学术投稿

煮沸裂解法和试剂盒法提取浸矿菌基因组DNA的比较

夏乐先;孙文娟;沈振;梁昱婷;柳建设;陈建华;邱冠周

关键词:煮沸裂解法, 试剂盒法, 浸矿细菌, 聚合酶链反应, 实时荧光定量PCR
摘要:目的:在生物浸出中,微生物群落结构分析有着重要意义,而群落分析的基础是提取纯度高、损失少的基因组DNA.为了解决这一问题,本实验通过比较两种较常用的DNA提取方法,煮沸裂解法和试剂盒法,寻找一种灵敏、快速、经济实用的制备浸矿细菌基因组DNA的方法.方法:分别用煮沸裂解法和试剂盒法提取6种浸矿菌的基因组DNA,从所提取的基因组DNA浓度、纯度、回收率和对PCR扩增反应的影响方面比较了两种方法的提取效果;用两种方法来处理不同浓度梯度的一种菌,通过实时定量PCR来比较两种方法的灵敏性.结果:相同处理量(108个)的革兰氏阳性菌(1株)、革兰氏阴性菌(4株)、古菌(1株)经两种方法提取的基因组DNA差异较大,煮沸裂解法所得的6组基因组DNA更纯,其OD260/OD280的值更接近1.8-2.0(纯DNA的OD260/OD280在1.8-2.0之间),前者所提DNA回收率大可达后者的16.7倍;煮沸裂解法只需较少菌(102个)便能让实时定量PCR检测到所提DNA模板浓度,比试剂盒法灵敏.结论:两种方法提取的基因组DNA均可用于后续的PCR扩增,此外,前者提取的DNA浓度随细菌浓度增加而呈线性增大,而后者随菌浓度增大,所提DNA量增加有限,因此,在生物浸出中微生物基因组DNA的提取可直接采用简单快速的煮沸提取法,为实验节约成本和时间.
现代生物医学进展杂志相关文献
  • 大黄联合抗生素治疗脑出血合并肺部感染的临床疗效观察

    目的:观察大黄联合抗生素治疗脑出血后肺部感染的临床疗效.方法:96例急性高血压脑出血血肿清除术后并发肺部感染患者随机分为治疗组(56例)和对照组(40例).对照组应用抗生素治疗,治疗组在抗生素治疗的基础上加用大黄6 g,以温开水100 mL调匀后经胃管鼻饲,每日2次,共治疗7天.治疗结束后比较和评价两组的治疗效果效果.结果:治疗组患者肺啰音消失的时间、炎症消散的时间和平均治愈天数分别为3.52± 1.81、10.32± 3.25、10.73±3.26天,较对照组(分别为10.86± 3.43、13.51±2.66、14.73±3.11)均显著缩短,差异有显著统计学意义(P<0.01).治疗组和对照组治疗总有效率分别为94.64%和85%,差异有统计学意义(P<0.05).两组不良反应的发生率比较无统计学差异(P>0.05).结论:大黄联合抗生素治疗脑出血术后合并肺部感染,可缩短治疗时间,提高疗效,且无严重不良反应.

    作者:李宪锋;王宏喻;韩大勇;赵世光 刊期: 2014年第01期

  • 周期性静水压对人软骨细胞活性的时间依赖性影响

    目的:目前软骨细胞体外研究多为动物模型,本研究以正常成人软骨细胞研究对象,探讨在适当强度、类型的周期性静水压下不同持续时间对软骨细胞活性的影响,探究人软骨细胞体外培养、构建组织工程软骨合适的时间参数.方法:将体外培养的正常成人膝关节软骨第3代软骨细胞随机分为4组:4h组、8h组、12h组、对照组.应用高压恒温静水压加压系统,充入含有95%的空气和5%的CO2混合气体,以2 MPa压力大小对3个实验组进行周期性加压,分别每天加压4h、8h、12h,三组加压时间均为10d.10d后倒置相差显微镜下观察4组细胞形态,甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,并对Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色行半定量分析.MTT法分析各组软骨细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:3个实验组细胞增殖均快于对照组(P<0.05),与对照组相比4h组、8h组均抑制凋亡,12h组促进凋亡.12 h组第6代细胞开始细胞形态即逐渐发生改变.结论:软骨细胞的增殖和凋亡水平对静水压的作用时间具有依赖性.在2 MPa静水压力下,8h组更适合细胞生长,细胞活性更强.为进一步构建组织工程软骨人类模型及组织工程软骨的临床应用提供了一定的实验基础.

