聂志林；靳风烁；张克勤；梁培禾；叶锦
目的 构建人黑色素瘤相关抗原-1(MAGE-1)基因的腺病毒,并研究其感染肝癌细胞系HepG2细胞的效率.方法 采用基因克隆技术,将人MAGE-1基因克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP中,构建pShuttle-MAGE-1-IRES-hrGFP质粒,利用细菌BJ5183将穿梭质粒与pAdEasy-1进行重组,获得重组的腺病毒质粒.线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增.采用CsCl密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化.获得的腺病毒感染肝癌细胞HepG2,观察其感染效率和MAGE-1表达水平.结果 通过酶切鉴定证明腺病毒载体构建成功,包装出携带人MAGE-1基因的腺病毒,滴度达2.1×1010pfu/mL,获得的腺病毒对HepG2细胞的感染效率高于98%以上.结论 成功地利用细菌内同源重组方法构建了携带人MAGE-1基因的腺病毒,并能够在肝癌细胞中高效地表达,为利用MAGE-1进行免疫治疗提供了材料.
作者：张利军；张惠忠；陈广生；叶菁；师建国 刊期： 2008年第03期
近年来许多学者研究发现凋亡并非是程序化细胞死亡的唯一形式,机体还可能存在不同于典型凋亡的其它主动性细胞死亡形式.由ONO-AE-248诱发的中性粒细胞快速死亡可能属于非凋亡性程序化细胞死亡[1,2].
作者：薛晓婕；刘佳佳；羊建；段承刚；刘晓燕；谢华福 刊期： 2008年第03期
目的 构建鼠锌指蛋白A20基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠耳蜗毛细胞的感染情况.方法 采用基因工程技术,经亚克隆后将A20基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染HEK293细胞包装、扩增,将重组腺病毒感染耳蜗毛细胞.PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因对病毒滴度和感染情况进行监测.结果 酶切鉴定及PCR结果表明A20基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5×109pfu/mL,并对耳蜗毛细胞有很强的感染能力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含鼠A20基因的重组腺病毒载体.
作者：袁伟；张学渊；侯春丽；魏勇；朱楚洪 刊期： 2008年第03期
目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/HBs、pcDNA3.1(+)/HBc、pcDNA3.1(+)/HBe、pcDNA3.1(+)/HBp、pcDNA3.1(+)/HB-preS1、pcDNA3.1(+)/HB-preS2、pcDNA3.1(+)/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.
作者：汤玉瑜；陈永文；郭晟；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 探讨主要组织相容性复合物II类转录激活因子(CⅡTA)的siRNA对软骨细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达的抑制.方法 设计并合成针对CⅡTA编码区第176、741及3061位点的siRNA(分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3).通过纳米载体介导siRNA稳定转染原代软骨细胞,流式细胞术检测经典的MHC-Ⅱ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA及其调控的MHC-Ⅱ类分子的mRNA水平.结果 在重组人干扰素(interferon, IFN)-γ诱导下,siRNA3阳性软骨细胞表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了93.36%、94.16%,同时CⅡTA的mRNA含量明显减少.结论 siRNA3抑制了CⅡTA的mRNA含量,并阻止其调控的MHC-Ⅱ类分子的表达.
作者：郭荣；何飞；杜欣；罗成伟；陆泽生；翁建宇；吴穗晶；林伟 刊期： 2008年第03期
目的 探讨一种快速简便的流式细胞仪多色分析时的关键参数(荧光补偿)设置方法.方法 以BD CompBeads、实验样品(本实验为慢性乙型肝炎患者外周全血)分别与单克隆荧光抗体染色,结合流式细胞仪Diva软件调节细胞仪光电倍增管(PMT)电压,计算建立荧光补偿矩阵.同时以获得的参数设置仪器,运行慢性乙型肝炎患者外周全血6色荧光标记实验样品.结果 用CompBeads建立的补偿参数稳定可靠,能有效消除荧光光谱之间的交叉重叠.6色荧光标记实验样品检测的结果,可见细胞亚群分布清晰,荧光强度比例表达适当,与通常采用的实验样品单染色方法补偿结果一致(P>0.05).结论 该方法能快速方便进行流式细胞仪检测时仪器参数佳化设置调整,在多色免疫标记流式检测中有较大的应用价值.
作者：傅晓岚；周伟；王晴；杨曌；谢谆怡；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 制作用于禽流感检测的四通道压电蛋白芯片.方法 采用聚乙烯亚胺(PEI)粘附、戊二醛(Glu)交联法,将禽流感H5、H7、H9、HI抗原分别固定于石英晶体的银电极表面.结果 得到了抗原的佳固定条件和压电蛋白芯片对阳性、阴性标准血清的响应情况.结论 该传感器对阳性标准血清的响应值与阴性标准血清的噪声值之比大于2,可用于定性定量检测.
