傅晓岚；周伟；王晴；杨曌；谢谆怡；吴玉章
目的 研究云芝、丹参有效成分抗肿瘤作用及其免疫调节机制.方法 建立EAC荷瘤小鼠,并随机分为6组,连续给药30d后,测定其抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数以及外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+.结果 运用单因素方差分析进行统计学分析.结果 云芝、丹参对肿瘤均有明显的抑制作用(P<0.01);云芝+丹参组胸腺指数高于NS对照组(P<0.05),各用药组胸腺指数明显高于阿霉素对照组(P<0.05);外周淋巴细胞分群:云芝组,云芝+丹参组CD3+、CD4+百分率高于NS对照组(P<0.05);各用药组CD3+、CD4+百分率明显高于阿霉素对照组(P<0.05);除云芝+丹参+阿霉素组外,各用药组CD4+/CD8+比值高于NS组(P<0.05),明显高于阿霉素组(P<0.01).结论 云芝、丹参具有明显的抗肿瘤作用和免疫调节作用,二者联用对免疫调节有一定协同作用,其抗肿瘤机制可能通过提高免疫力来实现.
作者：祝绚；鲍依稀；李进；刘靖；王宏萍 刊期： 2008年第03期
目的 通过RNA干扰研究Rac2蛋白对树突状细胞(DC)交叉递呈的影响.方法 首先构建针对Rac2基因siRNA的慢病毒载体pFIVsiRNARac2-1,pFIVsiRNARac2-2,pFIVsiRNARac2-3;DNA-磷酸钙共沉淀的方法转染293FT细胞包装慢病毒,嘌呤霉素(puromycin)筛选病毒感染的阳性DC2.4(树突状细胞系),Western-blot检测其干扰效率;然后用B3Z细胞(H2-Kb限制性,SIINFEKL特异性T细胞杂交瘤)检测筛选后的DC2.4细胞交叉递呈的能力.结果 酶切和测序结果证实表达siRNA的慢病毒载体构建成功,抗原递呈实验发现下调了Rac2蛋白表达的DC2.4细胞交叉递呈能力下降.结论 初步证实了Rac2蛋白参与树突状细胞对外来抗原的交叉递呈,为进一步了解树突状细胞交叉递呈的分子机制奠定了基础.
作者：李娜；邹丽云；万瑛；张晋宇；刘婷；李景怡；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与P-gp在结肠癌组织中的表达及意义.方法 采用免疫组织化学技术(SP法)及免疫荧光双重标记技术检测结肠癌组织标本中HIF-1α与P-gp的表达和分布,并分析其相互关系.结果 免疫组化结果显示:HW-1α与P-gp的表达不受患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度的影响(P>0.05),但在不同Dukes分期和是否伴随淋巴结转移等因素中二者表达的阳性率呈显著差异(P<0.05);相关分析显示二者表达呈显著正相关(P<0.01);免疫荧光双重标记结果显示:HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中存在共表达现象.结论 HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中表达的相关性及共表达现象,提示HIF-1α可能与P-gp表达存在一定关系,相互作用共同参与了结肠癌多药耐药的发生.
作者：丁震宇；梁后杰 刊期： 2008年第03期
天然免疫系统要依赖模式识别受体识别人侵的外源病原微生物,然后将其清除.哺乳动物主要具有两类微生物识别系统,一类是膜结合受体,如Toll样受体,可识别胞外微生物,然后活化细胞内信号来激发机体的免疫反应;另一类是细胞内的模式识别受体,包括NOD样受体和具有螺旋酶结构域的抗病毒蛋白RIG-1和MDA5.这些胞浆分子可识别病原微生物、非微生物以及一些危险信号,在机体的健康与疾病中发挥着十分重要的作用.本文就细胞内天然免疫受体的种类和功能作一综述.
