孟婕
糖尿病脑病是指糖尿病患者伴有认知障碍和脑组织的结构及病理生理改变,根据文献报道,糖尿病伴有认知障碍的发生率是其它同类人群的两倍以上,由于糖尿病发生率的迅速增加,至2015年发病人数已超过1亿人.因而,糖尿病脑病也受到越来越多的关注.至今糖尿病脑病的机理不十分清楚,阐明其发病机理,找到药物作用的靶分子,寻找预防和治疗糖尿病脑病的新药,是中老年医学药学人员的重要任务.我们建立了多种糖尿病小鼠模型,从血液生化到脑形态改变;从脑电生理到重要受体表达,以及药物治疗作用,并与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)进行了初步比较.我们首先观察了KK-Ay小鼠在3,5,7月龄时的血液生化改变,发现随着月龄的增加与对照C57小鼠比较,血糖,血脂和血胰岛素水平均逐渐提高,与之相应的改变是小鼠的认知能力明显降低,在Morris水迷宫实验中,出现了糖尿病脑病的明确症状.同时脑内A? 沉积和Tau蛋白磷酸化明显增加.为进一步揭示糖尿病脑病的病理改变,我们又建立了STZ大鼠,db/db小鼠及ZDF糖尿病模型.在这些动物模型中均表现出明显的学习记忆障碍,并也有一定的A? 和Tau蛋白增加.形态学研究发现,通过NeuN荧光染色证实KK-Ay小鼠神经元数量没有明显丢失,但小胶质细胞早期即出现形态改变,且Iba1表达增加,提示小胶质细胞激活增加,同时星形胶质细胞激活增加,脑的炎症反应可能与糖尿病对脂代谢异常有关,而高糖对神经元损伤不明显.离体脑片长时程增强作用(long-term potentiation,LTP)的比较研究发现,糖尿病脑病与AD随病情进展,LTP却受到了明显的损伤,但电生理检测显示,突触前递质释放和突触后神经元的兴奋性均无明显变化,而N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid,AMPA)受体亚型的蛋白表达显示,磷酸化的NR2A和NR2B表达明显降低,糖尿病脑病时LTP的改变与AD的改变相似.糖尿病脑病与AD的药物治疗显示,胆碱酯酶抑制剂对糖尿病脑病有一定疗效,但对糖尿病症状无改善作用,丁苯酞前药PHPB也有一定疗效.但糖尿病脑病对饮食治疗效果显著.将高脂饲料恢复为普通饲料后,不仅KK-Ay小鼠的血清生化指标得到改善,学习记忆能力和神经突触可塑性,即LTP均可明显改善.说明糖尿病脑病及引起的认知障碍在一定时期内是可被逆转的,这一点可能给人们带来重要的信息.
作者：王晓良；王玲；李江；师思；尹华静；于文雯 刊期： 2017年第02期
目的:拟人参皂苷-F11(Pseudoginsenoside-F11,PF11)是一种奥克梯隆型人参皂苷,前期研究表明,其具有广泛的中枢神经系统保护作用,尤其可以缓解永久性脑缺血(permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO)及短暂性脑缺血模型急性期的缺血损伤,并能够改善短暂性脑缺血的长期神经行为学表现.而诸多文献表明,自噬广泛的参与到脑缺血损伤中,因此,本文将要研究PF11对脑缺血的保护作用是否基于其对自噬溶酶体通路的调节作用.方法:雄性SD大鼠,经pMCAO造模手术,在缺血后0.5 h单次尾静脉注射给予PF11(3,6,12 mg·kg-1,i.v.),在缺血后的24 h通过免疫荧光、TUNEL染色及FJB染色方法考察PF11对神经元存活及胶质细胞活化的影响;结合免疫荧光及免疫印迹方法考察PF11对自噬溶酶体通路相关蛋白表达的影响;给予自噬抑制剂CQ(25 mg·kg-1,i.v.c.)考察PF11对脑缺血的保护作用是否基于调控自噬溶酶体通路.结果:单次尾静脉注射给予PF11能够显著的降低缺血诱导的皮层神经元的缺失及小胶质细胞和星形胶质细胞的活化;此外,PF11能够显著的降低缺血导致的自噬小体生物标记物LC3-II、ATG7及ubiqutin的不正常积累,并促进自噬另一底物SQSTM1的进一步下降;PF11能够显著的改善pMCAO后的溶酶体功能,表现为显著的增加pMCAO后溶酶体相关蛋白LAMP2、V-ATPase及Cathepsin B的表达及LAMP2和Cathepsin B的共定位,并促进自噬溶酶体的融合,表现为显著的增加pMCAO后VAMP7的表达,这种作用可以被CQ所阻断.同样的,PF11对pMCAO后脑缺血的改善作用及其抗凋亡作用也能够被CQ所阻断.结论:以上研究结果表明,PF11显著的脑缺血保护作用可能通过缓解pMCAO后自噬溶酶体通路障碍而发挥.
