李懿；宁海京；张冲；支惠；陈明；宋冬梅；马淑花；赵敏；王红燕；石慧颖；沈心亮
目的 观察1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗诱导CD8+T细胞对病理性CD4+T细胞的抑制作用.方法 用1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠,并同时设立噬菌体空载体免疫组和未免疫空白对照组.于初次免疫后第20周,检测各组小鼠血糖;磁珠法分离免疫小鼠CD8+T细胞,并用合成反义肽及IL-2诱导刺激作为效应细胞;分离噬菌体空载体免疫组和空白对照组小鼠CD4+T细胞,用合成正义肽及IL-2诱导刺激作为靶细胞.将效应细胞与靶细胞按不同比例混合,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL的杀伤活性.结果 初次免疫后第20周,1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组小鼠血糖水平保持正常,而另外2组小鼠血糖均高于正常水平.1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗免疫组诱导的CD8+T细胞作效应细胞,当效靶比为100∶1时,对噬菌体空载体免疫组CD4+T细胞的杀伤效率高,达47.95%±11.30%,而噬菌体空载体免疫组诱导的小鼠CD8+T细胞对空白对照组的CD4+T细胞无杀伤作用.结论 1型糖尿病反义肽噬菌体疫苗能够诱导CD8+T细胞抑制病理性CD4+T细胞.
作者：胡凝珠；王海漩；胡云章 刊期： 2009年第08期
目的 克隆并表达乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3编码区的基因片段,为重组蛋白进一步的功能研究奠定基础.方法 提取乙脑病毒SA14-14-2株总RNA,用RT-PCR法扩增NS3-1、NS3-2基因片段,克隆入原核表达载体pET15bTAT中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,IPTG诱导表达.表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定.结果 重组原核表达质粒pET15bTAT-NS3-1和pET15bTAT-NS3-2经酶切证明构建正确.表达的重组蛋白相对分子质量约为27 000和20 000,主要以包涵体的形式表达.重组蛋白纯化后纯度可达80%以上,并可被小鼠抗乙型脑炎病毒SA14-14-2株血清识别.结论 已成功克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3-1和NS3-2基因,并在大肠杆菌Rosetta2中获得表达.
作者：叶琳；张鹏艳；郑庆纹；姚亚夫 刊期： 2009年第08期
感染性疾病是病原体与宿主相瓦作用的结果.了解病原体与宿主相互作用的分子基础,对于感染性疾病的预防和控制尤为重要.噬菌体展示技术不仅广泛应用于抗原表位作图和抗体工程技术,而且还可用于研究蛋白质与配体的相互作用,以揭示感染过程中蛋白与配体的相互作用机制.本文仅就噬菌体展示技术及其在感染性疾病中的应用作一综述.
作者：冯烨；涂长春 刊期： 2009年第08期
目的 建立RNA干扰结肠癌SW480细胞系,并对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)双向凝胶电泳中的多个关键步骤进行优化,以消除横向拖尾.方法 以携带针对HIF-1α两条干扰片段的pGenesil-11质粒转染SW480细胞,沉默HIF-1α.对双向凝胶电泳中样品裂解液、样品的处理方式、上样量及电泳条件等进行优化.结果 转染第7天RNA干扰效果好.RNA干扰后,SW480细胞蛋白用含有硫脲的裂解液B进行提取,以样品制备疗法A进行处理后,上样200 μg蛋自,延长除盐时间,聚焦50 000伏小时,得到的双向凝胶电泳图基本没有横向拖尾,分离蛋白点1 288±15.结论 已成功建立了RNA干扰结肠癌SW480细胞系;优化的双向凝胶电泳可有效消除横向拖尾,为进一步分析、鉴定和寻找与疾病相关的蛋白质奠定了基础.
作者：吴星烨；傅仲学；李明洋；王学虎 刊期： 2009年第08期
目的 观察Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的接种反应及免疫效果.方法 选择乙脑低发区黑龙江省肇源县8月龄～10岁常住健康儿童为观察对象,按照免疫程序分别接种辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗(A组:水针剂型;B组:冻干剂型)和市售乙脑灭活疫苗(对照组),观察接种后的不良反应,并采用蚀斑减少中和试验(PRNT)法检测血清乙脑中和抗体.结果 A、B组疫苗的总不良反应率为2.81%,对照组为6.63%,3组均未出现严重不良反应,发热反应以轻度为主,局部不良反应较轻微,72 h后全部消失.免疫后血清中和抗体阳转率A组为93.3%,B组为90.4%,对照组为81.8%;GMTA组为1:24.0,B组为1:21.8,对照组为1:15.4.A组、B组的中和抗体阳转率和GMT均显著高于对照组,差异有统计学意义,3组之间中和抗体滴度的分布差异无统计学意义.结论 辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗不良反应率低,免疫效果良好.