作者：闫鸿斌；高闪电；贾万忠；才学鹏 刊期： 2008年第03期
目的 建立一种用流式细胞仪检测体内细胞毒效应的方法.方法 用不同浓度的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞和非靶细胞,以1:1的比例混合靶细胞和非靶细胞,尾静脉回输小鼠,16h后取小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞仪检测CFSE标记靶细胞和非靶细胞的比例,测定体内被杀伤靶细胞的百分率.结果 荧光染料CFSE能有效标记靶细胞,16h后流式细胞仪能很好地检测到体内被杀伤靶细胞的百分率.结论 CFSE荧光染料标记靶细胞并结合流式细胞仪分析的方法能有效地检测到体内细胞毒效应,该技术有望在肿瘤免疫和移植排斥的体内监测中得到广泛应用.
作者：傅晓岚；杨曌；王莉；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-ETc嵌合基因并表达融合蛋白,以期获得防治HPV16感染及相关肿瘤的疫苗.方法 以HPV16型的中国人野毒株为模板,利用PCR克隆技术制备HPV16 L1-E7c嵌合基因,并转入原核表达载体pET28a(+),获得pET28a(+)-L1-E7c表达质粒.以Western blot方法鉴定融合蛋白与HPV16 L1和E7抗体的特异性结合.应用蛋白纯化仪纯化HPV16 L1-E7c融合蛋白,经过复性后,电镜观察病毒样颗粒(cVLP)的形态结构.纯化的蛋白免疫动物,测定疫苗抗肿瘤的细胞免疫及抗体产生情况.结果 经过序列分析和酶切鉴定表明成功构建了HPV16L1-E7c嵌合基因,并在大肠杆菌中可高效表达L1-E7c融合蛋白.此融合蛋白具有HPV16 L1和E7的抗原性,纯化的蛋白复性后可形成嵌合病毒样颗粒(cVLP),纯化的蛋白免疫动物后,产生特异性细胞和体液免疫反应,具有抗肿瘤活性.结论 构建的嵌合基因HPV16L1-E7c可有效表达HPV16 L1-E7c重组蛋白并形成cVLP.此蛋白在动物实验中具有疫苗的免疫保护作用,为HPV16疫苗的研究奠定了实验基础.
作者：刘朝奇；许雪帮；徐建青；李昆；司静懿；刘世德 刊期： 2008年第03期
目的 在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法.方法 采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-II过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的 蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析.终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定.结果 在培养至工程菌菌体湿重约200~250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的 蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L.发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的 (体积浓缩约2/3).再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,终目的 产物的纯度达98%以上,得率达32.5%.且纯化的目的 蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性.结论 酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的 蛋白、酵母色素及脱盐的目的 ,为规模化制备hPAB-β创造了前提.
作者：陈志瑾；丛延广；周莹冰；侯瑞；胡福泉；饶贤才 刊期： 2008年第03期
目的 原核表达具生物学活性的重组人N端缺失甘露聚糖结合凝集素(rhMBLΔN)蛋白.方法 应用PCR技术,从含中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增rhMBLΔN基因片段,插入pET43.1a载体后,转化E.coli BL21(DE3)感受态菌诱导表达rhMBLΔN蛋白.应用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化目的 蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA进行鉴定.结果 从pGEM-MBL中扩增到长约620bp的DNA片段,构建的重组表达载体经Bam HI和Eco RI酶切后出现约7270bp和620bp的片段,测序结果与预期的完全一致.表达的重组蛋白纯化后,经SDS-PAGE鉴定为Mr97000的蛋白.ELISA证实,纯化蛋白能与抗重组人MBL抗体结合,具备配体结合活性并能与人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1、2的N端片段结合.结论 获得了可表达rhMBLΔN的菌株和具活性的rhMBΔN蛋白,为进一步研究提供了条件.