作者：刘月阳；袁琳琳；刘迎璐；徐娇艳；孙士博；杨静玉 刊期： 2017年第02期
目的:tau蛋白过度磷酸化与AD的发病机制直接相关,本实验通过冈田酸(okadaic acid,OA)诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化实验模型,研究补体C3/C3aR在OA致SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化的作用及机制.通过对以上问题的阐明将为研究针对C3/C3aR这一靶点开发新型药物保护Tau蛋白病尤其是AD提供理论基础.方法:①采用OA诱导SH-SY5Y细胞,以tau蛋白过度磷酸化和细胞活性的变化为观察指标,建立用于AD研究的细胞模型.②CCK8法检测细胞活性.③Western blot测定SH-SY5Y细胞Ser396,Thr231,Thr205位点磷酸化tau蛋白水平.④Western blot法测定tau蛋白磷酸化关键调节酶GSK3β,Cdk5,PP2A的蛋白表达水平.结果:①OA处理SH-SY5Y细胞,CCK8法检测显示细胞活性显著降低,作用随着OA浓度的增高和作用时间的延长而增强;40 nmol·L-1 OA作用SH-SY5Y细胞不同时间,可见细胞中Ser396,Thr231,Thr205位点磷酸化tau蛋白水平于作用后3 h开始升高,24 h达高峰,随后开始下降,48 h的水平仍高于基础值,提示OA可诱导SH-SY5Y细胞活性下降和tau蛋白过度磷酸化.②C3a受体拮抗剂SB290157预处理24 h后,再给予40 nmol·L-1 OA处理SH-SY5Y细胞12 h,检测细胞中Ser396,Thr231,Thr205位点磷酸化tau蛋白水平,可见Ser396,Thr231,Thr205位点磷酸化tau蛋白水平变化同时下调,显著低于单独OA处理组,提示在OA诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化过程中,补体C3/C3aR可能参与其中,C3aR受体拮抗剂可显著抑制tau蛋白过度磷酸化.③C3a受体拮抗剂SB290157预处理,western blot结果显示SB290157可抑制GSK-3β和Cdk5的蛋白表达,但可上调蛋白磷酸酶PP-2A的蛋白表达.④通过转染C3aR-siRNA,同样发现OA不能诱导tau的过度磷酸化及其调节蛋白的改变.结论:①OA可诱导SH-SY5Y细胞活性下降和tau蛋白过度磷酸化,该细胞模型可用于AD研究.②在OA诱导SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化过程中,C3a受体拮抗剂SB290157可抑制SH-SY5Y细胞Ser396,Thr231,Thr205位点磷酸化tau蛋白水平.③C3a受体拮抗剂对过磷酸化tau蛋白水平的抑制,可能是通过抑制GSK-3β和Cdk5,同时上调蛋白磷酸酶PP-2A实现的.
作者：马嵘；胡珺捷；姚艺；黎钢 刊期： 2017年第02期
目的:探讨香茅精油对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的防治作用及机制.方法:采用D-半乳糖联合三氯化铝诱导建立AD小鼠模型,小鼠分为6组:空白对照组、AD模型组、AD模型+香茅精油大剂量组、AD模型+香茅精油中剂量组、AD模型+香茅精油小剂量组,AD模型+阳性药组,每组30只.除空白对照组外,其余5组每天灌胃三氯化铝5 mg·kg-1·d-1(双蒸水配制),连续120 d,空白对照组灌胃等量的双蒸水.从第75 d开始,除空白对照组的5组腹腔注射D-半乳糖60 mg·kg-1·d-1(生理盐水配制),空白对照组腹腔注射等量生理盐水.121 d开始,各给药组按预定剂量给药,空白对照组和AD模型组用相同体积双蒸水灌胃,每日1次,连续28 d.末次给药后,采用Morris水迷宫实验观察香茅精油对AD小鼠学习记忆能力的影响,同时检测血清和脑组织中MDA、GSH-PX、SOD含量的变化,脑组织病理形态学的改变来探讨姜黄素对老年痴呆小鼠的保护作用.结果:Morris水迷宫实验结果表明,与正常组小鼠比较,AD模型组小鼠空间探索潜伏期明显延长(P<0.05),与AD模型组小鼠比较,香茅精油可以缩短AD小鼠水迷宫空间探索的潜伏期(P<0.05).与正常对照组比较,AD模型组小鼠血清和脑组织GSH-PX活性降低,MDA含量升高;与模型组比较,香茅精油各剂量组小鼠血清和脑组织GSH-PX活性提高,其中高剂量组作用明显(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05).各组小鼠血清和脑组织SOD活性没有明显差异(P>0.05).海马区病理组织HE染色结果显示:正常对照组海马区锥体细胞核大而圆,核仁明显,细胞排列整齐;AD模型组海马区锥体细胞核体积变小,深染,结构不清,呈核固缩表现,层次不清,神经纤维排列紊乱;香茅精油组细胞组织结构和形态基本恢复正常.结论:香茅精油可提高AD模型小鼠的学习和记忆能力,减轻海马组织结构的损伤,其作用可能与清除脂质过氧化产物,提高机体抗氧化能力有关.
作者：王雪飞；康金森 刊期： 2017年第02期
铁离子是维持正常生命活动所必须的微量元素,参与了机体多项基础生理过程,新近的研究发现中枢神经系统铁离子紊乱与多种神经退行性疾病包括阿尔茨海默病和帕金森病的发生发展密切相关.传统观点认为,铁离子主要通过氧化应激或铁响应元件调节神经元生理和病理功能,然而目前关于铁过载所致神经功能改变的其他调控机制研究仍然相当缺乏.本研究首先应用铁过载诱发体内外神经损伤模型证实铁过载可以诱发神经细胞突触断裂,线粒体功能下降以及认知功能障碍.其次,结合应用非标记质谱定量蛋白组学在离体原代皮层神经元铁过载模型中深入进行机制探讨.质谱共检出的差异表达蛋白中82个差异蛋白参与神经系统发育和功能维持,112个差异蛋白为神经疾病相关蛋白,并证实包括 β-淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)、转铁蛋白受体1等七个铁代谢相关蛋白受到铁过载调控.我们进一步对铁过载神经元APP的调控作用进行了系统研究,证实铁过载促进APP非淀粉样剪切,具体表现为铁处理组CTFα显著增加,但sAPPα分泌受阻,表现为sAPPα分泌减少而细胞分布增加;同时,铁过载抑制神经元APP淀粉样剪切,表现为CTFβ水平明显减少,sAPPβ和Aβ分泌亦显著减少.研究进一步揭示铁过载通过直接和间接方式抑制神经元β-分泌酶活性,三价铁剂柠檬酸铁铵可直接抑制β位分解酶1(beta-secretase 1,BACE1)酶活,也可通过促进sAPPα与BACE1的相互作用间接抑制淀粉样剪切.鉴于分泌形式sAPPα和Aβ的重要生理和病理功能,且铁过载减少这二者的分泌,提示sAPPα和Aβ的功能障碍有可能是铁过载所致神经损伤的机制之一.本研究系统证实了铁过载对神经元功能的影响,采用组学手段揭示了铁过载对神经元多个重要功能蛋白的影响,拓展了对铁过载相关神经损伤的认识,为铁代谢紊乱参与中枢神经系统疾病发生发展的这一理论提供支持.
