15℃ 5 h,1.5℃/min;S3:25℃ 4 h,1.5℃/min;真空度:0.02 mbar.冻干后疫苗滴度下降不超过0.5 pfu/ml,外观及电镜观察疫苗样品形态均较好,玻璃态转化温度能达到220℃以上,含水量小于3%.结论 以海藻糖、甘氨酸为保护剂,采用冷冻干燥法制备的1型糖尿病噬菌体展示疫苗具有保护剂组成成分少、热稳定性强、含水量低、冻干曲线简化、保存时间长等特点.
作者：任万军；胡云章；胡凝珠 刊期： 2010年第04期
目的 原核表达并纯化小鼠白细胞介素-13受体α2胞外区(sIL-13Rα2).方法 将sIL-13Rα2基因克隆入原核表达载体pROEX HTa,构建重组表达质粒pROEX HTa/sIL-13Rα2,经双酶切鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.薄层扫描分析目的蛋白的表达量,并对其进行表达形式分析及Western blot鉴定.镍柱亲和层析纯化目的蛋白.结果 重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确.表达的sIL-13Rα2蛋白相对分子质量约为36 200;诱导6 h,重组蛋白的表达量高,约占菌体总蛋白的45%;重组蛋白以包涵体形式存在,可与大鼠抗小鼠sIL-13Rv2单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度大于95%.结论 已成功表达并纯化了sIL-13Rα2,为进一步探讨其治疗支气管哮喘奠定了基础.
作者：王丽丽；魏亚强；蔡累；宋爱玲；王伟华；张英起；李志奎 刊期： 2010年第04期
目的 提取羊布鲁菌标准强毒株16 m膜蛋白,分析其反应原性,并建立血清抗体间接ELISA检测方法.方法 利用碳酸盐方法提取羊布鲁菌标准强毒株16 m膜蛋白,12%SDS-PAGE分析其相对分子质量范嗣;用自然感染羊布鲁菌的阳性血清进行Western blot分析,初步确定膜蛋白组分中能够发生免疫反应的条带;用方阵滴定法确定抗原和抗体的佳稀释度,建立间接ELISA检测方法,并进行特异性和精密性验证;检测免疫豚鼠的血清抗体效价;对临床上采集的羊血清样品进行检测,并与虎红平板凝集试验结果进行比较.结果 分离的羊布鲁菌膜蛋白浓度为9.4 μg/μl;SDS-PAGE分析显示,羊布鲁菌膜蛋白的相对分子质量主要集中在17 000～80 000之间;Western blot分析显示多条特异性反应条带.膜蛋白抗原的佳稀释度为1:1 280,抗体佳稀释度为1:10.所建立的ELISA方法特异性和精密性良好.ELISA检测豚鼠血清效价为1:64 000.检测临床510份羊血清样品,阳性率为86.3%,高于虎红平板凝集试验检出的阳性率(41.2%).结论 已成功提取了羊布鲁菌膜蛋白,其具有良好的反应原性,并建立了血清抗体间接ELISA检测方法.
作者：杨艳玲；唐婕；白光彦；盛雪玲；王成福；王兴龙 刊期： 2010年第04期
目的 初步建立HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法,并对HIV疫苗进行免疫原性评价.方法 选择一种HIV DNA疫苗(D)、2种重组痘苗载体HIV疫苗(M和R),分别免疫BALB/c小鼠,6周后分离血清和脾淋巴细胞,采用ELISOPT和胞内因子染色法检测细胞因子分泌情况,MTS法检测淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测血清中抗-HIV IgG和IgA抗体水平.结果 D、M和R疫苗均可诱导小鼠产生广泛的免疫应答,ELISPOT法可检出脾细胞分泌IFNγ、IL-2、IL-4和IL-6;胞内因子染色可检出IFNγ、IL-2和IL-4的分泌;D和M组脾淋巴细胞增殖试验阳性数高于R组;D、M和R组血清抗-HIV IgG抗体分别有0/5、1/5和5/5小鼠阳转,各组均未检出血清抗.HIV IgA.结论 已初步建立了HIV疫苗小鼠免疫原性检测方法.
作者：黄维金；张春涛；赵晨燕；王佑春 刊期： 2010年第04期
目的 分析猪瘟疫苗免疫反应低下猪CD3~+CD4~+和CD4~+CD25~+巴细胞亚群的分布.方法 将接种过猪瘟疫苗的种母猪经ELISA和血清中和试验检测筛选出猪瘟病毒(CSFV)抗体阴性猪.从中挑选出15头作为研究对象,以15头抗体阳性猪作为对照.采集猪的抗凝血,分离外周血淋巴细胞(PBL),流式细胞术检测30头猪PBL中CD3~+CD4~+和CD4~+CD25~+淋巴细胞亚群的分布.结果 CSFV抗体阴性猪PBL中CD3~+CD4~+细胞的比例(24.09%±1.29%)明显低于CSFV抗体阳性猪(37.49%±1.60%):CSFV抗体阴性猪PBL中CD4~+CD25~+细胞的比例(2.34%±0.20%)明显高于CSFV抗体阳性猪(1.64%±0.13%).结论 PBL中CD3~+CD4~+淋巴细胞亚群的减少及CD4~+CD25~+淋巴细胞亚群的增加,可能是导致猪瘟疫苗免疫反应低下的重要原因.
