闫鸿斌；高闪电；贾万忠；才学鹏
目的 建立一种用流式细胞仪检测体内细胞毒效应的方法.方法 用不同浓度的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞和非靶细胞,以1:1的比例混合靶细胞和非靶细胞,尾静脉回输小鼠,16h后取小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞仪检测CFSE标记靶细胞和非靶细胞的比例,测定体内被杀伤靶细胞的百分率.结果 荧光染料CFSE能有效标记靶细胞,16h后流式细胞仪能很好地检测到体内被杀伤靶细胞的百分率.结论 CFSE荧光染料标记靶细胞并结合流式细胞仪分析的方法能有效地检测到体内细胞毒效应,该技术有望在肿瘤免疫和移植排斥的体内监测中得到广泛应用.
作者：傅晓岚；杨曌；王莉；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 了解哮喘中树突状细胞(Dc)分泌的细胞因子IL-12与转录因子T-bet和GATA-3的相互关系.方法 用rhGM-CSF和rhIL-4诱导培养外周血来源的DC并予鉴定,ELISA法检测其分泌的细胞因子IL-12以及与自身T细胞反应后,RT-PCR检测T-bet和GATA-3 mRNA含量,流式细胞术检测T细胞分泌的胞内细胞因子IL-4和IFN-γ水平.结果 DC诱导培养第8天,哮喘组Dc分泌的IL-12水平低于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.01);混合培养第7天,哮喘组IFN-γ和T-bet mR-NA水平均低于正常对照组(P<0.05),而IL-4、GATA-3水平和比值IL-4/IFN-γ、GATA-3/T-bet均高于正常对照组,有显著性差异(P<0.01);IL-12与T-bet呈显著正相关,与GATA-3和GATA-3/T-bet呈显著负相关.结论 转录因子T-bet、GATA-3调控ThO细胞分化受DC分泌的细胞因子IL-12的影响.IL-12如何影响T-bet、GATA-3的表达有待进一步研究.
作者：陈艳；符州；陈坤华；杨锡强；刘恩梅；王莉佳；李欣 刊期： 2008年第03期
目的 利用RNAi技术干扰耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的BCRP(乳腺癌耐药蛋白)基因的表达,观察MCF-7/ADR细胞BCRP的mRNA变化,BCRP蛋白的表达以及对阿霉素耐药性的变化.方法 设计3条不同(BCRPl, BCRP2, BCRP4)的RNA干扰链,构建出pGenesil-BCRP-EGFP(绿色荧光蛋白)质粒,设立对照组,空白质粒(HK)组及RNAi干扰组进行实验.半定量RT-PCR检测不同组的BCRP的mRNA水平,Westem-blot检测不同组的BCRP蛋白的水平,MTT法分析RNAi干扰组药敏性变化.结果 RT-PCR和Westem-blot检测结果显示:BCRP的mRNA和蛋白的表达受抑制,以BCRP1组干扰效果明显,明显弱于其他组.MTT比色法结果显示:BCRP1组对阿霉素的药物敏感性明显提高,与对照组差异有显著性(P<0.05).结论 RNAi能抑制BCRP基因转录和翻译水平的表达,其中以BCRP1的干扰效果明显,能明显提高MCF-7/ADR对阿霉素的药物敏感性.
作者：杨成；印国兵；龚骊；王继见 刊期： 2008年第03期
目的 构建人黑色素瘤相关抗原-1(MAGE-1)基因的腺病毒,并研究其感染肝癌细胞系HepG2细胞的效率.方法 采用基因克隆技术,将人MAGE-1基因克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP中,构建pShuttle-MAGE-1-IRES-hrGFP质粒,利用细菌BJ5183将穿梭质粒与pAdEasy-1进行重组,获得重组的腺病毒质粒.线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增.采用CsCl密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化.获得的腺病毒感染肝癌细胞HepG2,观察其感染效率和MAGE-1表达水平.结果 通过酶切鉴定证明腺病毒载体构建成功,包装出携带人MAGE-1基因的腺病毒,滴度达2.1×1010pfu/mL,获得的腺病毒对HepG2细胞的感染效率高于98%以上.结论 成功地利用细菌内同源重组方法构建了携带人MAGE-1基因的腺病毒,并能够在肝癌细胞中高效地表达,为利用MAGE-1进行免疫治疗提供了材料.
作者：张利军；张惠忠；陈广生；叶菁；师建国 刊期： 2008年第03期
目的 在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法.方法 采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-II过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的 蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析.终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定.结果 在培养至工程菌菌体湿重约200~250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的 蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L.发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的 (体积浓缩约2/3).再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,终目的 产物的纯度达98%以上,得率达32.5%.且纯化的目的 蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性.结论 酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的 蛋白、酵母色素及脱盐的目的 ,为规模化制备hPAB-β创造了前提.
