学术投稿

一种可用于多DNA片段连接的新SOE-PCR方法

钟志成;黎诚耀;朱利;张玲;万成松;马丹娟;杨瑜;熊建英;赵卫

关键词:重叠延伸PCR(SOE-PCR), 突变, 多片段连接, EIAV, PLG3-8
摘要:目的 通过对重叠延伸PCR技术的改进,建立一种可用于多DNA片段连接的SOE-PCR方法 .方法 扩增获得相互重叠的1.8、1.1、1.3 kb的短片段,以之作为亚片段模板.在SOE-PCR反应体系中加入不同数量用于重叠的亚片段模板及延伸所得目的 长片段扩增所需的外引物,同时加入了稀释100倍的内引物,使得亚片段模板在扩增过程中能动态达到佳重叠延伸浓度.结果 获得了特异性强、丰度高的两段连接产物,与原有的SOE-PCR方法相比,大大减小了反应的非特异性条带扩增,产物丰度也优于传统的扩增方法 .采用同样方法尝试了单管反应对三个片段进行连接,获得了总长度为4.2 kb的长片段,且实验重复性、特异性好.结论 本研究以相互重叠的多个短片段为模板,实现多片段的连接和扩增,可降低受模板浓度条件的影响的实验操作难度.多片段连接时减少了操作步骤和突变几率,可广泛用于多DNA片段连接操作.
热带医学杂志相关文献
  • 淫羊藿甙腹腔注射对新生大鼠卵巢发育的影响

    目的 应用淫羊藿甙对新生大鼠进行腹腔注射,了解其对卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响.方法 用淫羊藿甙对出生后1~8 d大鼠腹腔注射50 mg/(kg·d),分别取出生后2、4、8 d龄卵巢,用苏木素-伊红(hematoxylin-eoxin,HE)染色观察不同发育阶段卵泡比例,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)荧光染色检测卵巢内卵母细胞凋亡变化.结果 在淫羊藿甙腹腔注射组的新生的鼠中,1、2 d龄卵巢内未装配卵泡比例及4、8 d龄卵巢内原始卵泡比例均高于对照组;各日龄组卵巢中卵母细胞TUNEL阳性率明显低于对照组.结论 淫羊藿甙可能通过延缓卵母细胞巢破裂,抑制原始卵泡的发育启动,减少卵母细胞凋亡从而增加新生大鼠卵巢中卵母细胞的储备量.

    作者:黄菊;傅玉才;许锦阶;罗丽莉 刊期: 2010年第03期

  • 新会区某中学学生艾滋病知晓情况调查分析

    目的 提高中学生对艾滋病的认识,同时了解新会区中学生艾滋病的知晓状况,为今后采取针对性的AIDS健康教育策略提供科学依据.方法 在新会区某中学开展预防艾滋病知识宣传活动,并分别在活动前后对3 653名中学生进行艾滋病知识问卷调查,对问卷结果用SPSS13.0统计软件进行分析.结果 宣教后中学生对艾滋病相关知识知晓率由82.32%上升至91.34%,两者相比差异有统计学意义(P<0.05).学生艾滋病知识主要来源于网络、报纸杂志和卫生工作者宣传等;高年级学生的知晓率比低年级高,男生知晓率比女生高.结论 通过在学校开展艾滋病知识宣教可取得良好效果.

    作者:李秀莺;陈日暖;黄伦英 刊期: 2010年第03期

  • 结直肠癌原发灶与肝转移灶K-ras基因状态的研究

    目的 观察K-ras基因在结直肠癌原发灶及肝转移灶的突变状态.方法 采用富集PCR配对测序法检测46例(男35例,女11例)结直肠癌肝转移患者原发灶及肝转移灶K-ras基因突变状态,其中结肠癌肝转移21例(45.7%),直肠癌肝转移25例(54.3%).结果 46例中有18例(39.1%)原发灶K-ras 基因为突变型,其中17例对应的肝转移灶K-ras基因为突变型,1例对应的肝转移灶K-ras基因为野生型.28例(60.9%)原发灶K-ras基因为野生型者中,26例对应的肝转移灶K-ras基因为野生型,2例对应的肝转移灶K-ras基因为突变型.统计分析表明,原发灶与肝转移灶K-ras基因突变状况差异无统计学意义(P=1.00).结论 转移性结直肠癌原发灶与肝转移灶的K-ras基因突变状态差异无统计学意义.

