李懿；宁海京；张冲；支惠；陈明；宋冬梅；马淑花；赵敏；王红燕；石慧颖；沈心亮
目的 构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体原核表达质粒,并进行表达和生物学特性鉴定.方法 利用SWISS-PROT软件分析抗TNF-α单链抗体(scFv)的结构,并结合二硫键稳定的单链抗体(ds-scFv)的突变位点设计原则,确定其突变位点,采用PCR定点突变的方法,构建二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的表达质粒pGEX-4T-1-ds-scFv,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)对表达的目的蛋白进行可溶性纯化,并进行抗原结合活性、相对稳定性及细胞毒中和活性检测.结果 重组表达质粒pGEx4T-1-ds-scFv经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确.抗TNF-α的ds-scFv的表达量占菌体总蛋白的16.6%,主要以包涵体形式表达;纯化的目的 蛋白纯度可达94.4%;经ELISA及Western blot验证,ds-scFv与TNF-α抗原的结合活性与scFv相近;相对稳定性优于scFv;在同样的抗体浓度下,scFv和ds-scFv的细胞毒中和活性略低于亲本鼠单抗,ds-scFv略高于scFv.结论 已成功构建了二硫键稳定的抗TNF-α单链抗体的原核表达质粒,并获得有活性的目的 蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.
作者：凌媛；徐静；许丽锋；崔文禹；李媛媛；李树香 刊期： 2009年第08期
目的 制备重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)喷雾剂,并分析其药效性能.方法 以复合稳定剂维持主药生物稳定性,加入吸收促进剂,以5种配方制备rhGM-CSF液体喷雾剂,并对其进行主要质量指标、稳定性检测及动物药效学试验.结果 以优选的制剂配方配制的rhGM-CSF喷雾剂各项主要质量指标均合格,且稳定性良好.动物药效学试验结果显示,此喷雾剂与抗病毒药物联合使用,抵抗流感病毒感染的效果更好,且具有抗单纯疱疹病毒感染和抗白色念珠菌感染的作用.结论 所制备的rhGM-CSF喷雾剂药效良好,具有临床应用价值.
作者：王妍；刘莉萍；陈献雄；李云富；吴歧；田建明；李龙云 刊期： 2009年第08期
目的 克隆并表达乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3编码区的基因片段,为重组蛋白进一步的功能研究奠定基础.方法 提取乙脑病毒SA14-14-2株总RNA,用RT-PCR法扩增NS3-1、NS3-2基因片段,克隆入原核表达载体pET15bTAT中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,IPTG诱导表达.表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后,进行Western blot鉴定.结果 重组原核表达质粒pET15bTAT-NS3-1和pET15bTAT-NS3-2经酶切证明构建正确.表达的重组蛋白相对分子质量约为27 000和20 000,主要以包涵体的形式表达.重组蛋白纯化后纯度可达80%以上,并可被小鼠抗乙型脑炎病毒SA14-14-2株血清识别.结论 已成功克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS3-1和NS3-2基因,并在大肠杆菌Rosetta2中获得表达.
作者：叶琳；张鹏艳；郑庆纹；姚亚夫 刊期： 2009年第08期
目的 检测携带口蹄疫病毒(FMDV)Asia-1型P1-2A-IL18基因和O型P1-2A-3C基因的重组鸡痘病毒疫苗诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的能力.方法 将重组鸡痘病毒vUTAL-P1-2A-IL18-P1-2A-3C、w-FPv和PBS分别经肌肉注射免疫豚鼠,检测豚鼠脾T淋巴细胞亚群数量、特异性CTL细胞杀伤活性和血清中抗FMDV特异性抗体水平.结果 重组鸡痘病毒免疫豚鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群数量和特异性CTL细胞杀伤活性均显著高于w-FPV和PBS对照组,且能产生抗O型和Asia-Ⅰ型FMDV特异性抗体.结论 二价重组鸡痘病毒口蹄疫疫苗能诱导豚鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫.