作者：陈郁婷；黄霄天；刘幸；周虎；章海燕 刊期： 2017年第02期
目的:近几年来的研究发现提示轴突病变在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的发病机制上可能扮演重要的角色,而且轴突病变的特征性改变包括轴突和膨体的肿胀、轴突转运障碍以及轴突漏可能参与了老年斑(senile plaques,SP)和神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)的起源和形成.近的动物模型研究也证实AD相关的危险因子如脑缺血、脑损伤、氧化应激和糖尿病脑病可以导致突起病变包括轴突病变和树突病变.为了进一步阐明AD相关的危险因子和轴突病变在AD病理机制上的重要性,本研究使用培养的海马神经细胞研究氧和葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)并结合复氧复糖的处理对神经突起的影响.方法:培养8天的大鼠海马神经元实施不同时间的(0.5、1、2、4 h)OGD以及结合复糖复氧24 h处理.使用细胞工作站对神经元的形态(胞体和突起)、神经突起的转运功能和线粒体在神经突起的分布进行实时观察和成像以及进一步的测量分析.结果:①短时间(0.5 h和1 h)的缺糖缺氧和24 h复糖复氧处理对神经元突起形态影响不明显;相对较长时间(2 h)的缺糖缺氧和24 h复糖复氧处理后部分神经元胞体出现空泡样改变伴随突起的退休性变化;长时间(4 h)的缺糖缺氧和24 h复糖复氧处理后大部分的神经元胞体出现坏死性变化伴随神经突起断裂和崩解;②神经元在受到缺糖缺氧刺激后,突起的顺行和逆行转运都受到明显抑制,长时间的缺糖缺氧和复糖复氧处理终可以导致突起转运的停止;③长时间(2 h)的缺糖缺氧和24 h复糖复氧处理能导致培养海马神经突起内线粒体分布改变和线粒体的聚集.结论:明显的缺糖缺氧以及复糖复氧处理可导致培养的原代海马神经元突起的结构和功能变化.这些发现对于阐明脑血管病变以及脑中风在AD病理机制上的作用提供重要的实验证据.
作者：姜新帅；孙燕；肖芳艳；戴甲培 刊期： 2017年第02期
目的:AD基本病理可见老年斑(senile plaques,SP)与神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)等病变,老年斑又称淀粉样斑,主要由细胞外纤维和β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)形成沉淀引起.秀丽隐杆线虫结构简单,繁殖迅速,是一种优秀的疾病筛选模型.CL4176(myo-3/human Aβ1-42)线虫模型通过激动myo-3体壁特异性肌球蛋白启动子,将人源Aβ1-42在体壁肌细胞中表达,当线虫中Aβ表达到一定程度,就会诱导线虫出现瘫痪直至死亡.实验利用CL4176线虫表达Aβ,出现瘫痪模型,将若干天然产物给予到瘫痪模型的线虫上,筛选具有延缓线虫瘫痪,降解Aβ沉积,从而对阿尔茨海默病具有治疗作用的天然产物或先导化合物.方法:取出CL4176线虫株,解冻,待虫体自然沉降后,弃大部分上清液,其余底液铺到新鲜的含OP50的NGM平板上,置于16℃培养箱中培养复苏线虫株.将离心管置于冰上10 min,使线虫沉于管底,1800转离心10 min.去掉大部分上清液,收集L1期同步化线虫,将收集的同步化线虫转移到给药板上,置于16℃、湿度60条件下培养.在16℃下培养约48 h,幼虫发育至L3期,立即升温至25℃条件下培养.升温后第24 h,开始观察记录瘫痪行为,每2 h观察记录一次瘫痪的时间和数量,直至所有线虫全部瘫痪.用worrm picker接触线虫头部或躯干,若线虫仅能移动头部或者全身瘫痪,则判定为线虫处于瘫痪状态,未瘫痪线虫判断为存活线虫.受试品孵育培养线虫,分别设置溶媒对照组、受试品孵育处理组.显微镜下观察观察线虫瘫痪行为,记录瘫痪的时间和数量,直至所有线虫全部瘫痪死亡.统计每个小板瘫痪的线虫数和线虫总数,计算平均瘫痪时间PT50.结果:与溶媒对照组对比PT50值分别为:GAS-31.64>Res-31.83>NOTO-29.40>溶媒对照组28.52.天麻素GAS(100μm·L-1)、tRes(100μm·L-1)、三七总皂苷NOTO(100mg·L-1)与溶媒对照组比较,差异有统计学意义,说明天麻素GAS(100μm·L-1)、白藜芦醇Res(100μm·L-1)、三七总皂苷NOTO(100 mg·L-1)均能延迟CL4176线虫株瘫痪时间,具有减缓线虫瘫痪,降解Aβ沉积的作用.结论:天麻素等天然产物拮抗CL4176线虫的Aβ表达,具有潜在的拮抗AD活性.