    作者:肖春;靳雷;王鑫;颜世举;韩康;张开亮;孙聪;裘秀春;范清宇 刊期: 2014年第01期

  • UACR在老年人群中的分布及其与心血管病危险因素的相关性研究

    目的:观察老年人群尿微量白蛋白与尿肌酐比值(UACR)的分布情况,探讨其与心血管病危险因素的相关性.方法:选取2011年5月至2012年11月在我院接受体检的年龄在60岁以上的老年人922名,收集整理上述人群的基本临床资料.通过检测其清晨尿样,分析UACR在老年人群中的分布情况及和其于心血管病危险因素的关系.结果:①问卷调查结果:在接受调查的所有老年人中,有68名为健康人群,有724名为具有不同程度的心血管病危险因素人群.78.52%的老年人存在至少1个或多个心血管病危险因素.在众多心血管病危险因素中,患病率排在前三位的是:血脂异常、高血压和糖尿病.②UACR检测结果:健康人群中,男性UACR显著低于女性,差异有统计学意义(P<0.05);患有高血压,糖尿病和血脂异常人群的UACR显著高于健康人群,差异有统计学意义(P<0.05).结论:尿微量白蛋白与尿肌酐比值(UACR)与老年人群心血管疾病危险因素有着密切的联系,通过检测患者的UACR,为心血管疾病的治疗及预后奠定基础.

    作者:郭丹丹;郭晓东;梁新秀;李强;高晓攀 刊期: 2014年第01期

  • 磁感应热疗联合放疗治疗颈部淋巴结复发的临床观察

    目的:探索磁感应热疗技术联合放疗治疗不宜手术的颈部淋巴结复发的疗效和安全性.方法:2012年2月至2012年7月选取27例不宜手术的颈部淋巴结复发病例,给予2次磁热籽植入和4-8次不等的加热治疗,计划治疗目标温度为48-50℃、维持30min,磁感应治疗后一周内行放射治疗,治疗结束后1-3个月时复查CT,治疗后6月内不予化疗.结果:治疗结束后3个月时,27例患者中CR55.6%,PR37%,NC3.7%,PD3.7%,治疗总有效率为92.6%;25例疼痛缓解,疼痛缓解有效率92.6%.治疗结束后6个月未发现远处转移病例,未发生大出血、放射性食管炎、放射性骨坏死、骨髓抑制、粒子移位脱落等并发症.结论:磁感应热疗联合放疗治疗不宜手术的复发颈部淋巴结安全、有效.

    作者:师颖瑞;刘珈;杨锫;谢冠慧;席许平;王晖 刊期: 2014年第01期

  • 替吉奥治疗结肠癌的研究

    目的:探讨替吉奥治疗结肠癌的疗效.方法:75例经病理组织学确诊的结肠癌患者,分为A、B、C组.A组:替吉奥联合奥沙利铂(艾恒)25例.B组:5-Fu/LV联合奥沙利铂(艾恒)25例.C组:替吉奥单药治疗25例.观察疗效、疾病控制率及不良反应.结果:A组、C组与B组对比,不良反应发生率明显降低.A组有效率48%,疾病控制率88%.B组有效率28%,疾病控制率84%.C组有效率32%,疾病控制率80%.结论:替吉奥是结肠癌辅助化疗联合用药及单药治疗老年结直肠癌较好的治疗药物.