    作者:廖旺军;孙季萍;谢剑明;申鹏;罗荣城 刊期: 2010年第03期

  • 抗环瓜氨酸肽抗体检测对类风湿关节炎的临床诊断价值

    目的 探讨抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP抗体)检测对类风湿关节炎(RA)诊断的意义.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测115份人血清的抗CCP抗体,同时采用免疫透射比浊法定量检测类风湿因子(RF),包括40例RA患者,45例其它风湿病患者,30名正常人;并分析抗CCP抗体与RF实验结果之间的相关性.结果 在40例RA病人中,抗CCP抗体的阻性率为80.0%,在其它风湿病人中的阳性率为7.0%,抗CCP抗体对RA的敏感性和特异性分别为80.0%、96.0%,其敏感性高于RF,但差异无统计学意义(P>0.05),特异性明显高于RF(P<0.05).联合应用抗CCP抗体与RF进行诊断,二者均阳性时敏感性为65.0%,特异性为97.3%.抗CCP抗体与RF实验结果之间无相关性.结论 抗CCP抗体对RA具有较好的敏感性和很高的特异性,可与RF相互补充,联合检测可提高对RA早期诊断的准确性.

    作者:范婷婷;廖伟娇;欧阳立杰;韩秀晶;万舒婷 刊期: 2010年第03期

  • 一种可用于多DNA片段连接的新SOE-PCR方法

    目的 通过对重叠延伸PCR技术的改进,建立一种可用于多DNA片段连接的SOE-PCR方法 .方法 扩增获得相互重叠的1.8、1.1、1.3 kb的短片段,以之作为亚片段模板.在SOE-PCR反应体系中加入不同数量用于重叠的亚片段模板及延伸所得目的 长片段扩增所需的外引物,同时加入了稀释100倍的内引物,使得亚片段模板在扩增过程中能动态达到佳重叠延伸浓度.结果 获得了特异性强、丰度高的两段连接产物,与原有的SOE-PCR方法相比,大大减小了反应的非特异性条带扩增,产物丰度也优于传统的扩增方法 .采用同样方法尝试了单管反应对三个片段进行连接,获得了总长度为4.2 kb的长片段,且实验重复性、特异性好.结论 本研究以相互重叠的多个短片段为模板,实现多片段的连接和扩增,可降低受模板浓度条件的影响的实验操作难度.多片段连接时减少了操作步骤和突变几率,可广泛用于多DNA片段连接操作.

    作者:钟志成;黎诚耀;朱利;张玲;万成松;马丹娟;杨瑜;熊建英;赵卫 刊期: 2010年第03期

  • 肺叶切除术中行膈神经压扎对肺功能的影响

    目的 探讨肺叶切除术中膈神经压扎对肺功能的影响.方法 40例行肺叶切除的患者,其中20例在行肺叶切除后加行膈神经压扎,另外20例未行膈神经压扎,分别测定其膈肌活动度、肺功能及术后发生并发症情况.结果 两组患者比较,膈神经压扎组患者的膈肌活动度及肺功能均较未压扎组差,膈肌活动度分别为(1.17+0.41)cm和(2.11±0.42)cm(P<0.05);肺功能方面,压扎组患者肺活量、大分钟通气量及第1秒用力呼气量分别为(70.25±5.25)%、(71.42±7.15)%和(65.50±4.51)%,未压扎组分别为(81.24±4.78)%、(80.87±8.65)%和(76.97±6.26)%,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05).但术后并发症的发生率.两组之间并无差别.结论 肺叶切除时行膈神经压扎将进一步降低患者的肺功能,膈神经压扎在肺叶切除术中并非绝对必要.