作者：陆卿；何海燕；施蕊；杨为民 刊期： 2017年第02期
目的:为了明确记忆相关基因KIBRA在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)转基因动物模型中是否存在表达改变及及其对神经元凋亡的影响,进而探讨KIBRA如何参与Aβ诱导的神经元凋亡及其相关机制.方法:本研究首先通过免疫组织染色及免疫蛋白印迹的方法,观察在不同月龄APP/PS1小鼠中是否存在KIBRA的表达改变.其次,通过TUNEL免疫荧光染色,观察在KIBRA基因敲除小鼠中是否存在神经元凋亡.后,我们使用CRISPR/CAS9慢病毒及过表达慢病毒分别转染HT22细胞,建立KIBRA基因敲除和KIBRA过表达细胞模型,进而探讨KIBRA对Aβ诱导的神经元凋亡及其相关机制的研究.结果:①KIBRA在APP/PS1转基因小鼠脑内特异性表达:选用9月龄及12月龄APP/PS1小鼠作为AD研究模型,通过KIBRA免疫组织染色分析,无论整个海马,还是海马亚区CA1区和CA3区,9月龄和12月龄APP/PS1小鼠KIBRA阳性细胞数量均明显低于对照组,其中12月龄尤为显著(P<0.01,P<0.001).免疫蛋白印迹结果同样证实12月龄APP/PS1小鼠海马区KIBRA的表达明显低于野生型小鼠(P<0.001).随着月龄的增加,KIBRA在APP/PS1转基因小鼠海马区的表达逐渐减少,提示KIBRA在AD小鼠海马区的特异性降低,与学习记忆障碍密切相关.②KIBRA在神经元凋亡中的重要作用:通过TUNEL荧光染色发现,与野生型小鼠相比,12月龄APP/PS1小鼠海马神经元凋亡比例明显增多(P<0.01,P<0.01).4月龄KIBRA基因敲除小鼠海马神经元凋亡比例比野生型小鼠明显增加(P<0.05),提示KIBRA在神经元凋亡的发生中扮演不可或缺的角色.③KIBRA对Aβ诱导的神经元凋亡的保护作用:CCK8及免疫蛋白印迹结果显示,与空病毒组相比,经1μmol·L-1的Aβ1-42寡聚体处理后的KIBRA敲除组细胞活力明显降低(P<0.01);凋亡相关蛋白(剪切的PARP、活化的caspase3)的表达量明显增高(P<0.05,P<0.01).KIBRA过表达组细胞存活率明显优于空病毒组(P<0.05),凋亡相关蛋白较空病毒组显著减少(P<0.05),进一步提示KIBRA参与抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖和存活.4.KIBRA通过激活Akt信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡:本实验筛选凋亡相关信号通路,结果显示,在1μmol·L-1 Aβ1-42寡聚体处理1 min后,KIBRA敲除组Akt Ser473位点磷酸化水平比空病毒组显著降低(P<0.05).在Aβ1-42寡聚体处理1分钟后,KIBRA过表达组Akt Ser473位点磷酸化明显被激活,Akt Ser473位点磷酸化水平比空病毒组显著增高(P<0.01).此外,与Aβ1-42寡聚体干预组相比,Akt特异性抑制剂(MK2206)预处理组KIBRA过表达细胞存活率明显降低(P<0.05);剪切的PARP表达量明显增高(P<0.05).以上结果表明KIBRA通过激活Akt Ser473位点的磷酸化水平,抑制Aβ诱导的神经元凋亡.结论:KIBRA作为一种神经保护因子,通过激活Akt信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖及存活,为AD发病机制及治疗药物的研究提供了新的靶点.
作者：唐诗；王永祥；董玲玲；韩晓蕾；宋林；杜怡峰 刊期： 2017年第02期
目的:探讨14-3-3ζ与CKⅡ介导SET滞留胞浆的分子机制,进一步阐明阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)发病机制.结果:AAV8/14-3-3ζ病毒感染C57小鼠脑片观察到SET、14-3-3ζ及CKⅡα三者间可相互共定位.在HEK293/tau细胞株中,免疫共沉淀结果显示SET、14-3-3ζ及CKⅡα三者间相互结合.CKⅡ抑制剂TBB处理致SET Ser-9磷酸化程度显著降低;给予si14-3-3ζ处理后发现,敲减14-3-3ζ可导致SET Ser-9磷酸化程度降低.说明CKⅡα通过14-3-3ζ的募集促进对SET的磷酸化修饰.TBB处理可很好的恢复由于14-3-3ζ引起的PP2A活性降低.过表达CKⅡα的AAV8病毒感染C57小鼠,同时分别用处理AAV8-si 14-3-3ζ,AAV8-Ssi处理,条件恐惧、水迷宫实验实验发现si 14-3-3ζ处理可恢复小鼠学习和记忆能力.激光共聚集荧光显微镜下可观察到过表达CKⅡα可促进SET滞留于胞浆,而si 14-3-3ζ可恢复SET的核输入.体外原代培养大鼠胚胎海马神经元发现过表达CKⅡα可导致神经元树突长度缩短,分支减少,树突棘密度减少等变化;免疫印迹实验检测发现突触前蛋白减少,NR2A和NR2B比值变大,SET Ser-9显著磷酸化,si 14-3-3ζ处理可以有效恢复上述变化.结论:14-3-3ζ可同时结合CKⅡα与SET,并促进CKⅡα对SET Ser-9的磷酸化,进一步导致SET滞留胞浆,引起PP2A活性抑制、神经元树突损伤、学习和记忆的损伤.si 14-3-3ζ显著减少CKⅡα与SET的结合,引起CKⅡα磷酸化SET Ser-9程度降低,从而恢复PP2A活性、神经元树突损伤、学习和记忆的损伤.
作者：王小川 刊期： 2017年第02期
润佳医药开发的新药RP1600是一种针对β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)的拮抗剂-tramiprosate改良而成的药物.润佳医药使用了稳定同位素取代技术,成功解决tramiprosate体内快速代谢降解的问题,同时通过优化改造成前药的途径,使得RP1600具有更好的耐受性和药代动力学特征.润佳医药结合多年前在北美三期临床中取得的实际经验,首次提出阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的精准治疗计划 — 仅针对ApoE4基因病人的用药方案,争取率先为这部分高危AD患者带来治疗的新手段.