    作者:吴元玉;范恩学;宋佳;王率;贾国梁 刊期: 2014年第01期

  • PBRM1和P21蛋白在子宫内膜癌的表达及意义

    目的:探讨PBRM1和P21蛋白在子宫内膜癌中的表达和临床意义.方法:应用免疫组化方法对105例子宫内膜癌组织进行PBRM1和P21蛋白检测.结果:子宫内膜癌中PBRM1和P21的阳性表达率分别为62.86%和80%;癌旁组织PBRM1和P21阳性表达率分别为45.71%和34.2%,子宫内膜癌组织表达高于癌旁组织(P<0.05);PBRM1和P53阳性表达与组织学类型、浸润深度、淋巴结转移、组织学分级、临床TNM分期相关(P<0.05),与患者年龄无关(P>0.05) PBRM1和P21的表达呈正相关(P<0.05)结论:PBRM1和P21表达水平与子宫内膜癌组织的病理分级和临床分期的增高而增高,对其进行监测对子宫内膜癌的诊断、治疗及预后有指导意义.

    作者:党雅梅;陈城;车团结;郭应芳 刊期: 2014年第01期

  • 体质指数与直肠癌的关系探讨

    目的:探讨体质指数(body mass index,BMI)与我国直肠癌发病的关系,为直肠癌的预防提供参考.方法:用病例-对照研究方法分析353例首次确诊的直肠癌患者和354名健康人的BMI,比较两组人群BMI的情况.结果:首次确诊的直肠癌患者平均BMI为(24.54± 4.48)kg/m2,健康对照人群平均BMI为(23.58± 3.12)kg/m2,直肠癌患者的BMI明显高于健康对照人群,其差别具有统计学意义(P<0.001).根据性别的不同进行分组后,可以看出不同性别直肠癌患者的BMI均比健康对照组高.logistic回归分析,BMI的升高是直肠癌发生的危险因素,OR值为1.056 (95%CI,1.027~1.089).结论:直肠癌的发生与BMI有关.

    作者:李娜;潘红艳;李景文;崔明明;张志莹 刊期: 2014年第01期

  • CRT_D介导室性心动过速的研究进展

    心室再同步心脏转复除颤器(CRT_D)可有效改善心力衰竭(CHF)患者的运动耐量和生活质量,预防猝死,提高生存率,但CRT D植入后由于心室激动顺序的改变,使QT间期延长、跨室壁复极离散度(TDR)增加,潜在致室性心律失常风险;且CHF患者通常存在心肌解剖改变,传导的不均一性,也为折返性心动过速的发生提供了维持的机制;而多次电击也可导致肌钙蛋白升高,引起心肌损伤,局部心肌复极离散度增加(DRVR)和QT间期延长,以及电除颤后心肌纤维化和急性细胞损伤,反复室速、室颤也会引起进行性左心功能不全、心肌细胞凋亡、恶化心律失常基质和增加心律失常易感性.CRT D潜在致室性心律失常作用逐渐引起人们的重视,本文就近年来CRT D致室性心律失常的电生理机制与临床防治对策等做一综述.

    作者:杨日升;梁兆光;徐义喜;王鑑萌;田凤祥 刊期: 2014年第01期

  • 阿霉素与青蒿素半乳糖苷联合用药对乳腺癌细胞的体外抑制作用及机制

    目的:青蒿素及其衍生物具有抗癌活性,本研究旨在探讨阿霉素(DOX)与青蒿素半乳糖苷(AG)联合用药对乳腺癌细胞的体外抑制作用及机制.方法:DOX与AG联合对乳腺癌MCF-7细胞株进行干预,MTT法评价二者对癌细胞增殖的影响;流式细胞计量术检测细胞凋亡;免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达情况.结果:DOX与AG联合作用对MCF-7细胞增殖抑制率高可达91.6%,均显著高于同浓度DOX或AG抑制效果(P<0.01),且浓度分别为10 μM和20 μM量效比佳.10 μM DOX+20 μM AG联合干预组癌细胞凋亡率为19.8%,显著高于对照组及单用10 μM DOX或20 μM AG干预组.DOX与AG联合给药比单独应用其中一种均更加显著激活caspase级联信号通路,进而更加有效的促进癌细胞凋亡.结论:DOX和AG联合用药对人乳腺癌MCF-7细胞具有协同抑制效应,其机制可能与caspase家族介导的蛋白酶级联反应以及PARP裂解失活有关.这项研究为提高DOX治疗乳腺癌的有效性提供了新的思路.

