何清义；李起鸿
目的用离心管聚集体培养(Aggregate culture)诱导转化人关节细胞的Ⅱ型胶原.方法将体外长期培养的第30、40、50代转化软骨细胞消化后进行离心管培养,比较细胞在单层培养、离心管聚集体培养,以及在普通培养基,BAI诱导培养基下[2型骨形态发生蛋白(BMP-2)+抗坏血酸盐(Ascorbate)+胰岛素(insulin)],Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的表达和胞外基质产生情况.结果在单层培养条件下,转化软骨细胞只表达Ⅰ型胶原,而在BAI诱导培养基及离心管聚集体培养下转化软骨细胞表达丰富的Ⅱ型胶原和大量胞外基质. 结论离心管聚集体培养是诱导转化软骨细胞Ⅱ型胶原的有效方式.
作者：何清义；李起鸿；许建中；杨柳 刊期： 2002年第05期
目的了解肝脏局部浸润淋巴细胞是否存在AICD现象及其意义.方法采用S-P法检测10例慢性重型乙型肝炎肝组织Fas和FasL表达.结果 10例慢性重型乙型肝炎肝内浸润淋巴细胞和肝细胞皆有不同程度的Fas和FasL的表达,Fas和FasL在淋巴细胞和肝细胞皆以膜浆型表达为主.结论慢性重型乙型肝炎肝组织内细胞损伤的效靶关系十分复杂,肝组织浸润淋巴细胞存在激活诱导细胞死亡现象,浸润的淋巴细胞可能通过Fas/FasL介导的凋亡途径而下调免疫反应.
作者：李玲；顾长海；王雅凡 刊期： 2002年第05期
目的探讨白介素-1(IL-1)mRNA及蛋白在缺血心肌的表达规律及与再灌注损伤之间的关系,并观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对缺血组织的影响.方法大鼠116只,随机分设缺血再灌注组(IR组),IR+NAC治疗组和假手术对照组(Sham组);先缺血60 min,然后分设再灌注1、3、6、12、24 h共5个时相点;治疗组于缺血10 min腹腔注射NAC160 mg/kg.于各相应时相点活杀动物取缺血区心肌待测.IL-1 mRNA表达用原位杂交检测,用免疫组织化学法测定其蛋白表达,心肌组织MDA用硫代巴比妥酸比色法测定,心肌组织SOD活性测定用黄嘌呤过氧化物酶法,心肌组织ATP酶活性用磷比色法测定,心肌梗塞范围测定用TTC染色法.结果心肌IR后,IL-1 mRNA及蛋白质表达明显增高,分别于3,6 h达高峰,心肌MDA含量明显增高而SOD、Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性明显降低,心肌梗塞范围于24 h内呈逐步增加趋势;IL-1表达水平与心肌梗塞范围变化之间无明显相关性,但与MDA之间呈明显正相关,与SOD、Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase之间呈明显负相关;NAC可使上述生化指标的变化明显改善,心肌梗塞范围缩小.结论缺血再灌注过程中心肌IL-1表达水平明显增加,NAC可抑制IL-1 mRNA及蛋白表达水平并使心肌梗死范围缩小.
作者：司良毅；陈运贞 刊期： 2002年第05期
全子宫切除术是妇产科常见手术之一,针对该手术难点集中在对盆腔深部的子宫血管及宫颈的处理这一问题,我们设计了分段式筋膜内全子宫切除术,共施行216例,与同期传统术式相对照[1],效果满意,现报道如下.
作者：杨鹰；李幼飞 刊期： 2002年第05期
目的构建人乳头瘤病毒16型E7基因片段(HPV16E7)的逆 转录病毒载体.方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段,并用酶切、连接 等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上,然后再用酶切、测序进行鉴定.通过Ge nbank 的数据库分析软件对HPV16E7进行同源性分析.结果经酶切分析、测序证明,从HPV16 cDNA克隆的300 bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组,HPV 16E7基因片段与数据库中的原HPV16 cDNA的E7有高度的同源性.结论构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体,为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础.
作者：何清义；李起鸿 刊期： 2002年第05期
目的观察将骺板软骨细胞接种于自制的生物凝胶经体外培养生成软骨组织的生物学特点,初步评价这一凝胶基质作为软骨组织构建材料的生物学性能.方法将第一代骺板软骨细胞接种于生物凝胶进行体外培养,行大体、倒置显微镜以及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察.结果骺板软骨细胞-生物凝胶复合物,在体外培养过程中不能维持其初始外形,培养1周直径可收缩为初始的45%,但能保持种子细胞的稳定均相分布.经体外培养2周后由外周向中心逐渐形成软骨组织,表面为由1～3层梭形细胞组成的膜样结构,内部细胞主要为圆形细胞,有细胞外基质相隔,形成软骨细胞陷窝.基质中富含软骨特异性基质成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖,而Ⅰ型胶原免疫组化逐渐转为弱阳性,位于表面膜结构.结论这一生物凝胶具有良好的细胞相容性,适合软骨细胞在其中生成成熟的工程化软骨,但难以维持其初始外形.