    作者:谢远财;乌达;牟志民;陈保坤;吴昊 刊期: 2010年第03期

  • 2005-2009年广州市星级宾馆二次供水卫生状况分析

    目的 了解广州市星级宾馆二次供水的卫生状况,为亚运期间制订针对性的卫生保障措施提供依据.方法 收集广州市近5年来星级宾馆二次供水卫生监测的结果 ,整理数据并进行分析比较.结果 5年来星级宾馆二次供水的总体合格率为86.05%,菌落总数的合格率低为85.47%.其次为耗氧量和游离氯,第二、三季度的合格率明显低于第一、四季度.结论 宾馆二次供水在贮存输送过程中受到的污染主要是微生物污染,应加强控制措施以保障中外宾客的健康.

    作者:王志伟;钟嶷;江思力;杨轶戬;王伟鸿 刊期: 2010年第03期

  • 妊娠晚期肝内胆汁淤积症胎儿猝死发病机制的研究进展

    妊娠肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是妊娠期特有的并发症,以妊娠中晚期孕妇发生皮肤瘙痒、黄疸、肝功能生化指标异常为特征.ICP具有较高的胎儿死亡率.

    作者:史爱武;刘晓梅 刊期: 2010年第03期

  • 围生期脑静脉血栓形成与FV Leiden突变的关系

    目的 探讨围生期脑静脉血栓形成与凝血因子V Leiden突变的关系.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性PCR技术(PCR-RFLP)对广州地区汉族8例围生期脑静脉血栓形成及50例正常妊娠妇女进行凝血因子V Leiden突变研究分析.结果 58例研究对象中未发现凝血因子V Leiden突变.结论 FVL突变作为广州地区汉族妇女围生期脑静脉血栓形成的主要危险因素的可能性较小,广州地区汉族妇女FVL突变率较低.

    作者:刘子凡;许治强;陈敦金;林永强;翁惠南;李斯晨 刊期: 2010年第03期

  • 清远市广州管圆线虫宿主动物感染情况调查

    目的 了解清远市广州管圆线虫宿主的感染情况,为防治工作提供依据.方法 按照不同地理位置,选佛冈、连州和清新3个县进行调查,调查当地鼠类及螺类广州管圆线虫的感染情况.结果 共检查鼠类387只,感染率9.56%,检出广州管圆线虫成虫总计139条,平均感染度为3.76条/只;共检查福寿螺223只,感染率为2.69%,平均感染度为241.17条/螺:检查褐云玛瑙螺102只,感染率为2.94%,平均感染度为1条/螺.结论 清远市鼠类和螺类中普遍存在广州管圆线虫感染,说明清远地区为广州管圆线虫的疫源地.

    作者:林燕锋;杨普贤;徐国洪;刘晓明;林凤娣;曲振宇;詹希美;何蔼 刊期: 2010年第03期

  • 冠心病心绞痛三种血瘀证的血浆代谢组学研究

    目的 研究冠心病心绞痛血瘀证(气滞血瘀证、心血瘀阻证、气虚血瘀证)患者的血浆代谢组学变化.方法 对18例健康人、18例冠心病心绞痛血瘀证患者(6例气滞血瘀证、6例心血瘀阻证、6例气虚血瘀证)的血浆样本进行氢核磁共振(1H NMR)检测.通过偏小二乘判别分析(PLS-DA)方法研究各组之间的血浆代谢产物谱差异.结果 各组血浆1H NMR谱的PLS-DA结果显示,与健康人相比,心绞痛血瘀证患者血浆柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖、乙酰糖蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、3-羟基丁酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量较高,高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、苏氨酸、组氨酸含量较低.气虚血瘀证组与其他两个血瘀证组差别较大,而气滞血瘀证与心血瘀阻证差别不明显.与其他血瘀证相比,气虚血瘀证组血浆柠檬酸、3-羟基丁酸、丙酮、氧化三甲胺含量较高,葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量较低.结论 血浆1H NMR代谢谱差异能明显区分健康人与心绞痛血瘀证患者:不能区分心绞痛气滞血瘀证与心血瘀阻证:能在一定程度上区分气虚血瘀证与其他血瘀证.代谢组学方法对于研究冠心病心绞痛中医证候具有重要价值.