    作者:康鸿斌;鲁宽亮;杨金盾;张雅峰;张瑞明 刊期: 2014年第01期

  • 靶向下调FOXM1基因表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

    目的:探讨靶向抑制FOXM1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,为乳腺癌的个性化靶向治疗提供理论依据.方法:利用重组真核转录载体pSilencer1.0-U6-FOXM1-shRNA,脂质体法转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,下调其FOXM1基因表达.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、平板克隆形成实验观察细胞增值曲线以及克隆形成能力;采用实时定量-聚合酶链反应(Real-timeqPCR)、蛋白免疫印迹法(Westem blot)分别检测FOXM1基因在mRNA、蛋白水平的表达变化.结果:重组载体pSilencer1.0-U6-FOXM 1-shRNA转染MDA-MB-231细胞后,与对照组相比,增殖速率明显下降(P<0.05),平板克隆形成显著减少(P<0.05),重组载体转染后显著抑制MDA-MB-231细胞中FOXM1基因在mRNA、蛋白水平的表达.结论:沉默FOXM1基因对乳腺癌细胞株MDA-MB-231生长具有抑制作用,为阐明乳腺癌发病机制提供了新的切入点,也为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点.

    作者:艾振华;王宇;吴波;王毅;刘文超 刊期: 2014年第01期

  • 细胞角蛋白20在膀胱癌中的研究进展

    膀胱肿瘤是常见的泌尿系统肿瘤,其中上皮性肿瘤占95%以上,绝大多数为尿路移行上皮细胞癌.膀胱癌的早期症状不明显,复发率较高,早期诊断和治疗对提高其疗效非常重要.近年来,诊断膀胱肿瘤的新方法不断出现,显著提高了膀胱肿瘤诊断及预后预测水平.其中,膀胱肿瘤标记物检测已成为膀胱肿瘤的诊断新方法,具有十分重要的临床意义.研究发现,细胞角蛋白20(cytokeratin 20,CK20)是中间纤维家族成员之一,在正常膀胱组织中特异性表达于伞细胞,在膀胱癌中特异性表达于膀胱移行细胞癌,其诊断膀胱肿瘤的特异性和灵敏性均较高,且与膀胱肿瘤的临床分级、病理分期和转移均密切相关,因此可作为辅助诊断膀胱肿瘤的检测标志物及治疗和预后评估指标.本文将就其在膀胱癌中的研究进展综述如下.

    作者:张明明;修有成 刊期: 2014年第01期

  • 几种药物对吗啡相关的条件位置偏好影响的研究进展

    条件化位置偏好(conditioned place preference,CPP),常用于研究药物成瘾的相关记忆.这里主要综述了一些药物对CPP的影响.神经肽S,神经肽FF,肌肽,孤啡肽,α-2受体激动剂,L-左旋千金藤啶碱,东莨菪碱,丙戊酸钠,巴氯芬对吗啡CPP有抑制效应;聚肌胞苷酸,氟伏沙明和金刚烷胺能增强吗啡CPP;阿坎酸能抑制乙醇和某些类别的滥用药物的条件化奖赏效应,但不影响吗啡引起的条件化奖赏效应;褪黑激素逆转吗啡诱导的奖赏效应;人重组干扰素-α导致吗啡CPP的恢复.