作者：周强；李起鸿；杨柳；戴刚 刊期： 2002年第05期
目的建立一种快速、准确的脑内兴奋性氨基酸定量检测方法.方法采用6300黄金系统氨基酸分析仪,在锂柱130 min程序生理体液分析方法基础上,根据兴奋性氨基酸(EAAs)的特性,建立了EAAs的快速测定方法.结果此方法完成兴奋性氨基酸分析的时间是20 min,比原方法缩短了110 min;且有较好的重现性(Glu CV:日内1.86%,日间2.32% ;Asp CV:日内1.42%,日间2.48%)和回收率(Glu 97.7%;Asp 97.3%).并用此方法观察了高原低氧大鼠下丘脑EAAs的含量变化.结论本方法定量检测兴奋性氨基酸快速、准确,并利于大批量样品的快速测定.
作者：孙玮；潘峰；张正治 刊期： 2002年第05期
目的评定两种自制支架材料DL-聚乳酸支架、聚磷酸钙纤维对体外培养关节软骨细胞生长与代谢的影响.方法采用材料样品与体外单层培养关节软骨细胞直接接触法,并对其进行倒置显微镜观察、培养细胞计数与DAN含量及其细胞外基质35S掺入量和羟脯氨酸含量测定.结果两种支架材料可与培养关节软骨细胞完全相容,无关节软骨细胞毒性;对培养关节软骨细胞的DNA、蛋白多糖及胶原合成无异常影响.结论两种支架材料具有良好的关节软骨细胞相容性,对其功能物质的合成无异常影响,经其结构与性能优化,即可满足关节软骨组织工程制备技术的各项要求.
作者：戴刚；石宗利；李起鸿；李重庵 刊期： 2002年第05期
我院自1998年8月至2001年8月共收治60例伴有ALT、GGT升高的结石性胆囊炎病人,其中34例两酶同时升高.现就ALT、GGT升高的原因及手术治疗指征分析讨论如下.
作者：钟彦文；郭渝明；聂伟 刊期： 2002年第05期
目的观察骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)在软骨细胞培养条件下传代培养的主要生物学特性.方法梯度离心分离幼兔骨髓有核细胞,培养分离MSCs并进行传代培养,观测在体外软骨细胞培养条件下MSCs形态、生长特点及Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体合成分泌以及碱性磷酸酶活性等方面的变化.结果①MSCs原代细胞呈可见的均匀分布的簇状生长,呈长梭形,在传代培养中形态特性无明显变化、均质性明显提高;②各代Ⅰ型胶原免疫组化均为阳性,Ⅱ型胶原免疫组化均为阴性.③在各代培养中碱性磷酸酶染色均为阴性,对甲苯胺蓝存在极弱的异染性反应;④细胞外基质中硫酸糖胺多糖含量亦很低.结论传代培养中骨髓MSCs保持了常规低糖培养条件下的基本生物学特点,说明常用的软骨细胞基础培养条件同样适合骨髓MSCs的培养.
作者：周强；李起鸿；杨柳；段小军 刊期： 2002年第05期
目的研制符合骨与软骨组织工程制备技术要求的新型支架复合材料;并确定其性能与结构优化设计的主要参数指标.方法按不同CPPf(聚磷酸钙纤维)/PLLA(L-聚乳酸)重量比及相同CPPf+PLLA/NaCl 颗粒重量比,采用溶铸颗粒沥取(Solvent-casting particulte-leaching)法制备系列CPPf/PLLA支架复合材料;液体置换法、压缩性能测试及扫描电子显微镜观测其密度、孔隙度、压缩模量及微结构特征;材料样品体外人工降解液直接浸渍法判定其生物降解性能,并观测其生物降解率、压缩模量及微结构改变.结果系列支架材料密度为0.108～0.165 g/cm3,孔隙度87.17%～93.24%,压缩模量为5.19～7.89 MP,横截面微结构由微孔海绵状过渡为纤维网状.随着支架材料在人工降解液中降解时间的延长,其降解率以0%～13.2%线性递增;压缩模量呈线性降低至1.10～2.78 MP;材料横截面微结构则发生相应改变. 结论 CPPf/PLLA支架复合材料具有高孔隙度的三维立体结构,良好的抗压缩性能和生物降解性能,经进一步优化设计后,可成为结构和性能符合各项要求的新型骨与软骨组织工程支架材料.