作者：陈志瑾；丛延广；周莹冰；侯瑞；胡福泉；饶贤才 刊期： 2008年第03期
目的 研究NF-κB的诱捕寡核苷酸(decoy-oligonucleotides, Decoy-ODNs)对小鼠肺原代成纤维细胞I型胶原形成的影响,为防治肺纤维化的发生提供理论基础.方法 设计合成针对NF-κB的Decoy-ODNs,用阳离子脂质体转染小鼠肺原代成纤维细胞,用凝胶迁移变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)研究Decoy-ODNs对NF-κB的抑制作用,RT-PCR观察对成纤维细胞I型胶原合成的影响.结果 NF-κB的Decoy-ODNs可竞争抑制核转录因子NF-κB的活性,Decoy-ODNs作用18h后,成纤维细胞I型胶原mRNA的表达明显降低.结论 Decoy-ODNs可以通过拮抗核转录因子NF-κB的活性而抑制I型胶原纤维的表达,为防治肺纤维化的发生提供理论基础.
作者：杨雪梅；王兴胜；崔社怀 刊期： 2008年第03期
目的 研究云芝、丹参有效成分抗肿瘤作用及其免疫调节机制.方法 建立EAC荷瘤小鼠,并随机分为6组,连续给药30d后,测定其抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数以及外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+.结果 运用单因素方差分析进行统计学分析.结果 云芝、丹参对肿瘤均有明显的抑制作用(P<0.01);云芝+丹参组胸腺指数高于NS对照组(P<0.05),各用药组胸腺指数明显高于阿霉素对照组(P<0.05);外周淋巴细胞分群:云芝组,云芝+丹参组CD3+、CD4+百分率高于NS对照组(P<0.05);各用药组CD3+、CD4+百分率明显高于阿霉素对照组(P<0.05);除云芝+丹参+阿霉素组外,各用药组CD4+/CD8+比值高于NS组(P<0.05),明显高于阿霉素组(P<0.01).结论 云芝、丹参具有明显的抗肿瘤作用和免疫调节作用,二者联用对免疫调节有一定协同作用,其抗肿瘤机制可能通过提高免疫力来实现.
作者：祝绚；鲍依稀；李进；刘靖；王宏萍 刊期： 2008年第03期
目的 针对多种肿瘤细胞高表达Pokemon基因的特性,制备表达针对Pokemon基因的siRNA的逆转录病毒,研究其对感染肿瘤细胞中Pokemon基因沉默情况,探讨肿瘤防治的新方法.方法 首先利用siRNA预测软件得到4条siRNA编码DNA序列,再构建重组逆转录病毒siRNA表达质粒;利用RT-PCR技术筛选出高表达Pokemon基因的肿瘤靶细胞.然后,将重组质粒转染靶细胞,利用实时定量RT-PCR和MTT等方法筛选出沉默效果佳的siRNA.利用逆转录病毒包装细胞制备重组病毒,鉴定病毒滴度及其对体外培养细胞中Pokemon基因的沉默效应.结果 通过酶切鉴定和测序等方法证实了预测出的四条siRNA编码DNA片段成功地构建到逆转录病毒表达载体pSilencer 5.1-H1中.通过将这些重组质粒转入高表达Pokemon基因的Hela肿瘤细胞中,抗生素压力筛选出相应表达各种siRNA的细胞株,再从中筛选出了1个有50%以上沉默效应的候选siRNA.利用这一条siRNA表达质粒,在逆转录病毒包装细胞中制备出了滴度为105cfu/mL的重组病毒.此重组病毒感染Hela细胞后能显著降低其中Pokemon基因的表达.结论 成功制备了表达人Pokemon基因siRNA的重组逆转录病毒,并且在体外实验中证实了该病毒能对肿瘤细胞Hela的增殖产生明显的抑制作用,为下一步的体内抗肿瘤研究提供了有力的佐证.
作者：石晶磊；贾正才；邓一静；吴玉章；倪兵 刊期： 2008年第03期
目的 制作用于禽流感检测的四通道压电蛋白芯片.方法 采用聚乙烯亚胺(PEI)粘附、戊二醛(Glu)交联法,将禽流感H5、H7、H9、HI抗原分别固定于石英晶体的银电极表面.结果 得到了抗原的佳固定条件和压电蛋白芯片对阳性、阴性标准血清的响应情况.结论 该传感器对阳性标准血清的响应值与阴性标准血清的噪声值之比大于2,可用于定性定量检测.