作者：吕佳声 刊期： 2017年第02期
目的:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是常见的老年痴呆症,其特征性病变是过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques,SP).蛋白磷酸脂酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)在AD脑中活性抑制并参与调节tau蛋白和Aβ前体APP磷酸化,从而促进tau病变和淀粉样病变,但PP2A抑制的上游机制未阐明.癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A)是一种新发现的内源性PP2A抑制子,其在脑中的功能和在AD发病中的作用到目前为止无相关报道.本研究旨在阐明CIP2A是否通过调节PP2A参与AD样病变及其机制,为AD的防治提供新的分子靶点.方法:在人脑样本,用免疫印迹检测AD病人和对照组CIP2A的表达;在细胞水平,在HEK-tau,N2a-APP和原代神经元过表达CIP2A,检测tau病变、淀粉样病变和突触退变损伤;在整体水平,采用腺病毒注射感染C57小鼠,检测认知功能、tau病变、淀粉样病变和突触退变损伤情况.结果:CIP2A在AD脑内表达水平增高并与PP2A活性负相关;在HEK-tau细胞和原代神经元中过表达CIP2A导致PP2A活性下降,tau蛋白过度磷酸化并在树突和树突棘中聚集,树突棘数目减少,突触功能障碍;在N2a-APP细胞中过表达CIP2A导致APP磷酸化,Aβ产生和释放增加;整体动物海马注射AAV过表达CIP2A导致动物出现AD样空间学习记忆能力障碍,脑中出现tau病变,Aβ产生增加,神经元退变.结论:CIP2A通过抑制PP2A活性参与调节tau蛋白和APP磷酸化,从而促进AD样tau病变、淀粉样病变和神经退变.因此,抑制CIP2A可能底物特异性活化PP2A从而逆转AD样病变.
作者：申屠；杨萍；冯小龙；刘杨震宇；王小川；王建枝；刘蓉 刊期： 2017年第02期
目的:探讨淫羊藿次苷Ⅱ(icariside II,ICS II)对双侧海马内注射鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid,IBO)诱导的类AD大鼠模型的治疗作用及机制.方法:SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠93只,体重220～250 g,通过简单随机法将大鼠分为7个组:①假手术组;②假手术-高剂量ICSⅡ组;③IBO组;④低剂量ICSⅡ组;⑤中剂量ICSⅡ组;⑥高剂量ICSⅡ组;⑦阳性药(多奈哌齐)组.③ ～ ⑦组每只大鼠脑立体定位海马(前卤后1.0 mm,左右旁开2.6 mm,深度3.8 mm),双侧海马各注射4μg·μL-1 IBO,①、②组同样注射相应体积的生理盐水.制模后第1天开始,采用灌胃方式给药,每日1次,连续11天,至12天时开始进行水迷宫行为学测试,连续5天.水迷宫测试结束后,注射7％ 水合氯醛麻醉大鼠,断头取脑后固定包埋,制备石蜡切片后行苏木素-伊红染色、尼氏染色以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法染色分别观察神经细胞形态、神经细胞存活数量以及神经细胞凋亡情况.采用Western blot检测海马组织中Bax、Bcl-2、active-caspase-3的蛋白含量.结果:IBO组较Sham组大鼠的平均逃避潜伏期明显延长,海马神经细胞发生变性,海马神经细胞结构损伤严重,海马神经细胞中尼氏小体数量明显减少,海马神经细胞凋亡数量增多;Bax、active-caspase-3蛋白含量升高;Bcl-2的蛋白含量显著降低.ICSⅡ和多奈哌齐组较IBO组的大鼠平均逃避潜伏期明显缩短,海马神经细胞损伤有改善,同时,海马区的尼氏小体数量增加,细胞凋亡明显减少.ICSⅡ和多奈哌齐明显下调Bax/Bcl-2比值及active-caspase-3水平.结论:在本实验条件下:①ICSⅡ可以改善双侧海马注射IBO诱导的类AD大鼠学习记忆功能减退,提示其具有抗兴奋性氨基酸毒性的作用;②ICSⅡ可提高神经细胞的存活、阻遏神经细胞变性.
作者：何莲子 刊期： 2017年第02期
Background:Inhibition of phosphodiesterase 4(PDE4)improves the learning and memory abilities in Alzheimer's disease animal models. The cognition-enhancing effects of PDE4 inhibition involve reduced inflammatory responses in the brain. However,the underlying mechanisms are ill-understood. cAMP induces autophagy,and deficiency of autophagy leads to elevated inflammatory factors. In the present study,we aimed to investigate the contribution of autophagy to the anti-inflammatory effect of PDE4 inhibitor ROF. Methods:Acidic vesicles were traced by Lysotracker(LYT)red and acridine orange(AO)staining. Autophagosomes in BV-2 cells was observed by immunofluorescence staining of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3). Aβ25-35 or lipopolysaccharide(LPS)with ATP were used to activate microglial cells and inflammasome. Cytokine levels were measured by ELISA method. The levels of pro-inflammatory factors and essential proteins involved in the formation of autophagosome were detected by Western blotting. Results:ROF increased the level of LC3-II,while the level of p62 was decreased. Enhanced fluorescent signals were observed in BV-2 cells treated with ROF by AO and LYT red staining. In addition,immunofluorescence indicated a significant increase in punctate LC3. Both LPS plus ATP and Aβ25-35 enhanced the conversion of pro-caspase-1 to cleaved-caspase-1 and increased the production of mature IL-1β. Interestingly,these effects were blocked by the treatment of ROF. Moreover,ROF decreased the apoptosis of neuronal N2a cells in conditioned media from BV-2 microglia. These effects were reversed by inhibition of microglial autophagy. Treatment with ROF also showed enhanced autophagy in mcie treated with LPS. Conclusions:PDE4 inhibitor ROF inhibits inflammasome activities and reduces the release of IL-1βby inducing autophagy.