作者：戴刚；石宗利；李起鸿；李重庵 刊期： 2002年第05期
目的探讨骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)诱导成骨过程中骨胶原氨基酸的变化规律及转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1 , TGF-β1)对骨胶原生成的影响,进一步阐明BMP的诱导成骨机制和TGF-β1对骨损伤修复的调节机制.方法实验采用日本大耳白兔左尺骨中上段12mm骨缺损实验模型,随机分为实验组、对照组及空白组,缺损内分别植入BMP/TGF-β1/载体、BMP/载体及单纯载体.分别于术后第1、2、3、4、5周检测各组缺损区胶原羟脯氨酸(Hydroxyproline, HP)及羟赖氨酸(Hydroxylysine, HL)量的变化,并作胶原VG染色图像分析、组织学及电镜观察.结果实验组较同期对照组及空白组胶原HP生成量增加,成骨细胞数量增多,Ⅰ型胶原生成时间提前、生成量增加,胶原总量也明显增加,骨损伤修复时间缩短.结论 TGF-β1可使骨胶原在BMP诱导成骨过程中生成增加.TGF-β1通过促进成骨细胞生成使Ⅰ型胶原分泌能力增强,并抑制Ⅱ型胶原产生使软骨期缩短,骨损伤修复提前.BMP、TGF-β1两者在骨损伤修复中相互加强,具有协同作用.
作者：谭祖键；李起鸿；许建中；杨柳；曹佳；潘峰；孙玮 刊期： 2002年第05期
目的研究左旋精氨酸(L-ARG)对未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用.方法实验采用幼兔离体心脏灌注模型,实验分为:①对照组:以K-H液(Krebs-Henseleit solution)再灌注;②L-ARG组;K-H液加入L-ARG(1 mmol/L);③N-亚硝基左旋精氨酸(L-NNA)组:加入L-ARG(1 mmol/L)和L-NNA(2 mmol/L).各组均以Thomas2号液为心停搏液,15～20 ℃缺血90 min,再灌注30 min.测定缺血前,再灌注中心功能指标和冠脉流出液中一氧化氮、内皮素含量以及缺血前、再灌注后心肌组织脂质过氧化产物丙二醇含量.结果①对照组和L-NNA组再灌注后一氧化氮含量下降(P<0.05) ,L-ARG组无下降, ②L-ARG组再灌注后心功能恢复优于对照组和L-NNA组(P<0.05).③L-ARG组再灌注后心肌组织丙二醛含量和冠脉流出液中内皮素含量低于对照组和L-NNA组(P<0.05).结论未成熟兔心肌缺血再灌注后一氧化氮合成释放减少,再灌注早期补充左旋精氨酸增加一氧化氮生成量.左旋精氨酸对未成熟心肌缺血再灌注损伤具有良好的保护作用.
作者：王学锋；肖颖彬；曾祥君 刊期： 2002年第05期
目的提取牛骨形态发生蛋白,并观察其对人骨髓基质细胞的体外成骨分化作用,为将骨形态发生蛋白与骨髓基质细胞用于进一步的骨缺损修复研究提供实验依据.方法从小牛骨中提取骨形态发生蛋白,配制条件培养液,并作用于培养状态的人骨髓基质细胞,染色检测细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原表达情况,放免法测定培养液中骨钙素含量.结果人骨髓基质细胞经诱导培养后,碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素表达明显增加.结论体外培养时,天然骨形态发生蛋白可促进人骨髓基质细胞的成骨分化.
作者：段小军；杨柳；王铁翔；谭祖键 刊期： 2002年第05期
目的应用组织工程学技术,体外初步构建有活性的人工骨.方法培养、诱导人间充质干细胞向成骨细胞表型转化,制备性能优越的支架材料,将细胞与材料复合构建人工骨,在体外培养一定时间后,扫描电镜观察组织工程化骨的微观结构和消化细胞行碱性磷酸酶染色.结果 L-聚乳酸、聚磷酸钙纤维、Ⅰ型胶原按一定的方法可构建出新型的骨组织工程复合支架材料,诱导后的间充质干细胞可在材料内良好贴附生长,维持成骨细胞表型.结论本实验为骨组织工程学的进一步研究与应用提供了新的材料和方法.
作者：段小军；杨柳；石宗利；周强 刊期： 2002年第05期
目的应用组织工程的原则,种植成纤维细胞于人羊膜细胞外基质(HA-ECM)以修复兔的肌腱缺损.方法从胎兔分离的成纤维细胞用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后种植于人羊膜细胞外基质上.以1 cm长的兔跟腱缺损为修复对象,用聚酯聚二氧杂环己烷缝线(PDS)轴心桥接肌腱缺损,外包种植有成纤维细胞的HA*ECM膜.术后进行功能锻炼.结果成纤维细胞在HA*ECM上生长良好,放射状或平行排列.成纤维细胞-HA-ECM组能够修复肌腱缺损并且腱化的速度和质量明显优于仅用PDS和HA-ECM(无成纤维细胞)修复组,与正常肌腱相似,抗张强度达正常腱的81.8%.BrdU 免疫组化显示成纤维细胞在腱化过程中起了重要的作用.术后的功能锻炼促进了修复腱的腱化及抗张强度的提高.结论成纤维细胞-HA*ECM膜能够有效修复肌腱缺损,可作为肌腱修复的另一种选择方法.