作者：刘毅新；刘仲明；王弘；孙远明 刊期： 2008年第03期
目的 探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与P-gp在结肠癌组织中的表达及意义.方法 采用免疫组织化学技术(SP法)及免疫荧光双重标记技术检测结肠癌组织标本中HIF-1α与P-gp的表达和分布,并分析其相互关系.结果 免疫组化结果显示:HW-1α与P-gp的表达不受患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度的影响(P>0.05),但在不同Dukes分期和是否伴随淋巴结转移等因素中二者表达的阳性率呈显著差异(P<0.05);相关分析显示二者表达呈显著正相关(P<0.01);免疫荧光双重标记结果显示:HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中存在共表达现象.结论 HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中表达的相关性及共表达现象,提示HIF-1α可能与P-gp表达存在一定关系,相互作用共同参与了结肠癌多药耐药的发生.
作者：丁震宇；梁后杰 刊期： 2008年第03期
天然免疫系统要依赖模式识别受体识别人侵的外源病原微生物,然后将其清除.哺乳动物主要具有两类微生物识别系统,一类是膜结合受体,如Toll样受体,可识别胞外微生物,然后活化细胞内信号来激发机体的免疫反应;另一类是细胞内的模式识别受体,包括NOD样受体和具有螺旋酶结构域的抗病毒蛋白RIG-1和MDA5.这些胞浆分子可识别病原微生物、非微生物以及一些危险信号,在机体的健康与疾病中发挥着十分重要的作用.本文就细胞内天然免疫受体的种类和功能作一综述.
作者：闫鸿斌；高闪电；贾万忠；才学鹏 刊期： 2008年第03期
目的 构建鼠锌指蛋白A20基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠耳蜗毛细胞的感染情况.方法 采用基因工程技术,经亚克隆后将A20基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染HEK293细胞包装、扩增,将重组腺病毒感染耳蜗毛细胞.PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因对病毒滴度和感染情况进行监测.结果 酶切鉴定及PCR结果表明A20基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5×109pfu/mL,并对耳蜗毛细胞有很强的感染能力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含鼠A20基因的重组腺病毒载体.
作者：袁伟；张学渊；侯春丽；魏勇；朱楚洪 刊期： 2008年第03期
目的 为了研究HIV-1 p15(Gag)的生物学活性,制备HIV-1 p15(Gag)蛋白及其特异性抗体.方法 用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达HIV-1 p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的 蛋白.以纯化目的 蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性.结果 原核表达载体pET28 a(+)-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约20000的p15(Gag)蛋白经western blot鉴定正确.纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性.结论 得到纯化的HIV-1 p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础.
作者：柳发勇；刘朝奇；史继静；杨凡；余枫华；杨春秀；韩莉；任东明；韩钰 刊期： 2008年第03期
目的 探讨主要组织相容性复合物II类转录激活因子(CⅡTA)的siRNA对软骨细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达的抑制.方法 设计并合成针对CⅡTA编码区第176、741及3061位点的siRNA(分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3).通过纳米载体介导siRNA稳定转染原代软骨细胞,流式细胞术检测经典的MHC-Ⅱ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA及其调控的MHC-Ⅱ类分子的mRNA水平.结果 在重组人干扰素(interferon, IFN)-γ诱导下,siRNA3阳性软骨细胞表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了93.36%、94.16%,同时CⅡTA的mRNA含量明显减少.结论 siRNA3抑制了CⅡTA的mRNA含量,并阻止其调控的MHC-Ⅱ类分子的表达.
作者：郭荣；何飞；杜欣；罗成伟；陆泽生；翁建宇；吴穗晶；林伟 刊期： 2008年第03期
目的 观察CD14抑制肽(CD14 inhibitory peptide,CD14-IP)对内毒素诱导的U937细胞表达TNF-α的影响.方法 U937细胞用佛波脂(PMA)诱导成熟后分5组:正常对照组、LPS组、高剂量抑制肽组、中剂量抑制肽组和低剂量抑制肽组.LPS组给予终浓度为100 ng/mL的LPS和100 ng/mL的LBP,高、中和低剂量抑制肽组除给予LPS和LBP外,分别给予终浓度为10 μg/mL、1.0 μg/mL和0.1 μg/mL的CD14-IP.ELISA测定细胞培养上清NNF-α的浓度.进一步观察不同时间应用CD14-IP(1.0 μg/mL)对LPS诱导U937细胞TNF-α和NTF-α mRNA表达的影响.用RT-PCR测定细胞TNF-α mRNA的表达.结果 LPS组和抑制肽各组TNF-α浓度较正常组明显增高(P<0.05),高、中剂量抑制肽组TNF-α水平比LPS组明显降低(P<0.05),高、中剂量抑制肽组之间TNF-α浓度无明显差别(P>0.05),低剂量抑制肽组TNF-α浓度与LPS组无统计学差异(P>0.05).不同时间应用CD14-IP时,CD14-IP早期应用对TNF-α和TNF-α mRNA的表达抑制作用显著.结论 CD14-IP能显著减少LPS诱导的U937细胞TNF-α和TNF-α mRNA的表达,早期应用效果较好,可能对LPS所致急性肺损伤有保护作用.