作者：谷长维；金宁一；李太元；李昌；田明尧；马鸣潇；霍晓伟；常巧呈；于长勇 刊期： 2009年第08期
目的 探讨结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对不同分枝杆菌致敏动物的鉴别作用.方法 以不同分枝杆菌分别致敏豚鼠,致敏成功后,每只豚鼠皮内分别注射结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD).用双盲法记录注射后24和48 h注射局部硬结的纵径和横径,计算其均值.结果 PPD对结核分枝杆菌活菌、死菌和卡介苗致敏豚鼠的皮肤反应均为阳性,局部硬结直径分别为(13.91±1.04)mm、(13.11±1.40)mm和(13.16±1.43)mm.结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白对结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮肤反应为强阳性(≥10mm),局部硬结直径为(10.53±2.66)mm;对结核分枝杆菌死菌致敏豚鼠的皮肤反应为弱阳性(≤5 mm)或阴性,局部硬结直径为(1.61±1.39)mm;对卡介苗致敏豚鼠的皮肤反应为阴性,局部硬结直径为0.结论 结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白可鉴别结核分枝杆菌活菌、死菌和卡介苗致敏动物.
作者：都伟欣；陈保文；徐苗；王国治 刊期： 2009年第08期
目的 观察脂多糖(LPS)刺激对小鼠腹腔巨噬细胞高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的影响.方法 取正常Swiss小鼠腹腔巨噬细胞.以LPS分别刺激4、8、12、18、24和36 h后,RT-PCR法检测小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1基因mRNA的转录水平,Western blot法检测HMGB1蛋白的表达水平,观察LPS刺激与HMGB1释放的时效关系.结果 LPS刺激后4～18 h,细胞内HMGB1基因mRNA的转录水平无明显变化,24 h开始明显增强,刺激24 h和36 h与对照组相比,差异有统计学意义,HMGB1蛋白在LPS刺激后18 h开始表达明显增加,并一直持续至36 h.结论 LPS可促进小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1的表达,并具有时间依赖性.
作者：易世红；孙陆果；魏成国；黄红兰 刊期： 2009年第08期
目的 观察大流行流感疫苗生产用毒种(NIBRG-14,E2代)的传代稳定性,为制定毒种传代限定次数提供依据.方法 毒种通过SPF鸡胚传代,检测不同代次毒种的生物学指标,并对传代后的遗传稳定性指标,即关键基因(血凝素和神经氨酸酶)和其他基因进行测序分析.结果 毒种经连续传代至E12代,各项生物学指标均保持良好的稳定性,E3～E12代病毒感染性滴度均不低于8.54 lg EID50/ml,血凝滴度均不低于1∶256,E3、E4及E12代病毒间的HA基因序列均保持一致,基因中被删除的高致病区域的核苷酸序列保持稳定,NA等基因序列在传代过程中也保持一致.结论 大流行流感疫苗生产用毒种(NIBRG-14,E2代)连续传10代(至E12代),其生物学和遗传稳定性良好.
作者：邵铭；高强；张振山；刘玉芬；刘书珍；李长贵；方捍华 刊期： 2009年第08期
目的 建立鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,并制备高滴度的MMV,为生物制品病毒清除/灭活工艺的验证奠定基础.方法 通过分析NB324K细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立MMV病毒滴度测定的半数细胞感染剂量法(CCID50),并分析其精密性;以A9细胞制备MMV,分析感染复数(MOI)、收获时间及收获样本对病毒滴度的影响,并检测病毒的稳定性.结果 NB324K细胞的佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为5×103个/孔、48 h及2 h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为10时,感染后48 h收获,病毒滴度高.制备的病毒液的平均滴度为8.69 CCID50/ml,4℃和37℃保存7 d及反复冻融5次,稳定性良好.结论 已建立了MMV感染性滴度测定方法,并制备了高滴度的病毒,为以MMV为指示病毒进行病毒清除/灭活工艺验证奠定了基础.