    作者:潘姿娇;王建红;何敏 刊期: 2014年第01期

  • 煮沸裂解法和试剂盒法提取浸矿菌基因组DNA的比较

    目的:在生物浸出中,微生物群落结构分析有着重要意义,而群落分析的基础是提取纯度高、损失少的基因组DNA.为了解决这一问题,本实验通过比较两种较常用的DNA提取方法,煮沸裂解法和试剂盒法,寻找一种灵敏、快速、经济实用的制备浸矿细菌基因组DNA的方法.方法:分别用煮沸裂解法和试剂盒法提取6种浸矿菌的基因组DNA,从所提取的基因组DNA浓度、纯度、回收率和对PCR扩增反应的影响方面比较了两种方法的提取效果;用两种方法来处理不同浓度梯度的一种菌,通过实时定量PCR来比较两种方法的灵敏性.结果:相同处理量(108个)的革兰氏阳性菌(1株)、革兰氏阴性菌(4株)、古菌(1株)经两种方法提取的基因组DNA差异较大,煮沸裂解法所得的6组基因组DNA更纯,其OD260/OD280的值更接近1.8-2.0(纯DNA的OD260/OD280在1.8-2.0之间),前者所提DNA回收率大可达后者的16.7倍;煮沸裂解法只需较少菌(102个)便能让实时定量PCR检测到所提DNA模板浓度,比试剂盒法灵敏.结论:两种方法提取的基因组DNA均可用于后续的PCR扩增,此外,前者提取的DNA浓度随细菌浓度增加而呈线性增大,而后者随菌浓度增大,所提DNA量增加有限,因此,在生物浸出中微生物基因组DNA的提取可直接采用简单快速的煮沸提取法,为实验节约成本和时间.

    作者:夏乐先;孙文娟;沈振;梁昱婷;柳建设;陈建华;邱冠周 刊期: 2014年第01期

  • 右美托嘧啶用于喉癌患者局麻下气管切开的临床效果分析

    目的:探讨预注右美托嘧啶(dexmedetomindine,Dex)对喉癌患者局麻下行气管切开时的影响.方法:选择择期喉癌手术拟行气管切开的患者40例,随机分为Dex组(D组)和生理盐水组(C组),D组在局麻前静脉注射Dex 0.5 μg/kg(10 min泵注完毕),C组以相同方式泵注等量生理盐水,观察5 min后开始行局麻下气管切开.分别记录两组患者给药前(T0)、局麻开始时(T1)、切皮时(T2)、气管内麻醉时(T3)、气管切开造口时(T4)的平均动脉压(MAP)、心率(HR)、脉搏血氧饱和度(SpO2)和呼吸次数(RR);观察并记录患者T1~T4各时间点的VAS评分、Ramsay镇静评分和手术耐受程度评分.结果:与T0相比,C组T1~T4各时点MAP和HR均升高,尤以T3~T4时明显(P<0.05),D组T1-4时MAP下降、HR明显减慢(P<0.05);与C组相比,D组T1~T4各时间点MAP均显著下降(P<0.05),HR均明显减慢(P<0.01),VAS评分显著降低(P<0.05),手术耐受程度评分和Ramsay镇静评分均显著升高(P<0.05).结论:喉癌患者行局麻气管切开前预先静注右美托嘧啶0.5 μg/kg(10min泵注完毕),可有效维持血液动力学稳定,并产生明显的镇静、镇痛作用.

    作者:杜静;徐德生;鲁金乐;胡美玲;王国年 刊期: 2014年第01期

  • 染色体畸形变与膀胱癌发生发展的相关性研究

    目的:通过荧光原位杂交技术(FISH)结合病理分级,探讨染色体畸形变与膀胱癌发生和发展的关系.方法:采用3、7、9、17号染色体着丝粒探针和9P16区带探针对105例膀胱癌复发患者尿液脱落细胞进行荧光原位杂交,观察膀胱癌复发患者中3、7、9、17号染色体的畸形变情况并分析其与患者临床和病理特征之间的关系.结果:105例膀胱癌复发患者中,3、7、9和17号染色体的非整数倍突变率分别是21.9%、29.5%、12.4%、和36.2%,与患者的性别、年龄无显著相关性(P>0.05).仅7号染色体畸变与膀胱癌的病理分级具有显著相关性(P<0.05).结论:7号染色体畸形变与复发膀胱癌的病理分级显著相关.