作者：雷鸣；左大明；王明永；张雅妮；陈政良 刊期： 2008年第03期
目的 研究NF-κB的诱捕寡核苷酸(decoy-oligonucleotides, Decoy-ODNs)对小鼠肺原代成纤维细胞I型胶原形成的影响,为防治肺纤维化的发生提供理论基础.方法 设计合成针对NF-κB的Decoy-ODNs,用阳离子脂质体转染小鼠肺原代成纤维细胞,用凝胶迁移变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)研究Decoy-ODNs对NF-κB的抑制作用,RT-PCR观察对成纤维细胞I型胶原合成的影响.结果 NF-κB的Decoy-ODNs可竞争抑制核转录因子NF-κB的活性,Decoy-ODNs作用18h后,成纤维细胞I型胶原mRNA的表达明显降低.结论 Decoy-ODNs可以通过拮抗核转录因子NF-κB的活性而抑制I型胶原纤维的表达,为防治肺纤维化的发生提供理论基础.
作者：杨雪梅；王兴胜；崔社怀 刊期： 2008年第03期
目的 探讨HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中差异表达的基因并对其基因表达谱进行生物学信息分析.方法 用Trizol一步法提取HepG2细胞及HepG2.2.15细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,与基因芯片杂交;采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因.结果 在54614个基因表达谱的筛选中,发现有4462个基因表达水平显著上调,2592个基因表达水平显著下调.结论 HBV基因组及其表达产物对于肝细胞基因表达谱有显著影响,可能参与了肝癌的发生发展.
作者：汤玉瑜；陈永文；费蕾；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 设计、构建猪链球菌GDH真核表达载体并研究DNA疫苗免疫小鼠的体液免疫.方法 在猪链球菌保护性抗原GDH基因5'末端引入人IL-2信号肽序列,通过PCR进行拼接,得到的融合DNA片段经过酶切克隆入质粒pcDNA3.0,构建核酸疫苗重组质粒pcDNA3.0-gdh.通过肌肉注射途径将重组质粒pcDNA3.0-gdh免疫小鼠,经ELASA实验和Western blot进行检验.结果 构建的表达载体在小鼠体内表达出正确的目的 蛋白,能诱导体液免疫.结论 构建的DNA疫苗能够引起体液免疫,为研究猪链球菌核酸疫苗提供分子工具.
作者：潘秀珍；赵华梅；葛俊超；王长军；郑峰；李先富；唐家琪 刊期： 2008年第03期
目的 探讨主要组织相容性复合物II类转录激活因子(CⅡTA)的siRNA对软骨细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达的抑制.方法 设计并合成针对CⅡTA编码区第176、741及3061位点的siRNA(分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3).通过纳米载体介导siRNA稳定转染原代软骨细胞,流式细胞术检测经典的MHC-Ⅱ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA及其调控的MHC-Ⅱ类分子的mRNA水平.结果 在重组人干扰素(interferon, IFN)-γ诱导下,siRNA3阳性软骨细胞表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了93.36%、94.16%,同时CⅡTA的mRNA含量明显减少.结论 siRNA3抑制了CⅡTA的mRNA含量,并阻止其调控的MHC-Ⅱ类分子的表达.
作者：郭荣；何飞；杜欣；罗成伟；陆泽生；翁建宇；吴穗晶；林伟 刊期： 2008年第03期
目的 探讨含CpG序列的寡脱氧核糖核苷酸(CpG Oligodeoxynucleotide, CpG-ODN)对小鼠膀胱肿瘤的治疗作用.方法 建立BTT739荷瘤小鼠动物模型,随机分为CpG-ODN治疗组和PBS对照组,于肿瘤细胞接种后第7、14天给予治疗,每组分两亚组,分别用于测量瘤重、体积及用于观察荷瘤小鼠存活情况.ELISA法检测小鼠血清中IL-12水平.流式细胞仪检测肿瘤组织中浸润性树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86的表达.结果 第2次治疗7d后,平均瘤重CpG-ODN组为(3.30±0.81)g,对照组为(4.50±0.47)g(P<0.01),平均体积CpG-ODN组为(3.57±0.84)cm3,对照组为(4.84±0.58)cm3(P<0.01),CpG-ODN组荷瘤小鼠生存期长于PBS对照组(P<0.05).治疗组及对照组小鼠血清中IL-12浓度分别为(391.5±28.4)pg/mL和(257.2±13.7)pg/mL(P<0.01).肿瘤组织中浸润性树突状细胞(Tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)表面CD80、CD86表达水平治疗组分别为(17.75±3.13)%、(18.72±2.79)%,对照组分别为(11.32±1.18)%(P<0.01)、(12.65±1.22)%(P<0.01).结论 CpG-ODN对膀胱肿瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效应和生存期延长作用,其机制主要是通过诱导DC成熟、促进Th1型细胞因子分泌、诱导免疫应答向Th1细胞分化.