作者：孟淑芳；林林；冯建平；李修兰；王佑春；李德富 刊期： 2009年第08期
目的 观察Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的接种反应及免疫效果.方法 选择乙脑低发区黑龙江省肇源县8月龄～10岁常住健康儿童为观察对象,按照免疫程序分别接种辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗(A组:水针剂型;B组:冻干剂型)和市售乙脑灭活疫苗(对照组),观察接种后的不良反应,并采用蚀斑减少中和试验(PRNT)法检测血清乙脑中和抗体.结果 A、B组疫苗的总不良反应率为2.81%,对照组为6.63%,3组均未出现严重不良反应,发热反应以轻度为主,局部不良反应较轻微,72 h后全部消失.免疫后血清中和抗体阳转率A组为93.3%,B组为90.4%,对照组为81.8%;GMTA组为1:24.0,B组为1:21.8,对照组为1:15.4.A组、B组的中和抗体阳转率和GMT均显著高于对照组,差异有统计学意义,3组之间中和抗体滴度的分布差异无统计学意义.结论 辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗不良反应率低,免疫效果良好.
作者：周荔葆；赵新；吴栩涛；王立刚；廖晖；刘苗苗；殷建文；万艾玲；甄祖刚 刊期： 2009年第08期
目的 优化C群和W135群脑膜炎球菌的发酵工艺,提高荚膜多糖产量.方法 在5L发酵罐中,通过调整溶氧(DO)、pH值、培养温度、葡萄糖补料速率等参数,了解C群和W135群脑膜炎球菌在发酵过程中的代谢规律,优化发酵工艺,并将C群脑膜炎球菌在100 L发酵罐中放大发酵.结果 在发酵过程中,DO在20%～40%范围内对多糖合成无明显影响;在pH 6.6左右,培养温度37℃,有利于多糖合成;发酵中间补加葡萄糖可增加多糖合成,低速补糖较高速补糖更有利于多糖合成.C群脑膜炎球菌在100 L罐中放大发酵,多糖产量可达5 L罐水平.结论 通过参数优化,确定了C群和W135群脑膜炎球菌的佳发酵工艺.
作者：江元翔；荣家康；朱为 刊期： 2009年第08期
目的 筛选旋毛虫新生幼虫表达的可与宿主肌细胞染色体DNA结合的相关蛋白基因,寻找旋毛虫侵入及寄生过程中与宿主肌细胞发生结合的相关蛋白,为研究寄生虫与宿主间的信号转导、侵袭及长期寄生机制奠定基础.方法 利用噬菌体展示技术构建旋毛虫新生幼虫17噬菌体展示cDNA文库,用小鼠肌肉染色体DNA对展示文库进行筛选,随机挑选30个阳性克隆,进行PCR鉴定、测序分析和编码蛋白二级结构及翻译后修饰预测.结果 旋毛虫新生幼虫T7噬菌体展示cDNA文库的原始文库库容量为2×105pfu,重组率为98%,95%的插入片段长度在250～2 000 bp之间,扩增后文库滴度为3×1012 pfu/ml.对经4轮筛选后的克隆进行PCR鉴定及测序,获得13个基因序列,其中有4个(DN14、DN24、DN9及DN23)为旋毛虫新生幼虫DNA结合相关蛋白基因,分别与旋毛虫未知蛋白及假定ORF11.30、旋毛虫nudix水解酶及血吸虫SJCHGC05997蛋白、秀丽新杆线虫未知蛋白和旋毛虫TGF-β配基具有同源性.经编码蛋白质二级结构及翻译后修饰预测,这4种蛋白可能与旋毛虫包囊形成和寄生虫与宿主间信号转导有关.结论 已成功构建了旋毛虫新生幼虫17噬菌体展示cDNA文库,并利用小鼠肌肉染色体DNA筛选出4个可用于研究旋毛虫包囊形成及与宿主间信号转导机制的候选基因.