作者：刘毅新；刘仲明；王弘；孙远明 刊期： 2008年第03期
目的 为了研究HIV-1 p15(Gag)的生物学活性,制备HIV-1 p15(Gag)蛋白及其特异性抗体.方法 用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达HIV-1 p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的 蛋白.以纯化目的 蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体.通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性.结果 原核表达载体pET28 a(+)-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约20000的p15(Gag)蛋白经western blot鉴定正确.纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性.结论 得到纯化的HIV-1 p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础.
作者：柳发勇；刘朝奇；史继静；杨凡；余枫华；杨春秀；韩莉；任东明；韩钰 刊期： 2008年第03期
目的 探讨HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中差异表达的基因并对其基因表达谱进行生物学信息分析.方法 用Trizol一步法提取HepG2细胞及HepG2.2.15细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,与基因芯片杂交;采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因.结果 在54614个基因表达谱的筛选中,发现有4462个基因表达水平显著上调,2592个基因表达水平显著下调.结论 HBV基因组及其表达产物对于肝细胞基因表达谱有显著影响,可能参与了肝癌的发生发展.
作者：汤玉瑜；陈永文；费蕾；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 通过RNA干扰研究Rac2蛋白对树突状细胞(DC)交叉递呈的影响.方法 首先构建针对Rac2基因siRNA的慢病毒载体pFIVsiRNARac2-1,pFIVsiRNARac2-2,pFIVsiRNARac2-3;DNA-磷酸钙共沉淀的方法转染293FT细胞包装慢病毒,嘌呤霉素(puromycin)筛选病毒感染的阳性DC2.4(树突状细胞系),Western-blot检测其干扰效率;然后用B3Z细胞(H2-Kb限制性,SIINFEKL特异性T细胞杂交瘤)检测筛选后的DC2.4细胞交叉递呈的能力.结果 酶切和测序结果证实表达siRNA的慢病毒载体构建成功,抗原递呈实验发现下调了Rac2蛋白表达的DC2.4细胞交叉递呈能力下降.结论 初步证实了Rac2蛋白参与树突状细胞对外来抗原的交叉递呈,为进一步了解树突状细胞交叉递呈的分子机制奠定了基础.
作者：李娜；邹丽云；万瑛；张晋宇；刘婷；李景怡；吴玉章 刊期： 2008年第03期
目的 针对多种肿瘤细胞高表达Pokemon基因的特性,制备表达针对Pokemon基因的siRNA的逆转录病毒,研究其对感染肿瘤细胞中Pokemon基因沉默情况,探讨肿瘤防治的新方法.方法 首先利用siRNA预测软件得到4条siRNA编码DNA序列,再构建重组逆转录病毒siRNA表达质粒;利用RT-PCR技术筛选出高表达Pokemon基因的肿瘤靶细胞.然后,将重组质粒转染靶细胞,利用实时定量RT-PCR和MTT等方法筛选出沉默效果佳的siRNA.利用逆转录病毒包装细胞制备重组病毒,鉴定病毒滴度及其对体外培养细胞中Pokemon基因的沉默效应.结果 通过酶切鉴定和测序等方法证实了预测出的四条siRNA编码DNA片段成功地构建到逆转录病毒表达载体pSilencer 5.1-H1中.通过将这些重组质粒转入高表达Pokemon基因的Hela肿瘤细胞中,抗生素压力筛选出相应表达各种siRNA的细胞株,再从中筛选出了1个有50%以上沉默效应的候选siRNA.利用这一条siRNA表达质粒,在逆转录病毒包装细胞中制备出了滴度为105cfu/mL的重组病毒.此重组病毒感染Hela细胞后能显著降低其中Pokemon基因的表达.结论 成功制备了表达人Pokemon基因siRNA的重组逆转录病毒,并且在体外实验中证实了该病毒能对肿瘤细胞Hela的增殖产生明显的抑制作用,为下一步的体内抗肿瘤研究提供了有力的佐证.