作者：聂志林；靳风烁；张克勤；梁培禾；叶锦 刊期： 2008年第03期
目的 构建表达GST-STX2A1融合蛋白并鉴定其免疫原性.方法 通过PCR反应从EHEC O157:H7 EDL933标准株菌中扩增STX2A1基因,将此基因克隆到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6p-1,得到阳性克隆PGEX-6p-1/STX2A1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导GST-STX2A1融合蛋白的表达,采用亲和层析纯化该蛋白,SDS-PAGE分析其表达量、表达形式和纯度;用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,免疫双向扩散鉴定抗血清效价,Western blotting鉴定抗血清的特异性.结果 成功构建重组质粒PGEX-6p-1/STX2A1,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致,并在大肠杆菌中表达出Mr约为5.3×104大小的可溶性目的 蛋白,经亲和层析纯化后纯度可达90%,免疫Balb/c小鼠产生的抗血清效价为1:16,Western blotting表明可与天然STx2A蛋白反应.结论 在大肠杆菌中成功表达了可溶性的GST-STX2A1融合蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,为O157:H7亚单位疫苗及制备抗STX2A1的单克隆抗体提供了必要的物质基础.
作者：罗萍；曾浩；易勇；张卫军；郭鹰；刘璐；陈洪章；邹全明 刊期： 2008年第03期
目的 针对多种肿瘤细胞高表达Pokemon基因的特性,制备表达针对Pokemon基因的siRNA的逆转录病毒,研究其对感染肿瘤细胞中Pokemon基因沉默情况,探讨肿瘤防治的新方法.方法 首先利用siRNA预测软件得到4条siRNA编码DNA序列,再构建重组逆转录病毒siRNA表达质粒;利用RT-PCR技术筛选出高表达Pokemon基因的肿瘤靶细胞.然后,将重组质粒转染靶细胞,利用实时定量RT-PCR和MTT等方法筛选出沉默效果佳的siRNA.利用逆转录病毒包装细胞制备重组病毒,鉴定病毒滴度及其对体外培养细胞中Pokemon基因的沉默效应.结果 通过酶切鉴定和测序等方法证实了预测出的四条siRNA编码DNA片段成功地构建到逆转录病毒表达载体pSilencer 5.1-H1中.通过将这些重组质粒转入高表达Pokemon基因的Hela肿瘤细胞中,抗生素压力筛选出相应表达各种siRNA的细胞株,再从中筛选出了1个有50%以上沉默效应的候选siRNA.利用这一条siRNA表达质粒,在逆转录病毒包装细胞中制备出了滴度为105cfu/mL的重组病毒.此重组病毒感染Hela细胞后能显著降低其中Pokemon基因的表达.结论 成功制备了表达人Pokemon基因siRNA的重组逆转录病毒,并且在体外实验中证实了该病毒能对肿瘤细胞Hela的增殖产生明显的抑制作用,为下一步的体内抗肿瘤研究提供了有力的佐证.
作者：石晶磊；贾正才；邓一静；吴玉章；倪兵 刊期： 2008年第03期
近年来许多学者研究发现凋亡并非是程序化细胞死亡的唯一形式,机体还可能存在不同于典型凋亡的其它主动性细胞死亡形式.由ONO-AE-248诱发的中性粒细胞快速死亡可能属于非凋亡性程序化细胞死亡[1,2].