    作者:华何与;贾钰华;张红栓;曹世平;崔凯;关山越;万中原 刊期: 2010年第03期

  • 急性百草枯中毒早期多器官损害的临床分析与预警作用

    目的 分析急性百草枯中毒患者早期心、肝、肾功能变化,探讨其对预后的影响.方法 用酶法分别检测68例急性百草枯中毒患者(中毒时间<24 h)入院时心肌酶、血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、血清尿素氮(Bun)、肌酐(Cr)以及检查胸片;统计患者中毒剂量和中毒时间,并进行APACHE Ⅱ评分.依据临床结局分为猝死组(生存时间≤24 h组)和非猝死组(生存时间>24 h组).结果 中毒患者猝死组与非猝死组的中毒时间、中毒剂量比较差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),两组患者年龄、性别比、APACHEⅡ评分比较差异无统计学差异意义(P>0.05);猝死组心肌酶、血清ALT、TBil、Cr均显著升高,与非猝死组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 百草枯中毒猝死患者早期出现严重的中毒性心、肝、肾损害,救治过程中应强调重要器官保护并及早干预;中毒后血清心肌酶活性的显著升高可能是发生猝死的一个预警指标.

    作者:高渝峰;史晶;刘青;廖晓星 刊期: 2010年第03期

  • 重庆市男男性行为人群干预效果评估

    目的 评估针对男男性行为人群(MSM)的干预效果,为调整干预策略提供建议.方法 比较分析2006、2007和2008年3次横断面调查的MSM人群知识、行为、HIV和梅毒感染率变化趋势.结果 2006、2007和2008年分别调查了1 000、1 044和743名MSM,研究结果显示干预后MSM人群艾滋病防治知识知晓率无明显变化,过去1年接受过咨询检测服务的比例明显上升,近一次与男性发生肛交时安全套使用率也由2006年的56.4%上升至2008年的64.4%(χ2=9.25,P=0.002),HIV感染率呈逐年上升的趋势,由2006年的10.4%上升至2008年的17.0%(χ2=15.95,P<0.001),梅毒感染率2007年较2006年有所下降,但差异无统计学意义(χ2=0.38,P=0.54).结论 干预后MSM人群艾滋病防治知识认知水平较高,安全套使用率有所提高,但仍处于较低水平,与HIV感染率快速上升的趋势相比,防治形势严峻,开展针对MSM人群的持续有效的综合干预至关重要.

    作者:丁贤彬;冯连贵;萧燕;晋灿瑞;徐世明;郭晓嘉;卢戎戎;徐静;张敏;郑建琼;杨明芳 刊期: 2010年第03期

  • 桥小脑角脑膜瘤经枕下乙状窦后入路的显微外科手术治疗

    目的 探讨桥小脑角脑膜瘤经枕下乙状窦后入路行显微外科手术治疗的技巧.方法 回顾性分析我科2001年1月至2009年7月间诊治的16例桥小脑角脑膜瘤的临床资料.结果 本组肿瘤全切12例,近全切除4例.术后颅神经功能改善9例,症状无改善或加重者7例,术后出现脑脊液漏2例,后组颅神经损伤者2例,无死亡病例.结论 桥小脑角脑膜瘤可选择经枕下乙状窦后入路,术中注意对血管、神经和脑干的保护,提高切除肿瘤的技巧,预防和处理术后并发症,是保证手术疗效和术后生活质量的关键.