作者：周荔葆；赵新；吴栩涛；王立刚；廖晖；刘苗苗；殷建文；万艾玲；甄祖刚 刊期： 2009年第08期
目的 制备重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)喷雾剂,并分析其药效性能.方法 以复合稳定剂维持主药生物稳定性,加入吸收促进剂,以5种配方制备rhGM-CSF液体喷雾剂,并对其进行主要质量指标、稳定性检测及动物药效学试验.结果 以优选的制剂配方配制的rhGM-CSF喷雾剂各项主要质量指标均合格,且稳定性良好.动物药效学试验结果显示,此喷雾剂与抗病毒药物联合使用,抵抗流感病毒感染的效果更好,且具有抗单纯疱疹病毒感染和抗白色念珠菌感染的作用.结论 所制备的rhGM-CSF喷雾剂药效良好,具有临床应用价值.
作者：王妍；刘莉萍；陈献雄；李云富；吴歧；田建明；李龙云 刊期： 2009年第08期
目的 制备抗人类共激活蛋白(CLP)单克隆抗体,并进行纯化.方法 配制2×DMEM培养基,与等量的2.2%甲基纤维素溶液混合,加入HAT、胎牛血清等,配成半固体HAT选择性细胞培养基.用基因重组人CLP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤NS-2细胞融合后,直接在半固体培养基上克隆化培养,筛选可持续、稳定、高效分泌抗CLP单克隆抗体的杂交瘤细胞株.对分泌的单抗进行鉴定后,制备小鼠腹水,经DEAE离子交换柱纯化,半饱和硫酸铵沉淀,G25凝胶过滤除盐.结果 共筛选出14株分泌抗CLP单抗的杂交瘤细胞,其培养上清可与相对分子质量约16 000的CLP抗原结合,抗体类型为鼠IgGa1型.多数克隆分泌的抗体相对亲和力大于1∶20 000,14株克隆分泌的单抗分别对应3个抗原结合位点.纯化后的单抗纯度接近95%.结论 已成功制备并纯化了抗人CLP单克隆抗体,为建立CLP免疫学检测方法奠定了基础.
作者：蔡豪斌；王丽兰；何雨；詹庭芳；阳艳华；Eng-Shang Huang 刊期： 2009年第08期
目的 探讨Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性.方法 用Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分别以0.01、0.1和1 MOI接种Veto细胞,进行传代培养,共传13代.采用微量细胞病变法测定病毒滴度;双抗体夹心法测定D抗原含量;免疫Wister大鼠,采用微量中和试验测定病毒的免疫原性.结果 Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在Vero细胞上连续传13代,病毒滴度基本稳定;D抗原含量呈下降趋势;免疫原性下降迅速.结论 用Sabin株脊髓灰质炎病毒制备灭活疫苗,在Vero细胞上传代的代次越低越好.
作者：李懿；宁海京；张冲；支惠；陈明；宋冬梅；马淑花；赵敏；王红燕；石慧颖；沈心亮 刊期： 2009年第08期
目的 建立鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,并制备高滴度的MMV,为生物制品病毒清除/灭活工艺的验证奠定基础.方法 通过分析NB324K细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立MMV病毒滴度测定的半数细胞感染剂量法(CCID50),并分析其精密性;以A9细胞制备MMV,分析感染复数(MOI)、收获时间及收获样本对病毒滴度的影响,并检测病毒的稳定性.结果 NB324K细胞的佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为5×103个/孔、48 h及2 h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为10时,感染后48 h收获,病毒滴度高.制备的病毒液的平均滴度为8.69 CCID50/ml,4℃和37℃保存7 d及反复冻融5次,稳定性良好.结论 已建立了MMV感染性滴度测定方法,并制备了高滴度的病毒,为以MMV为指示病毒进行病毒清除/灭活工艺验证奠定了基础.