作者：薛晓婕；刘佳佳；羊建；段承刚；刘晓燕；谢华福 刊期： 2008年第03期
目的 利用RNAi技术干扰耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的BCRP(乳腺癌耐药蛋白)基因的表达,观察MCF-7/ADR细胞BCRP的mRNA变化,BCRP蛋白的表达以及对阿霉素耐药性的变化.方法 设计3条不同(BCRPl, BCRP2, BCRP4)的RNA干扰链,构建出pGenesil-BCRP-EGFP(绿色荧光蛋白)质粒,设立对照组,空白质粒(HK)组及RNAi干扰组进行实验.半定量RT-PCR检测不同组的BCRP的mRNA水平,Westem-blot检测不同组的BCRP蛋白的水平,MTT法分析RNAi干扰组药敏性变化.结果 RT-PCR和Westem-blot检测结果显示:BCRP的mRNA和蛋白的表达受抑制,以BCRP1组干扰效果明显,明显弱于其他组.MTT比色法结果显示:BCRP1组对阿霉素的药物敏感性明显提高,与对照组差异有显著性(P<0.05).结论 RNAi能抑制BCRP基因转录和翻译水平的表达,其中以BCRP1的干扰效果明显,能明显提高MCF-7/ADR对阿霉素的药物敏感性.
作者：杨成；印国兵；龚骊；王继见 刊期： 2008年第03期
目的 构建、诱导表达并鉴定可用于特异性杀伤皮肤T细胞淋巴瘤的免疫毒素hIL-2-Luffin P1.方法 采用基因工程技术将重组基因片段hIL-2-Luffin P1克隆入新的表达载体pET32a(+)中,经酶切及DNA序列测定进行鉴定并证实正确后,转化至表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达hIL-2-Luffin P1融合蛋白,行Western blot用His标签抗体和鼠抗人IL-2抗体对该融合蛋白进行鉴定.结果 成功构建了重组免疫毒素表达载体pET32a(+)-hIL-2-Luffin P1,经Western blot鉴定证实诱导表达的重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1融合蛋白的正确.结论 重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1的成功构建为进一步研究其对皮肤T细胞淋巴瘤的杀伤作用奠定了实验基础.
作者：刘树雷；何威；王儒鹏；吴军；张小容；赵云 刊期： 2008年第03期
目的 构建真核表达质粒pApoptin-EGFP并探讨其对人膀胱肿瘤细胞株T24促凋亡作用.方法 采用PCR的方法从质粒p3×flag-Apoptin-myc扩增出野生Apoptin片段,将其定向克隆于pEGFP-N1载体的EcoRI和BamHI酶切位点,构建能表达Apoptin-EGFP融合蛋白的真核表达质粒pApoptin-EGFP,酶切、测序鉴定,RT-PCR、荧光显微镜分析Apoptin基因表达,脂质体介导瞬时转染膀胱肿瘤T24细胞,流式细胞仪检测凋亡及细胞周期变化.结果 成功构建pApoptin-EGFP重组质粒,并在被转染细胞中检测到Apoptin基因表达;瞬时转染后不同时相点均可检测到细胞凋亡,与空质粒组相比具有显著差异,细胞周期表现为G/G0期阻滞.结论 成功构建pApoptin-EGFP真核表达质粒,重组质粒能在T24细胞中顺利表达Apoptin-EGFP融合蛋白,重组质粒转染可诱导T24细胞凋亡并阻滞细胞周期于G1/G0期.
作者：王亚林；靳风烁；万江华；王洛夫；吴刚 刊期： 2008年第03期
目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/HBs、pcDNA3.1(+)/HBc、pcDNA3.1(+)/HBe、pcDNA3.1(+)/HBp、pcDNA3.1(+)/HB-preS1、pcDNA3.1(+)/HB-preS2、pcDNA3.1(+)/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.
作者：汤玉瑜；陈永文；郭晟；吴玉章 刊期： 2008年第03期
免疫学杂志
主管:第三军医大学
主办：第三军医大学,中国免疫学会