    作者:苟志勇;谭华;翟安林 刊期: 2010年第03期

  • 阳山县医务人员艾滋病职业暴露知识与锐器刺伤状况调查

    目的 了解阳山县医务人员对艾滋病职业暴露知识的知晓程度和医护过程中锐器刺伤暴露情况.方法 采用整群抽样方法选择阳山县3问县级医院及5间乡镇卫生院,于2008年9月对其572名医务人员进行问卷调查.结果 572名医务人员艾滋病职业暴露相关知识总体知晓率为59.03%,其中对艾滋病的传播途径知晓率高为98.78%;不同医院级别、职业、职称和科室之间医务人员以及是否曾参加过相关培训者掌握艾滋病职业暴露相关知识的程度有不同(P<0.05);37.24%的调查对象承认在医疗护理过程中曾经被针具利器刺破皮肤经历,不同职业、职称和科室之间医务人员职业暴露发生率不同(P<0.05).结论 阳山县医务人员对艾滋病职业暴露相关知识掌握较差,发生锐器刺伤等的职业暴露率较高,有必要加强培训,提高医务人员艾滋病职业暴露相关知识和自我防护能力.

    作者:梁时力;黄新华;黄安 刊期: 2010年第03期

  • 猪带绦虫乳酸脱氢酶A和B的生物信息学比较分析

    目的 预测及比较分析猪带绦虫乳酸脱氢酶A(Taenia solium lactate dehydrogenase A,TsLDH-A)和乳酸脱氢酶B(Taenia solium lactate dehydrogenase B,TsLDH-B),用于指导其生物学功能的研究.方法 利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,http://ca.expasy.org/)中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别LDH-A和LDH-B的全长编码基因并对其结构与功能进行生物信息学预测分析.结果 两序列都是包含完整开放阅读框的全长基因,推导出的氨基酸序列与其它物种LDH-A或LDH-B同源基因的氨基酸序列的一致性均大于50%.两者编码的蛋白在编码的氨基酸数目(331)、蛋白的理化性质、L-乳酸脱氢酶结构域、构成LDH酶催化中心的关键氨基酸、包含LDH活性位点的线性表位、无亚细胞定位等方面是一致的,但两者在翻译后的修饰位点、3个跨膜区和其他线性表位方面既相似也有区别.结论 应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了TsLDH-A和TsLDH-B的cDNA全长序列,并预测和比较了两者结构与功能方面的信息,为进一步研究所编码蛋白的功能奠定了基础.

    作者:杜武英;戴佳琳;黄艳;胡旭初;余新炳;徐劲;廖兴江;黄江 刊期: 2010年第03期

  • 非编码基因MALAT1功能性序列真核表达载体的构建及其在SW620细胞中的表达

    目的 构建人肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)功能性序列重组真核荧光表达载体,并在人大肠癌SW620细胞株中表达.方法 采用RT-touchdown PCR方法 ,从人正常大肠黏膜组织中提取总RNA,扩增MALAT1功能性序列,将扩增产物克隆至pTA2载体,测序证实后,克隆至pEGFP-C1质粒中,构建重组真核荧光表达载体;阳离子脂质体介导下转染人大肠癌SW620细胞,荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.通过Real-time PCR检测质粒转染前后MALAT1/fgf mRNA表达水平的变化.结果 经pTA2载体和pEGFP-C1载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实人MALAT1功能性序列重组真核荧光表达载体构建成功.在荧光显微下观察到带绿色荧光的SW620细胞.pEGFP-C1-MALAT1/fgf转染前后SW620细胞MALATI/fgf mRNA表达水平倍比关系为2.376±0.573,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了人MALAT1功能性序列真核荧光表达载体pEGFP-C1-MALAT1/fgf,转染SW620细胞后可引起MALAT1/fgf mRNA表达上调,为进一步研究MALAT1的结构、功能及其与人大肠癌的关联奠定了基础.