作者：YOU Ting-ting；GUO Hai-biao；WANG Hai-tao；XU Jiang-ping 刊期： 2017年第02期
目的:探讨淫羊藿苷(icariin,ICA)是否通过Nrf2通路对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamin,6-OHDA)诱导的PC12细胞损伤的保护作用,从而为ICA用于抗帕金森病(Parkinson's disease,PD)的应用研究提供基础药理学依据.方法:细胞实验:选用PC12细胞制备神经元损伤模型,实验随机分为空白组、ICA(0.5μmol·L-1)组、6-OHDA+ICA(0.005μmol·L-1)组、6-OHDA+ICA(0.05μmol·L-1)组、6-OHDA+ICA(0.5μmol·L-1)组.细胞按分组剂量给予ICA处理12小时后再加入6-OHDA(100μmol·L-1),采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞胞核中Nrf2的表达,及Keap1,HO-1,Gclc,Nqo1,Caspase 3,Bax,Bcl-2,Cytochrome C的表达,采用脂质体转染,沉默Nrf2,再次观察以上蛋白的表达,从而进一步证实ICA有可能通过Nrf2通路进行保护.结果:Western Blot结果提示:与空白组相比,模型组的Nrf2,Keap1,Gclc,Nqo1的表达明显升高,相对的凋亡基因Caspase 3,Bax,Bcl-2,Cytochrome C也随之升高,随着ICA浓度的升高,核蛋白Nrf2的表达升高,且HO-1,NQO1,Keap1,GCLC的表达也随之升高,而对应的凋亡基因蛋白表达降低.结论:ICA可能通过Nrf2通路对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤的保护作用,后期通过沉默Nrf2基因,进一步探讨ICA是否通过Nrf2通路对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤的保护作用.
作者：朱丽 刊期： 2017年第02期
目的:观察5-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)罗丹宁(RD-1)抗脑缺血再灌注损伤作用并深入探讨其作用机制.方法:采用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗阻(middle cerebral artery occlusion,MCAO)2 h后复灌模型,将大鼠随机分成假手术组、模型组、RD-1治疗组(5 mg·kg-1·d-1,10 mg·kg-1·d-1,20 mg·kg-1·d-1,i.g.)及阳性药金纳多组(50 mg·kg-1·d-1,i.p.),每组10只.连续给药14 d后进行行为学评价,HE染色测定脑梗死体积,免疫组化实验检测各组动物皮层损伤区神经元的丢失情况.在体外培养的大鼠原代皮层神经元中,采用氧糖剥夺后复灌(OGD/R)模型模拟体外脑缺血再灌注损伤,分别检测损伤12 h后原代神经元内活性氧的生成情况,线粒体膜电位的变化及细胞内钙离子浓度的变化情况,在活细胞工作站中观察神经元内线粒体轴浆转运情况,采用FM1-43标记功能性突触并观察神经元突触间神经递质的释放效率,TUNEL染色观察细胞内凋亡情况,western blot检测MCAO大鼠损伤侧皮层及原代皮层神经元内线粒体自噬及分裂融合相关蛋白的表达.结果:RD-1在体内外脑缺血再灌注损伤模型中均表现出良好的神经保护作用,在体内显著降低MCAO模型大鼠神经功能缺损症状评分,显著缩短大鼠去除两侧前肢贴纸的时间,显著降低脑梗死体积,并抑制MCAO大鼠损伤侧大脑皮层前肢感觉区神经元的丢失;同时在体外,RD-1可显著对抗OGD/R损伤,提高细胞活性.进一步研究其作用机制发现,RD-1可明显减轻OGD/R造成的线粒体损伤,显著抑制活性氧的过量生成,稳定线粒体膜电位并减轻细胞内钙超载;此外,RD-1可对抗OGD/R引起的线粒体轴突转运障碍,显著加快线粒体的顺向转运,减慢逆向转运,使得线粒体在轴突的转运恢复正常;且OGD/R损伤引起神经元突触囊泡神经递质释放障碍,RD-1可以显著逆转这一障碍,促进突触释放神经递质的活性;TUNEL染色结果显示RD-1可大幅降低原代神经元内凋亡水平,同时体内外western blot检测表明RD-1可显著改善Bcl-2/Bax的表达,抑制神经元的凋亡.在体内RD-1各给药组可显著增加线粒体分裂蛋白DRP1及线粒体融合蛋白OPA1和MFN2的表达水平,对抗MCAO损伤所致的线粒体分裂及融合障碍;另外RD-1可通过激活PINK1/Parkin通路和Nix通路,促进神经元内线粒体自噬过程,促进受损线粒体的清除,维持线粒体稳态.结论:RD-1的神经保护作用机制可能为通过改善缺血再灌所致的线粒体功能障碍,减轻线粒体损伤,维持线粒体稳态,促进突触囊泡释放神经递质的活性,同时抑制神经元的凋亡.本研究为RD-1抗脑缺血再灌注损伤作用的开发积累了一定的实验基础和理论依据.