作者：孟淑芳；林林；冯建平；李修兰；王佑春；李德富 刊期： 2009年第08期
目的 筛选旋毛虫新生幼虫表达的可与宿主肌细胞染色体DNA结合的相关蛋白基因,寻找旋毛虫侵入及寄生过程中与宿主肌细胞发生结合的相关蛋白,为研究寄生虫与宿主间的信号转导、侵袭及长期寄生机制奠定基础.方法 利用噬菌体展示技术构建旋毛虫新生幼虫17噬菌体展示cDNA文库,用小鼠肌肉染色体DNA对展示文库进行筛选,随机挑选30个阳性克隆,进行PCR鉴定、测序分析和编码蛋白二级结构及翻译后修饰预测.结果 旋毛虫新生幼虫T7噬菌体展示cDNA文库的原始文库库容量为2×105pfu,重组率为98%,95%的插入片段长度在250～2 000 bp之间,扩增后文库滴度为3×1012 pfu/ml.对经4轮筛选后的克隆进行PCR鉴定及测序,获得13个基因序列,其中有4个(DN14、DN24、DN9及DN23)为旋毛虫新生幼虫DNA结合相关蛋白基因,分别与旋毛虫未知蛋白及假定ORF11.30、旋毛虫nudix水解酶及血吸虫SJCHGC05997蛋白、秀丽新杆线虫未知蛋白和旋毛虫TGF-β配基具有同源性.经编码蛋白质二级结构及翻译后修饰预测,这4种蛋白可能与旋毛虫包囊形成和寄生虫与宿主间信号转导有关.结论 已成功构建了旋毛虫新生幼虫17噬菌体展示cDNA文库,并利用小鼠肌肉染色体DNA筛选出4个可用于研究旋毛虫包囊形成及与宿主间信号转导机制的候选基因.
作者：吴秀萍；邓洪宽；刘相叶；于录；王学林；Boireau Pascal；刘明远 刊期： 2009年第08期
目的 优化C群和W135群脑膜炎球菌的发酵工艺,提高荚膜多糖产量.方法 在5L发酵罐中,通过调整溶氧(DO)、pH值、培养温度、葡萄糖补料速率等参数,了解C群和W135群脑膜炎球菌在发酵过程中的代谢规律,优化发酵工艺,并将C群脑膜炎球菌在100 L发酵罐中放大发酵.结果 在发酵过程中,DO在20%～40%范围内对多糖合成无明显影响;在pH 6.6左右,培养温度37℃,有利于多糖合成;发酵中间补加葡萄糖可增加多糖合成,低速补糖较高速补糖更有利于多糖合成.C群脑膜炎球菌在100 L罐中放大发酵,多糖产量可达5 L罐水平.结论 通过参数优化,确定了C群和W135群脑膜炎球菌的佳发酵工艺.
作者：江元翔；荣家康；朱为 刊期： 2009年第08期
目的 探讨结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对不同分枝杆菌致敏动物的鉴别作用.方法 以不同分枝杆菌分别致敏豚鼠,致敏成功后,每只豚鼠皮内分别注射结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD).用双盲法记录注射后24和48 h注射局部硬结的纵径和横径,计算其均值.结果 PPD对结核分枝杆菌活菌、死菌和卡介苗致敏豚鼠的皮肤反应均为阳性,局部硬结直径分别为(13.91±1.04)mm、(13.11±1.40)mm和(13.16±1.43)mm.结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮肤反应为强阳性(≥10mm),局部硬结直径为(10.53±2.66)mm;对结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮肤反应为弱阳性(≤5 mm)或阴性,局部硬结直径为(1.61±1.39)mm;对卡介苗致敏豚鼠的皮肤反应为阴性,局部硬结直径为0.结论 结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白可鉴别结核分枝杆菌活菌、死菌和卡介苗致敏动物.
作者：都伟欣；陈保文；徐苗；王国治 刊期： 2009年第08期
目的 观察大流行流感疫苗生产用毒种(NIBRG-14,E2代)的传代稳定性,为制定毒种传代限定次数提供依据.方法 毒种通过SPF鸡胚传代,检测不同代次毒种的生物学指标,并对传代后的遗传稳定性指标,即关键基因(血凝素和神经氨酸酶)和其他基因进行测序分析.结果 毒种经连续传代至E12代,各项生物学指标均保持良好的稳定性,E3～E12代病毒感染性滴度均不低于8.54 lg EID50/ml,血凝滴度均不低于1∶256,E3、E4及E12代病毒间的HA基因序列均保持一致,基因中被删除的高致病区域的核苷酸序列保持稳定,NA等基因序列在传代过程中也保持一致.结论 大流行流感疫苗生产用毒种(NIBRG-14,E2代)连续传10代(至E12代),其生物学和遗传稳定性良好.
作者：邵铭；高强；张振山；刘玉芬；刘书珍；李长贵；方捍华 刊期： 2009年第08期
目的 探讨多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物对小鼠免疫应答的影响.方法 分别用单一载体(破伤风类毒素)和混合载体(破伤风类毒索和白喉类毒素)作为多糖结合物的载体蛋白,制备5～9价肺炎链球菌荚膜多糖结合物,免疫NIH小鼠,采用间接ELISA法测定免疫小鼠血清中抗荚膜多糖特异性IgG抗体水平.结果 多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫效果优于相应的单价结合物;随着结合物配制价数的增高,小鼠的免疫应答能力趋于下降;多价结合物中使用两种载体能缓解此现象,但载体含量过高时,依然会抑制免疫应答.结论 多价肺炎链球菌荚膜多糖结合物免疫小鼠后,随着载体剂量的增高,会出现载体诱导的表位抑制现象,使小鼠的免疫应答反应减弱.两种载体蛋白同时使用能缓解此现象.