作者：吴秀萍；邓洪宽；刘相叶；于录；王学林；Boireau Pascal；刘明远 刊期： 2009年第08期
目的 对肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因进行核苷酸序列分析,了解该毒种的基因稳定性.方法 根据汉坦病毒标准株设计特异的PCR引物,用RT-PCR技术分段扩增疫曲株84FLi株的M和S基因片段,PCR产物纯化后直接测序,并进行遗传进化分析.结果 疫苗株84FLi株M基因片段的核苷酸序列与GenBank中收录的HTN型毒株的M基因核苷酸序列的同源性为83.5%～99.9%,而与SEO型毒株的同源性为70.2%～72.0%.其S基因与HTN型毒株的同源性为85.9%～99.6%,与SEO型毒株的同源性为69.4%～70.8%.疫苗株84FLi株的M和S基因的氨基酸序列与GenBank中收录的HTN型汉坦病毒84FLi株M和S基因的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和99.5%.从遗传进化树上可以看出,疫苗株84FLi株与GenBank中收录的84FLi株位于一个独立的分支上,与其他HTN型病毒亚型分布于不同分支上,与其他HTN型病毒亚型亲缘关系较远.结论 肾综合征出血热灭活疫苗毒株84FLi株M和S基因片段的核苷酸和氨基酸序列末发生较大变异,说明在传代过程中该疫苗株在基因水平上并未发生较大改变.
作者：李静；孔艳；董关木；安祺；杨立宏；周荔葆；俞永新 刊期： 2009年第08期
目的 建立羊布鲁菌双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证.方法 应用针对羊布鲁菌O链M抗原的种特异性单克隆抗体,建立检测羊布鲁菌抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行重复性、特异性、敏感性验证及初步应用.结果 经验证,该方法重复性好,特异性强,低检出限为3.0×103 CFU/ml,与平板凝集试验的符合率为100%.结论 已建立了特异、敏感的检测羊布鲁菌的双抗体夹心ELISA方法.
作者：梅建军；王兴龙；李晓燕；刘锴；任林柱；贾剑锋；张琴 刊期： 2009年第08期
目的 分析1例受检产妇交叉配血不合及患儿新生儿溶血病(HDN)发生的原因,初步探讨产妇Rh缺失型D--形成的遗传背景.方法 对产妇、其夫及患儿标本进行ABO及Rh血型鉴定,对产妇及患儿标本进行血型抗体检测,并对产妇家系作血型调查.结果 产妇为Rh缺失型D--,产生IgG的多凝集抗体.结论 产妇为Rh缺失型D--,产生IgG的多凝集抗体,是造成其交叉配血不合及患儿HDN发生的原因;产妇Rh缺欠型D--形成,有一定遗传因素的影响.
作者：伍伟健；郭如华；丁肖华 刊期： 2009年第08期
免疫增强性重建流感病毒体(IRIV)是重建的流感病毒囊膜,其保持了由病毒囊膜糖蛋白血凝素介导的天然病毒的细胞结合及膜融合特性,但缺乏病毒遗传物质.越来越多的证据表明,IRIV可作为佐剂、流感疫苗及抗原呈递载体,在疫苗的研究中发挥重要作用.本文就IRIV作为佐剂、流感疫苗和抗原呈递载体的应用进展作一综述.
作者：郑玉姝；刘红亮；赵朴 刊期： 2009年第08期
目的 制备癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体,并进行鉴定.方法 以大肠杆菌表达的MBP/OY-TES-1融合蛋白作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗血清.经蛋白A凝胶纯化后,采用ELISA法检测抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体的特异性.结果 制备的抗血清经ELISA检测,效价不低于1∶128 000,纯化后,其效价不低于1∶8 000.Western blot显示,抗OY-TES-1多抗可与MBP/OY-TES-1融合蛋白、MBP、OY-TES-1重组蛋白和睾丸组织总蛋白特异性结合;免疫组化检测显示,精子头部呈现阳性反应.结论 已成功制备了效价高、特异性强的癌-睾丸抗原OY-TES-1多克隆抗体,为深入研究OY-TES-1的生物学功能提供了工具.