作者：何清义；李起鸿；许建中；杨柳 刊期： 2002年第05期
目的建立生长期大鼠长骨成骨细胞体外培养实验模型并观察其生长及骨化过程.方法以10周龄Wistar大鼠股骨、胫骨为材料,采用酶分次消化法分离成骨细胞,经DME:F-12加10%胎牛血清的培养基原代和传代培养或含50 μg/ml L-抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠的培养基连续培养,追踪观察成骨细胞在体外培养中的增殖及形态变化,并通过Giemsa、ALP及von Kossa染色技术,观察细胞体外基质分泌和骨化过程.结果①大鼠长骨成骨细胞具有体内成骨细胞的形态特征,增殖代谢旺盛,其群体倍增时间为78 h.②成骨细胞分泌形成球形和无定形基质.③当给予钙化条件培养时,细胞形成钙化骨基质.④大多数细胞ALP染色呈阳性并与基质的钙化密切相关.结论培养的生长期大鼠长骨成骨细胞具有成骨细胞的某些生物学行为,为儿童骨生长及调控的研究提供了一种实验模型.
作者：王华；黎海芪；杨锡强；瞿平；刘瑜 刊期： 2002年第05期
目的观察吸附有BMP-2和TGF-β1的PLLA/CPPf多孔材料植入股骨头坏死(Femur head necrosis,FHN)病灶清除区后的组织学变化,评价其诱导成骨活性及生物降解性,以探索FHN治疗的新方法.方法在激素诱导性兔FHN模型上行坏死病灶清除术,以该种材料充填骨腔,行大体和组织学光镜观察.结果①大体观察,术后2周充填区周边出现反应带;6周周边反应带基本消失,有骨小梁长入充填区;12周骨小梁已布满充填区.②光镜观察,术后1周充填区周围间充质细胞大量增生,纤维肉芽组织形成,开始且持续呈网状长入充填区;2周周边有新骨产生,以后不断增加并向充填区中心延伸,材料逐渐降解,12周充填区广布相对较成熟的骨小梁.结论 PLLA/CPPf多孔隙材料是生长因子的良好吸附载体,具有较好的生物相容性和生物可降解性,适合活组织长入.吸附有BMP-2和TGF-β1的PLLA/CPPf多孔隙材料具有较强的诱导成骨能力,能有效地提高在骨坏死病理条件下股骨头的骨修复能力.
作者：周强；石国华；杨柳；谭祖键；戴刚；唐康来 刊期： 2002年第05期
目的获取具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白. 方法构建CTLA4胞外区(CTLA4125)蛋白的酵母表达载体,在GS115酵母细胞中表达.通过硫酸铵粗分离和离子交换层析等 ,获取纯化的目的蛋白,并在CTLL2细胞中鉴定活性.结果质粒在GS115酵母中可较高水平地表达CTLA4胞外区蛋白.经纯化后的蛋白可抑制IL-2刺激的CTLL2细胞的增殖.结论 GS115酵母可高效表达具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白.
作者：朱瑾；吴军；易绍萱；陈希炜；郑峻松；罗高兴；张宁 刊期： 2002年第05期
目的观察高数量骺板软骨细胞的离心管内长期聚集培养生成软骨组织的大小和生物学特点,并对这一培养技术进行初步评价.方法酶消化法分离幼兔骺板软骨细胞,以90×104原代细胞经离心沉降于15 ml塑料离心管底聚集培养,行大体、倒置显微镜以及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察.结果培养生成的软骨,随培养时间的延长体积逐渐增大,4周时直径大为4.5 mm;外周组织结构类似于骺软骨的生发层或软骨膜,由多层细胞构成,随时间的延长而减少;中心部位为肥大的软骨细胞,随培养时间的延长而增多.2周后,甲苯胺蓝染色呈强的异染反应,Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性;Ⅰ型胶原的免疫组化着色明显减弱,主要位于外周.结论离心管内工程化软骨构建技术所需操作简便、设备简单,生成的工程化骺板软骨具有良好的软骨结构和富含软骨特异性基质成分,增加细胞数量可使形成的软骨体积有所增大,但其大小和形状仍很有限.
作者：周强；李起鸿；戴刚；杨柳 刊期： 2002年第05期
第三军医大学学报杂志
主管:第三军医大学
主办：第三军医大学