    作者:王洪波;杨德君;刘岩;王科亮;王晓民 刊期: 2014年第01期

  • 血清同型半胱氨酸、脂联素、高敏C反应蛋白水平与颈动脉内膜中层厚度在老年2型糖尿病合并脑梗死患者中的意义

    目的:观察血清同型半胱氨酸(Hcy)、脂联素(APN)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平与颈动脉内膜中层厚度(IMT)在老年2型糖尿病合并脑梗死患者中的意义.方法:选择2008年5月至2012年5月在我院就诊的2型糖尿病患者218例,按照是否合并脑梗死分为糖尿病伴脑梗死组(105例)和单纯糖尿病组(113例).选择同期健康体检者30例为健康对照组.观察三组血清Hcy、APN、hs-CRP和IMT的水平变化.结果:糖尿病伴脑梗死组和单纯糖尿病组的血清Hcy、hs-CRP和IMT的水平均较正常对照组明显提高(P<0.01),糖尿病伴脑梗死组以上指标显著高于单纯糖尿病组(P<0.01);而糖尿病伴脑梗死组和单纯糖尿病组的血清APN的水平较正常对照组明显降低(P<0.01),糖尿病伴脑梗死组血清APN的水平较单纯糖尿病组显著降低(P<0.o1).血清Hcy和hs-CRP水平随着IMT的严重程度增加而升高(P<0.01),而APN水平随着IMT严重程度升高而降低(P<0.01).结论:糖尿病伴脑梗死的患者大血管病变较单纯糖尿病患者更为严重,颈动脉IMT与Hcy和hs-CRP呈正相关,而与APN呈负相关.

    作者:刘勇;陈锐;王娓娓;岳凡;宋静 刊期: 2014年第01期

  • 冠状动脉支架植入术后行冠脉旁路移植术

    目的:总结15例冠状动脉支架植入术后行冠状动脉旁路移植术的临床经验.方法:回顾分析行冠状动脉支架植入术后行冠状动脉旁路移植术15例患者的资料,男10例,女5例,平均年龄(61±5)岁.行冠状动脉支架植入术后再行冠状动脉旁路移植术时间间隔(24±4)月,冠状动脉内置入支架3-6枚,左室射血分数为43 %-64%,其中<50%为3例.全组行体外循环下冠状动脉旁路移植术3例,行非体外循环心脏跳动下冠状动脉旁路移植术12例.结果:全组共行动脉桥吻合13支,静脉桥33支;围术期并发低心排综合征3例,肺部感染4例,胸腔内出血行胸腔闭式引流术2例,本组患者无死亡病例.术后平均住院日(13±4)天.结论:对冠状动脉内支架植入术后再狭窄或(和)冠状动脉再血管化不足的病例进行冠状动脉旁路移植治疗,可使冠状动脉达到充分再血管化,提高冠心病患者生活质量及预后.