作者：冯起甲；徐智；吴国明；刘红艳；胡川闽；徐顺贵；钱桂生 刊期： 2008年第03期
目的 研究Rac1、Rac2、Rac3、RhoA以及Cdc42的C-末端肽对树突状细胞(DC)交叉递呈的影响.方法 合成Rac1、Rac2、Rac3、RhoA及Cdc42 C末端区与人工改造的穿膜肽Tat47-57的融合肽,负载DC2.4细胞后,采用荧光显微镜及流式细胞术检测DC2.4细胞吞噬能力的变化,采用B3Z细胞检测DC2.4细胞抗原交叉递呈能力的变化.结果 负载了Tat-Rac1 C-末端肽的DC2.4细胞吞噬能力增强,并显著促进DC2.4细胞经MHC I类分子途径递呈外源性抗原的能力.结论 Tat-Rac1 C-末端肽能够有效促进DC的交叉递呈,为病毒感染和肿瘤等疾病的治疗奠定了基础.
作者：刘婷；邹丽云；万瑛；张晋宇；李娜；李景怡；傅晓岚；吴玉章 刊期： 2008年第03期
近年来许多学者研究发现凋亡并非是程序化细胞死亡的唯一形式,机体还可能存在不同于典型凋亡的其它主动性细胞死亡形式.由ONO-AE-248诱发的中性粒细胞快速死亡可能属于非凋亡性程序化细胞死亡[1,2].
作者：薛晓婕；刘佳佳；羊建；段承刚；刘晓燕；谢华福 刊期： 2008年第03期
目的 探讨一种快速简便的流式细胞仪多色分析时的关键参数(荧光补偿)设置方法.方法 以BD CompBeads、实验样品(本实验为慢性乙型肝炎患者外周全血)分别与单克隆荧光抗体染色,结合流式细胞仪Diva软件调节细胞仪光电倍增管(PMT)电压,计算建立荧光补偿矩阵.同时以获得的参数设置仪器,运行慢性乙型肝炎患者外周全血6色荧光标记实验样品.结果 用CompBeads建立的补偿参数稳定可靠,能有效消除荧光光谱之间的交叉重叠.6色荧光标记实验样品检测的结果,可见细胞亚群分布清晰,荧光强度比例表达适当,与通常采用的实验样品单染色方法补偿结果一致(P>0.05).结论 该方法能快速方便进行流式细胞仪检测时仪器参数佳化设置调整,在多色免疫标记流式检测中有较大的应用价值.
作者：傅晓岚；周伟；王晴；杨曌；谢谆怡；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 观察重组免疫毒素hIL-2-Luffin P1对小鼠皮肤移植排斥反应的抑制作用.方法 采用同种异体小鼠皮肤移植模型,观察hIL-2-Luffin P1对移植物存活的影响、移植后外周血T细胞亚群变化以及移植物的组织病理学观察.结果 hIL-2-Luffin P1组小鼠皮肤存活时间延长(13.86±2.11)d,与空白对照组比较相差显著(P<0.01),且与hIL-2-Luffin P1的剂量呈正相关;而Luffin P1处理组与对照组相比无明显差异.同时,移植后外周血T细胞亚群活化程度减轻,病理显示hIL-2-Luffin P1处理组移植皮肤淋巴细胞浸润较轻.结论 hIL-2-Luffin P1能够抑制T细胞的异常活化,从而抑制免疫排斥反应,达到延长移植物存活时间的目的 .
作者：王儒鹏；何威；贺伟峰；张小容；刘树雷；吴军 刊期： 2008年第03期
目的 设计、构建猪链球菌GDH真核表达载体并研究DNA疫苗免疫小鼠的体液免疫.方法 在猪链球菌保护性抗原GDH基因5'末端引入人IL-2信号肽序列,通过PCR进行拼接,得到的融合DNA片段经过酶切克隆入质粒pcDNA3.0,构建核酸疫苗重组质粒pcDNA3.0-gdh.通过肌肉注射途径将重组质粒pcDNA3.0-gdh免疫小鼠,经ELASA实验和Western blot进行检验.结果 构建的表达载体在小鼠体内表达出正确的目的 蛋白,能诱导体液免疫.结论 构建的DNA疫苗能够引起体液免疫,为研究猪链球菌核酸疫苗提供分子工具.
作者：潘秀珍；赵华梅；葛俊超；王长军；郑峰；李先富；唐家琪 刊期： 2008年第03期
免疫学杂志
主管:第三军医大学
主办：第三军医大学,中国免疫学会