作者：范蓉；肖绍文；黄巍；罗彬；李颀；徐丽湘；谢小薰 刊期： 2009年第08期
目的 建立牛血清中牛腹泻病毒(BVDV)的牛肾细胞直接病变检测法.方法 将样品接种至牛肾(CK)细胞上,通过观察细胞病变,判定样品是否污染BVDV.结合病毒增殖曲线及不同培养时间的检出率,确定佳判定时间,并对检测方法进行验证及应用.结果 该方法的佳判定时间为10 d;测定限度为100～240 CCID50/ml;样品冻融次数及不同批次的牛血清样品对试验结果影响较大;应用该方法检测134批牛血清样品,BVDV污染率约为7.5%.结论 已建立牛血清中牛腹泻病毒牛肾细胞直接病变检测法.
作者：陈波；徐程林；董小曼；陈秀珍；朱芮波 刊期： 2009年第08期
目的 研究次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)修饰的树突状细胞(DC)对T淋巴细胞增殖和分化的影响.方法 用携带人6Ckine基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-6Ckine)感染人外周血单个核细胞米源的DC,检测Ad-6Ckine-DC对6Ckine的表达及细胞因子分泌的影响,并观察其吞噬功能和表型的变化及对自身T淋巴细胞的趋化作用.用结肠癌LoVo细胞抗原致敏Ad-6Ckine-DC,将该DC与自身T淋巴细胞共同培养,分别用3H掺入法、RT-PCR和ELISA检测Ad-6Ckine-DC对T淋巴细胞增殖和分化的影响.结果 在Ad-6Ckine转染后24 h内,DC的吞噬功能几乎不受影响.转染的6Ckine基因能在DC中表达,表达的6Ckine能促进其表达CD83和CCR7,上调RANTES的表达.Ad-6Ckine-DC对自身T淋巴细胞有明显的趋化作用,抗原致敏的Ad-6Ckine-DC能显著促进T淋巴细胞的增殖,并增强其表达T-bet和IL-2的能力.结论 6Ckine基因的修饰能在一定程度上促进DC的成熟,并募集T淋巴细胞于DC周围,有利于DC向T淋巴细胞传递抗原和第二信息,增强DC促进T淋巴细胞增殖的作用并使其向Th1分化,诱导细胞免疫,将成为制备肿瘤疫苗的一种良好选择.
作者：薛刚；程莹；王培红；曹永宽；田伏洲；黄文林 刊期： 2009年第08期
A群链球菌(GAS)是人类细菌感染常见的病原菌之一,其疫苗的研发仍是尚未解决的难题.本文介绍了目前GAS疫苗研发的不同策略,并重点阐述了M蛋白多肽疫苗的新研究进展.
作者：喻刚；董太明；全家妩 刊期： 2009年第08期
目的 原核表达并纯化牛布鲁菌L7/L12蛋白.方法 提取牛布鲁菌S19基因组DNA,PCR法扩增L7/L12基因,经测序正确后,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-L7/L12,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.SDS-PAGE分析目的 蛋白的表达形式及表达量,经亲和层析纯化后,Western blot鉴定纯化产物.结果 所构建的重组原核表达质粒pET-L7/L12经酶切鉴定表明构建正确.重组蛋白以包涵体形式表达,表达量占全菌总蛋白的33%;纯化的重组蛋白纯度可达94%,可与布鲁菌小鼠免疫血清发生特异反应.结论 已成功表达并纯化了牛布鲁菌L7/L12蛋白,为建立高特异性的新型布鲁菌检测方法奠定了基础.
作者：梁晓英；赵娜；王贤平；郑经成；吴威；闫广谋 刊期： 2009年第08期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