    作者:杨敏慧;王双双;王晓燕;徐川;李祖国 刊期: 2010年第03期

  • 2004-2008年荔湾区生活饮用水水质监测分析

    目的 了解荔湾区自来水管网末梢水和二次供水的生活饮用水水质情况,评价卫生监测的效果.方法 对广州市荔湾区芳村2004-2008年管网末梢水和二次供水水质监测资料进行统计,按照<生活饮用水检验规范>卫生部(2001年)和<生活饮用水卫生标准>GB5749-2006进行分析评价.结果 该地区生活饮用水的合格率为91.30%,管网末梢水的合格率95.17%高于二次供水的合格率85.88%,而铅合格率前者的98.53%明显高于后者的88.53%(P<0.001).第四季度水质合格率低,分别为86.90%、76.67%.结论 荔湾区芳村生活饮用水水质较广州市水质总体合格率高,但二次供水水质较差.不同季节水质变化较大.今后要加强生活饮水尤其是二次供水的管理,提高出厂水的消毒质量,加强二次供水设施的新技术、新工艺的研究.

    作者:张建昌 刊期: 2010年第03期

  • 江门市某区淡水鱼肝吸虫感染与环境卫生情况调查

    目的 了解江门市某区淡水鱼养殖场的淡水鱼肝吸虫感染和环境卫生情况,为制定防控策略提供参考.方法 在江门市某区选取5个镇的6个行政村开展调查,制定统一的调查表,主要调查内容包括养殖场基本情况、人和动物粪便污染情况等;采取部分养殖场的淡水鱼进行肝吸虫囊蚴检验.使用EpiData3.0建立数据库.用Epiinfo3.5.1进行统计分析.结果 共调查了67间淡水鱼养殖场,16间塘基建有厕所,占被调查养殖场总数的23.88%(16/67);48间塘基建有家禽或家畜栏,占被调查总数的71.64%(48/67).抽样检测了10间养殖场的淡水鱼,共有6间养殖场淡水鱼中检出肝吸虫囊蚴,占受检总数的60%(6/10),各村均有受肝吸虫感染的养殖场.共采集了156条淡水鱼,囊蚴总阳性率为15.38%(24/156).鲩鱼的感染率高(5/10),其次为鳙鱼(11/47).结论 江门市某区人和动物粪便污染淡水鱼养殖场水质的情况较为普遍,淡水鱼感染肝吸虫囊蚴的情况仍然严重,应当采取有效措施改善环境卫生,降低淡水鱼肝吸虫感染率,以制止肝吸虫病的流行.

    作者:晁斌;张贤昌;林荣幸;杨杏芬;裴福全;卢文成;王金龙;岑咏珍;林卫光;张启明 刊期: 2010年第03期

  • 藏药中金属铜对继发性棘球蚴病小鼠体内细胞因子影响

    目的 应用藏药二十五味铜灰散的成分之一--自然铜和天竺黄治疗小鼠继发性棘球蚴病,探讨药物治疗感染棘球蚴的小鼠后其体内细胞因子的变化趋势.方法 感染棘球蚴小鼠给予藏药、自然铜及其它药物治疗90 d后,剖杀小鼠眼球获取小鼠血清.检测小鼠血清中的细胞因子IL-2、IL-6、IL-10和IgE的含量.结果 治疗90 d后,小鼠血清IL-2、IL-6和IgE的含量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),IL-10的含量与对照组比较差异无统计学意义.结论 小鼠血清中的细胞因子IL-2、IL-6、IL-10和IgE的含量可作为判断治疗棘球蚴病的疗效指标.

    作者:曹得萍;白海燕;赵海龙 刊期: 2010年第03期

热带医学杂志

热带医学杂志

主管:广东省科学技术协会

主办:广东省寄生虫学会 中华预防医学会