作者：王明洋；冯璐；郑吉；刘俊雅；范姝婕；杨楠；刘雁勇；叶菜英；左萍萍 刊期： 2017年第02期
目的:本研究选择D-半乳糖致小鼠衰老模型为研究对象,探讨DL0410对衰老小鼠认知功能的保护作用,并从线粒体保护角度出发研究其分子作用机制.方法:建立D-半乳糖致衰老小鼠模型,通过行为学实验,评价DL0410对模型小鼠学习记忆的影响.实验设置阳性药对照对奈哌齐和美金刚,行为学实验包括Morris水迷宫、避暗实验、筑巢实验、新物体识别实验,并从线粒体结构和功能角度研究DL0410对其及下游多个层次的保护机制.结果:行为学实验结果表明,DL0410可以明显改善模型小鼠认知功能障碍的作用.在Morris水迷宫定位航行实验中,DL0410可以缩短其搜索时间和搜索距离,缩短其在空间探索实验中首次穿越平台的时间,并增加其穿越平台的次数;在避暗实验中,可以减少错误次数;此外,还可以提高筑巢实验的打分和新物体识别实验中的分辨指数.对脑内胆碱能系统功能进行考察,发现模型小鼠脑内乙酰胆碱酯酶的活性和乙酰胆碱水平未受显著影响,DL0410可以剂量依赖性的抑制脑内乙酰胆碱酯酶活性,提高乙酰胆碱水平,但差异未有统计学意义.对脑内线粒体功能和线粒体超微结构进行考察,发现DL0410可以显著提高线粒体的呼吸控制率(respiratory control ratio,RCR)和氧化磷酸化效率(oxidative phosphorylation rate,OPR),保护线粒体超微结构.对脑内氧化水平进行考察,DL0410可以显著提高谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和过氧化物歧化酶的活性,降低模型小鼠脑内脂质过氧化产物(malondialdehyde,MDA)和晚期糖基终末化产物(advanced glycosylation end products,AGE).从神经炎症角度,DL0410可以通过RAGE/NF-κB信号通路抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化和增生,抑制炎症介质的分泌.通过抑制JNK的激活,抑制脑内凋亡的发生,进而保护突触超微结构,减少突触的丢失.结论:DL0410可以有效改善D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆功能,其可能的机制是,通过保护线粒体的结构和功能,进而抑制脑内氧化应激水平,抑制神经炎症的发生,减少神经元的丢失和突触的破坏,从而改善模型小鼠的认知功能.
作者：连雯雯；刘艾林；杜冠华 刊期： 2017年第02期
β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)聚集体对神经细胞具有毒性作用.将聚集的Aβ注入啮齿类或者灵长类动物的大脑中,发现会引起AD样的神经系统病变.在转基因小鼠模型的脑细胞中也发现了Aβ聚集体的积累.目的:本文主要探讨了Aβ42寡聚体在体外对四种靶细胞的毒性作用,尤其是对靶细胞形态以及行为的影响.方法:选用四种模式细胞株,SH-SY5Y细胞、Hela细胞、HT-1080细胞与MCF-7细胞.首先通过创伤愈合实验和transwell实验分析了Aβ42寡聚体对四种靶细胞迁移性的影响,同时对四种靶细胞的黏附性、侵袭性等,以及骨架蛋白等进行了分析.结果:SH-SY5Y细胞受Aβ42寡聚体影响大,其次是Hela细胞,而另外两种细胞基本不受影响.且随着Aβ42寡聚体浓度的升高,SH-SY5Y细胞的迁移性逐渐下降,呈浓度依赖性.同时四种细胞的黏附性实验也显示,SH-SY5Y细胞的黏附性受Aβ42寡聚体影响较大,与Aβ寡聚体浓度呈现负相关性.另外三种细胞黏附性也降低,但无相关性.这些结果说明,Aβ42寡聚体对神经细胞与肿瘤细胞的毒性作用可能是不同的,神经细胞对Aβ42寡聚体更敏感.Palladin是一种支架蛋白,被证明与细胞的形态变化,运动行为有密切关系.进而我们通过检测在Aβ42寡聚体作用下,四种靶细胞内源性palladin蛋白的表达情况与四种细胞的侵袭性变化,结果发现,SH-SY5Y细胞有较高的palladin表达,且随着Aβ浓度的升高,palladin表达呈现先高后低变化.这一结果与迁移黏附结果相一致,说明Aβ42寡聚体的毒性作用,可能是通过改变palladin水平的变化从而导致细胞行为上的变化.同时细胞侵袭性结果显示,Aβ42寡聚体可能影响细胞MMP-2的分泌,对MMP-9的影响不大.
作者：陈旭；张应玖 刊期： 2017年第02期
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和血管性痴呆是多见的认知障碍性疾病.早期诊断可早期干预,延缓病情发展,提高生活质量.采用基因检测、神经心理量表和功能影像技术对临床队列进行前瞻性和回顾性研究.研究结果显示:①β淀粉样蛋白(β,amyloid protein,Aβ)代谢基因在卒中后认知障碍早期即有改变;②在功能磁共振中mI越高,患者认知水平越差,在APOE4携带者改变更加显著.年龄和APOE4是影响mI与认知状态相关性的主要因素;③白质损伤与认知障碍存在正相关性,伴有腔梗的白质损伤,认知障碍明显高于非腔梗组;④发现MCI中海马萎缩不明显时,NAA/Cr及mI/Cr即有早期改变,提示海马代谢改变可能先于其结构的变化,而且NAA/Cr在转化为AD的MCI中明显降低,在转化为DLB的MCI中没有显著降低,提示NAA/Cr具有鉴别MCI亚型的能力.针对脑灰质微结构(MD值)开展研究,已经自主开发了专用分析工具Brain Search(BS),实现了基于解剖脑区水平可视化DTI参数图的病理改变,发现在aMCI和AD中,MD值升高的脑区具有左侧海马改变并向双侧移行的解剖偏侧性.aMCI和AD的脑灰质水弥散分布规律符合低成本高效率的小世界特性,并在病理条件下脑内功能连接减少,揭示了脑内拓扑网络改变,我们发现了,11个脑内重要的网络连接节点,其中右侧内嗅皮层和额叶眶回两个节点在aMCI中首先破坏.⑤我们还开展了空间导航任务态、嗅觉刺激任务态功能磁共振进行了相关研究,发现相关网络的不完整性.总之,可联合基因和功能影像技术早期诊断认知障碍性疾病.