作者：任克明；陈晓航；张轶；刘爱萍；陈美华；王剑虹；沈荣 刊期： 2009年第08期
目的 采用高效液相色谱法测定静脉注射犬血免疫球蛋白中的麦芽糖含量.方法 采用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色谱柱(300 mm×7.8 mm,8μm),流动相为0.004 mol/L硫酸溶液,流速为0.8 ml/min,柱温50℃;将麦芽糖含量与其峰面积进行直线回归,建立标准曲线;样品经磺基水杨酸处理后进样,根据峰面积计算麦芽糖含量.结果 该方法的标准曲线相关性良好,r=0.999 68,精密性检测RSD为0.35%,回收率为99.58%.结论 高效液相色谱法快速、准确、回收率高,适用于检测静脉注射犬血免疫球蛋白的麦芽糖含量.
作者：刘明；王蕊；章金刚 刊期： 2009年第08期
A群链球菌(GAS)是人类细菌感染常见的病原菌之一,其疫苗的研发仍是尚未解决的难题.本文介绍了目前GAS疫苗研发的不同策略,并重点阐述了M蛋白多肽疫苗的新研究进展.
作者：喻刚；董太明；全家妩 刊期： 2009年第08期
目的 原核表达并纯化牛布鲁菌L7/L12蛋白.方法 提取牛布鲁菌S19基因组DNA,PCR法扩增L7/L12基因,经测序正确后,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-L7/L12,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.SDS-PAGE分析目的 蛋白的表达形式及表达量,经亲和层析纯化后,Western blot鉴定纯化产物.结果 所构建的重组原核表达质粒pET-L7/L12经酶切鉴定表明构建正确.重组蛋白以包涵体形式表达,表达量占全菌总蛋白的33%;纯化的重组蛋白纯度可达94%,可与布鲁菌小鼠免疫血清发生特异反应.结论 已成功表达并纯化了牛布鲁菌L7/L12蛋白,为建立高特异性的新型布鲁菌检测方法奠定了基础.
作者：梁晓英；赵娜；王贤平；郑经成；吴威；闫广谋 刊期： 2009年第08期
目的 检测携带口蹄疫病毒(FMDV)Asia-1型P1-2A-IL18基因和O型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒疫苗诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力.方法 将重组鸡痘病毒vUTAL-P1-2A-IL18-P1-2A-3C、w-FPv和PBS分别经肌肉注射免疫豚鼠,检测豚鼠脾T淋巴细胞亚群数量、特异性CTL细胞杀伤活性和血清中抗FMDV特异性抗体水平.结果 重组鸡痘病毒免疫豚鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群数量和特异性CTL细胞杀伤活性均显著高于w-FPV和PBS对照组,且能产生抗O型和Asia-Ⅰ型FMDV特异性抗体.结论 二价重组鸡痘病毒口蹄疫疫苗能诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫.
作者：谷长维；金宁一；李太元；李昌；田明尧；马鸣潇；霍晓伟；常巧呈；于长勇 刊期： 2009年第08期
目的 建立牛血清中牛腹泻病毒(BVDV)的牛肾细胞直接病变检测法.方法 将样品接种至牛肾(CK)细胞上,通过观察细胞病变,判定样品是否污染BVDV.结合病毒增殖曲线及不同培养时间的检出率,确定佳判定时间,并对检测方法进行验证及应用.结果 该方法的佳判定时间为10 d;测定限度为100～240 CCID50/ml;样品冻融次数及不同批次的牛血清样品对试验结果影响较大;应用该方法检测134批牛血清样品,BVDV污染率约为7.5%.结论 已建立牛血清中牛腹泻病毒牛肾细胞直接病变检测法.
作者：陈波；徐程林；董小曼；陈秀珍；朱芮波 刊期： 2009年第08期
目的 建立羊布鲁菌双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证.方法 应用针对羊布鲁菌O链M抗原的种特异性单克隆抗体,建立检测羊布鲁菌抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行重复性、特异性、敏感性验证及初步应用.结果 经验证,该方法重复性好,特异性强,低检出限为3.0×103 CFU/ml,与平板凝集试验的符合率为100%.结论 已建立了特异、敏感的检测羊布鲁菌的双抗体夹心ELISA方法.
作者：梅建军；王兴龙；李晓燕；刘锴；任林柱；贾剑锋；张琴 刊期： 2009年第08期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