    作者:王亮;王海茜;王云;李晓东;刘旭东;顾继伟;马彦敏 刊期: 2014年第01期

  • A549肺癌细胞株中癌睾丸抗原的表达及生物学意义研究

    目的:癌睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)是一类主要表达于睾丸组织和癌组织,并具有较强诱导体液和细胞免疫应答能力的抗原,可以作为抗肿瘤的理想靶分子.本研究探讨了A549肺癌细胞系中CTA的表达情况及其生物学意义.方法:本研究中选取了A549肺癌细胞株,运用RT-PCR的方法检测了其中九种常见CTA的表达情况,进一步通过AV-PI双染法观察了表柔比星,紫杉醇,卡铂,伊立替康,依托泊苷五种化疗药物对A549细胞的凋亡作用及其调控CTA表达的情况.另外用转化生长因子β1 (TGF-β1)处理A549细胞,验证了TGF-β1促进细胞生长的作用,进一步检测此时CTA的表达调控.结果:结果显示MAGEA1,MAGEA3,MAGEC1,HCA661在A549细胞系中稳定表达,表柔比星能够强烈诱导细胞发生凋亡,其诱导作用岁浓度增高而增强.表柔比星下调了MAGEA1,MAGEA3,MAGEC1的表达,对HCA661的表达无影响.TGF-β1增强了肿瘤细胞增殖能力,与此同时下调HCA661的表达,对MAGEA1,MAGEA3,MAGEC1的表达无影响.结论:MAGEA1,MAGEA3,MAGEC1,HCA661在肺癌细胞系A549中稳定表达.TGF-β1作用48小时,使HCA661的表达下调,MAGEA1,MAGEA3,MAGEC1的表达无变化.表柔比星作用48小时,使MAGEA1,MAGEA3,MAGEC1的表达下调,HCA661表达无影响,卡铂,紫杉醇,伊立替康,依托泊苷对CTA的表达无调控,为进一步明确CTA的表达调控机制奠定了研究基础,同时为将HCA661作为临床中诊断与治疗的新靶点提供了可行性.

    作者:岳芳桦;初明;史萃;肖鹏;冯嘉辉;初正云;陈雪;王若琚;刘晓妍 刊期: 2014年第01期

  • 鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒对生物膜形成的影响

    目的:鼠伤寒沙门菌在多种表面形成的生物膜对其致病性和引起食物中毒等方面起着重要作用,本研究探讨鼠伤寒沙门菌pStSR 100质粒对细菌在不同材质表面生物膜形成的影响.方法:用LB(Luria-Bertani,LB)培养基和TSB (Tryptose Soya Broth,TSB)培养基分别将携带pStSR100质粒的野生株在96孔板与放置无菌小圆玻片的24孔板中静态培养48 h,用结晶紫半定量法确定生物膜形成的适宜培养基.将野生株与消除质粒的突变株,用结晶紫半定量法和激光共聚焦显微镜(Confocal Laser scanning microscopy,CLSM)观察其在聚苯乙烯培养板和小圆玻片表面形成生物膜的差异.结果:用LB培养时细菌生物膜的形成能力高于用TSB培养,LB培养基更适宜生物膜形成;结晶紫半定量法结果表明野生株比突变株在小圆玻片表面形成生物膜的能力明显增强,而在聚苯乙烯培养板表面两者则无明显差异;CLSM观察发现,野生株在小圆玻片表面形成融合成片的大克隆,突变株仅形成较小克隆.结论:鼠伤寒沙门菌pStSR100质粒能促进该菌在亲水性材质表面生物膜的形成,但其对该菌在疏水性材质表面生物膜的形成未见明显影响,这一新发现为进一步研究鼠伤寒沙门菌生物膜形成的调控机制,研制抗感染材料提供了理论和实验依据.

    作者:王虎;黄洋;李嫄渊;黄瑞 刊期: 2014年第01期

  • 鞭毛蛋白FliC突变体/HPV 18 L2N融合蛋白的表达与纯化

    目的:人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染导致女性宫颈癌的发生.HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低.鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂.删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显著增强外源抗原特异性抗体的产生.本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV 18 L2N(aa.13-154)的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV 18L2疫苗奠定基础.方法:以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重叠PCR法构建删除fliC D3区域(fliC△D3)、D3+CD2a区域(fliC△D3CD2a)、D3+D2区域(fliC△D2D3)的突变体,同时将HPV 18 L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域.含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE及Westem blot鉴定分析.表达的融合蛋白经Ni-Sepharose亲和层析纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素.纯化后的融合蛋白经Native-PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量.结果:构建了pET22b-fliC△D3/18 L2N、pET22b-fliC△D3CD2a/18L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N重组载体.重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在.结论:通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白,为增强HPVL2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV 18 L2疫苗奠定了基础.

    作者:包琦锋;刘洪洋;张婷;陈雪;许雪梅 刊期: 2014年第01期

现代生物医学进展杂志

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