作者：徐运 刊期： 2017年第02期
目的:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年人常见的神经退行性疾病.目前在中国,AD患者人数已居世界第一,也是全球增速快的国家之一.由于AD病因复杂,目前有β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)沉积假说,炎症反应假说以及tau蛋白异常磷酸化假说,但却没有极为有效的预防及治疗措施.近,基于淀粉样蛋白级联反应假说,一系列淀粉样蛋白(Aβ)抗体及Aβ分泌酶抑制剂被运用到临床试验,但都没有达到预期效果而面临失败.中医药作为传统医药,其药性平和以,副作用小,使用方便,但在AD治疗方面报道甚少.藏边大黄(Rheum australe D.Don,Rt)作为一种传统的藏医药,在临床中,被当作抗炎,抗微生物和抗肿瘤性质的常见药物.本课题基于AD炎症反应假说,旨在探索Rt在AD病理发生过程中的保护作用.小胶质细胞是脑内主要的炎症反应细胞,其活化状态呈现M1伤害型和M2保护型.在AD病理发生过程中,小胶质细胞倾向于呈现慢性活化的M1型.嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CGA)被发现为AD脑内内源性的小胶质细胞活化因子.方法:本课题运用体外实验探索Rt对CGA活化的小胶质细胞的保护作用.①运用RT-PCR技术检测Rt对CGA引起的炎症反应的保护作用;②探索Rt对炎症反应调节的机制;③确定Rt起保护作用的具体有效成分.结果:①Rt显著抑制CGA引起的小胶质细胞的M1极化,表现为抑制了促炎因子(IL-1β,TNFα,iNOS)的表达,促进抗炎因子(IL-10)的表达;②作为促炎症反应的两种主要转录因子NF-κB和STAT-1,其活化能被Rt有效抑制,表现为NF-κB入核率降低,STAT-1磷酸化降低,抗炎因子IL-10表达升高;③在Rt主要的7种成分中,三种成分被验证为有效抗炎成分.结论:①Rt作为传统的藏药,能有效抑制小胶质细胞促炎症的发生并促进抗炎因子的表达;②Rt通过抑制促炎转录因子活化实现抗炎效果;③Rt中的三种有效成分在抗炎过程中起主要作用.本课题运用体外细胞实验探索了Rt在小胶质细胞中抗炎作用的机制及有效成分,在AD治疗药物筛选提供理论依据,为进一步验证Rt在AD发生过程中的保护作用,课题下一步将要进行Rt在AD模型老鼠进行保护作用的探究.
作者：孟婕 刊期： 2017年第02期
目的:β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)聚集形成的老年斑是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的重要病理特征之一,由淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein,APP)经成淀粉途径多次水解形成.人APP基因表达受可变剪接调控,人脑内有三种APP可变剪接异构体产物.根据这些APP可变剪接异构体是否表达外显子7,可分为APP-KPI+和APP-KPI-两种类型.据报道,APP-KPI+在脑内的表达水平与Aβ的产生呈正相关.GSK3β是脑内和AD相关的主要的激酶之一,它的活性在AD脑内增加,是AD治疗中的一个潜在的重要靶点.我们的前期研究发现,二苯乙烯苷(stibene glucoside,TSG)能够减少APP转基因小鼠脑内Aβ含量和淀粉样斑块数量,改善学习记忆功能,但TSG对APP可变剪接和GSK3β的影响尚不清楚.方法:构建包含APP外显子7、8可变剪接的微型基因(mini-gene).人胚胎肾细胞(HEK-293FT)、小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a,N2a)内转染APP mini-gene来模拟APP外显子7、8在体内的剪接.在神经细胞N2a内过表达GSK3β或下调其表达,用RT-PCR和qPCR观察GSK3β对APP可变剪接的影响.在HEK-293FT细胞内共表达剪接因子ASF和磷酸激酶GSK3β,用HA抗体免疫共沉淀ASF,GSK3β抗体检测ASF与GSK3β之间是否存在相互作用.将ASF、GSK3β单独或者共转染至HeLa细胞中,用荧光二抗进行染色,观察ASF和GSK3β的细胞定位.APP/PS1转基因鼠TSG(50 mg·kg-1·day-1)灌胃处理12个月,用Western blot或qPCR观察鼠脑内相关蛋白在mRNA和蛋白水平发生的改变.结果:APP mini-gene在HEK-293FT和N2a细胞系内进行表达,RT-PCR结果可见三个条带,经测序分别是APP770,APP751和APP695.过表达GSK-3β促进APP微型基因产物APP-KPI+在N2a细胞内的表达,siGSK3β则抑制APP-KPI+表达量;不同浓度LiCl处理SH-SY5Y细胞,内源性APP-KPI表达量随LiCl浓度增高而降低.SR蛋白ASF对APP-KPI+的表达影响大,是为重要的APP可变剪接调控因子.GSK3β可以被ASF免疫共沉淀,存在生理上的相互作用,并且免疫共定位实验显示ASF与GSK3β有很好的细胞内共定位.TSG抑制细胞内APP-KPI+的表达量,同时发现细胞内AKT-GSK3β信号通路可被TSG激活.在体内实验中,5月龄APP/PS1转基因小鼠灌胃给药TSG12个月后,脑内AKT和GSK3β磷酸化水平增加,APP-KPI+表达水平降低.结论:成功构建了研究APP-KPI表达的微型基因.TSG可以激活神经细胞和APP/PS1转基因鼠脑内的AKT-GSK3β通路;GSK3β通过与剪接因子ASF相互作用,从而抑制其促进APP-KPI+生成的能力;在体内长期喂食TSG可降低APP-KPI+表达.
作者：尹晓敏；陈晨；黄蕊；张兰；李林 刊期： 2017年第02期
神经药理学报杂志
主管:河北省教育厅
主办：河北北方学院 中国药理学会