作者：王惟；杨知；付明山；郑海英；李芳萍；涂长春 刊期： 2010年第04期
目的 观察注射用母牛分枝杆菌(微卡)对结核菌感染小鼠细胞免疫功能的影响,并探讨其作用机制.方法 C57小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37Rv,建立结核菌感染小鼠模型.将模型小鼠随机分为模型组、微卡高、中、低3个剂量组和异烟肼组,同时设正常对照组.感染8周后处死小鼠,取肺、脾、肝,计算重量指数和病变总指数,测定肺脏活菌数量,并观察主要脏器的病理变化;流式细胞术测定小鼠脾脏中CD3~+T、CD4~+T、NK1.1~+T、NK、γδT细胞的比例以及CD4~+T细胞胞内IFNγ和IL-4的表达.结果 微卡各剂组能明显减轻感染小鼠的发病状况,其中微卡中剂量组的各脏器病变总指数、脾脏和肺脏重毋指数、肺脏结核菌活菌数均显著低于模型组;微卡各剂量组小鼠的肺部病变主要以增殖性结节为主,而模型组则以坏死性结节和增殖性结节为主;微卡各剂量组小鼠的CD3~+T、CD4~+T细胞比例均明显升高,CD4~+IFNγ~+辅助性T细胞比例与模型组比较,差异无统计学意义;微卡低、中剂量组CD4~+IL-4~+辅助性T细胞比例明显降低,同时能显著提高小鼠天然免疫系统γδT和NK细胞的比例.结论 微卡可提高结核菌感染小鼠天然和获得性细胞免疫水平,对结核菌感染小鼠具有较好的免疫干预作用.
作者：陶立峰；蒲江；宛荣生；王德海；李静；沈煜；张鑫 刊期： 2010年第04期
目的 克隆猪干扰素α(IFNα)基因,并在毕赤酵母中进行表达.方法 用植物血凝素诱导猪外周血中的淋巴细胞,Trizol试剂提取总RNA,经RT-PCR扩增猪IFNα基因,将其克隆至pPIC9K载体中,构建重组真核表达质粒pPIC9K-IFNα,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中.筛选阳性菌株,经甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果 RT-PCR扩增获得521bp的猪IFNα基因;所构建的重组表达质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为19 000,可溶性蛋白约占菌体总蛋白的13%;该蛋白能与相应抗体产生特异免疫反应.结论 已成功克隆并在毕赤酵母中表达了猪IFNα基因,为进一步研究其生物学性状奠定了基础.
作者：李鹏飞；李明；程健；李伟伟；马鸣潇；张蕾 刊期： 2010年第04期
目的 建立人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)快速定量ELISA检测方法,并进行验证及初步应用.方法 以兔抗人HNL多克隆抗体为包被抗体,HRP标记的HNL单克隆抗体为检测抗体,采用双抗体夹心模式,建立快速、一步定量检测HNL的ELISA方法,并进行验证及初步应用.结果 佳包被抗体工作浓度为1 μg/ml,检测抗体的佳稀释度为1:1 000,标准品浓度在0.1～10 μg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数r＞0.98.经验证,该方法的灵敏度可达0.103 μg/L;检测7.2、3.6和0.9 μg/L浓度的HNL标准品,试验内变异系数分别为5.6%、6.8%和9.8%,试验间变异系数分别为5.7%、6.9%和10.5%;不同浓度的平均回收率为102.04%;抑制试验表明特异性较强;健全性分析表明,样品稀释倍数对该方法无影响;8 d连续检测表明稳定性良好.用建立的方法检测30份健康成人血清的HNL含量为(90.73±30.12)μg/L.结论 已建立了HNL快速定量ELISA检测方法,该方法简便、快速、稳定,适合临床常规检测.
作者：王红梅；贾芙蓉；盛岩；井伟东；李勇 刊期： 2010年第04期
Exosomes是由细胞多囊体形成的一种膜性小囊泡,其来源十分广泛.Exosomes的功能初被认为仅仅是降解内吞物质,但经多年来的研究发现,exosomes的特异功能与其来源细胞密切相关.其携带多种独特的蛋白,如黏附蛋白、热休克蛋白等,它们在信号传导中起重要作用.由于exosomes能够传递抗原给T细胞,使其在免疫系统中也具有重要作用,可作为一种免疫治疗的新手段,应用于肿瘤治疗和免疫耐受等方面.本文主要对exosomes诱导抗肿瘤免疫应答和免疫抑制两方面的功能机制作一综述.
作者：朱磊；李响；刘朋飞 刊期： 2010年第04期
目的 建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法.方法 参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测.结果 所建立的CSBV RT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,低可检出10 pg DNA.临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带.结论 已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础.
作者：马呜潇；李明；袁春颖；李鹏飞；张轶博；苏玉虹；曲祖乙 刊期： 2010年第04期
目的 构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)基因的重组逆转录病毒,并检测其对小鼠的免疫效果.方法 酶切含狂犬病病毒SRV9株GP基因的质粒pVAX-G,将其克隆至逆转录病毒载体,构建霞组质粒pLNCX-G,以脂质体介导转染包装细胞系PA317,筛选阳性细胞克隆并扩大培养.将病毒颗粒感染BHK细胞,采用PCR和RT-PCR法检测GP基因在细胞中的整合及转录,在NIH3T3细胞上测定病毒滴度.以重组逆转录病毒免疫昆明小鼠,通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体效价.结果 所构建的重组质粒pLNCX-G经酶切鉴定正确;狂犬病病毒GP基因已整合至BHK细胞基因组中并能正常转录;病毒滴度高可达1.2×10~4 CFU/ml;肌肉和腹腔注射均可使部分小鼠产生抗狂犬病病毒中和抗体,其阳转率分别为6.7%和86.7%,有效保护率分别为0和76.9%.结论 已成功构建了狂犬病病毒SRV9株GP基因的重组逆转录病毒,并可诱导小鼠产生一定的中和抗体,为进一步研究奠定了基础.
作者：赵娜；张守峰；胡永浩；包世俊；王颖；张菲；刘晔；扈荣良 刊期： 2010年第04期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