作者：石晶磊；贾正才；邓一静；吴玉章；倪兵 刊期： 2008年第03期
目的 利用RNAi技术干扰耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的BCRP(乳腺癌耐药蛋白)基因的表达,观察MCF-7/ADR细胞BCRP的mRNA变化,BCRP蛋白的表达以及对阿霉素耐药性的变化.方法 设计3条不同(BCRPl, BCRP2, BCRP4)的RNA干扰链,构建出pGenesil-BCRP-EGFP(绿色荧光蛋白)质粒,设立对照组,空白质粒(HK)组及RNAi干扰组进行实验.半定量RT-PCR检测不同组的BCRP的mRNA水平,Westem-blot检测不同组的BCRP蛋白的水平,MTT法分析RNAi干扰组药敏性变化.结果 RT-PCR和Westem-blot检测结果显示:BCRP的mRNA和蛋白的表达受抑制,以BCRP1组干扰效果明显,明显弱于其他组.MTT比色法结果显示:BCRP1组对阿霉素的药物敏感性明显提高,与对照组差异有显著性(P<0.05).结论 RNAi能抑制BCRP基因转录和翻译水平的表达,其中以BCRP1的干扰效果明显,能明显提高MCF-7/ADR对阿霉素的药物敏感性.
作者：杨成；印国兵；龚骊；王继见 刊期： 2008年第03期
天然免疫系统要依赖模式识别受体识别人侵的外源病原微生物,然后将其清除.哺乳动物主要具有两类微生物识别系统,一类是膜结合受体,如Toll样受体,可识别胞外微生物,然后活化细胞内信号来激发机体的免疫反应;另一类是细胞内的模式识别受体,包括NOD样受体和具有螺旋酶结构域的抗病毒蛋白RIG-1和MDA5.这些胞浆分子可识别病原微生物、非微生物以及一些危险信号,在机体的健康与疾病中发挥着十分重要的作用.本文就细胞内天然免疫受体的种类和功能作一综述.
作者：闫鸿斌；高闪电；贾万忠；才学鹏 刊期： 2008年第03期
目的 研究NF-κB的诱捕寡核苷酸(decoy-oligonucleotides, Decoy-ODNs)对小鼠肺原代成纤维细胞I型胶原形成的影响,为防治肺纤维化的发生提供理论基础.方法 设计合成针对NF-κB的Decoy-ODNs,用阳离子脂质体转染小鼠肺原代成纤维细胞,用凝胶迁移变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)研究Decoy-ODNs对NF-κB的抑制作用,RT-PCR观察对成纤维细胞I型胶原合成的影响.结果 NF-κB的Decoy-ODNs可竞争抑制核转录因子NF-κB的活性,Decoy-ODNs作用18h后,成纤维细胞I型胶原mRNA的表达明显降低.结论 Decoy-ODNs可以通过拮抗核转录因子NF-κB的活性而抑制I型胶原纤维的表达,为防治肺纤维化的发生提供理论基础.
作者：杨雪梅；王兴胜；崔社怀 刊期： 2008年第03期
目的 了解哮喘中树突状细胞(Dc)分泌的细胞因子IL-12与转录因子T-bet和GATA-3的相互关系.方法 用rhGM-CSF和rhIL-4诱导培养外周血来源的DC并予鉴定,ELISA法检测其分泌的细胞因子IL-12以及与自身T细胞反应后,RT-PCR检测T-bet和GATA-3 mRNA含量,流式细胞术检测T细胞分泌的胞内细胞因子IL-4和IFN-γ水平.结果 DC诱导培养第8天,哮喘组Dc分泌的IL-12水平低于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.01);混合培养第7天,哮喘组IFN-γ和T-bet mR-NA水平均低于正常对照组(P<0.05),而IL-4、GATA-3水平和比值IL-4/IFN-γ、GATA-3/T-bet均高于正常对照组,有显著性差异(P<0.01);IL-12与T-bet呈显著正相关,与GATA-3和GATA-3/T-bet呈显著负相关.结论 转录因子T-bet、GATA-3调控ThO细胞分化受DC分泌的细胞因子IL-12的影响.IL-12如何影响T-bet、GATA-3的表达有待进一步研究.
作者：陈艳；符州；陈坤华；杨锡强；刘恩梅；王莉佳；李欣 刊期： 2008年第03期
目的 原核表达具生物学活性的重组人N端缺失甘露聚糖结合凝集素(rhMBLΔN)蛋白.方法 应用PCR技术,从含中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增rhMBLΔN基因片段,插入pET43.1a载体后,转化E.coli BL21(DE3)感受态菌诱导表达rhMBLΔN蛋白.应用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化目的 蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA进行鉴定.结果 从pGEM-MBL中扩增到长约620bp的DNA片段,构建的重组表达载体经Bam HI和Eco RI酶切后出现约7270bp和620bp的片段,测序结果与预期的完全一致.表达的重组蛋白纯化后,经SDS-PAGE鉴定为Mr97000的蛋白.ELISA证实,纯化蛋白能与抗重组人MBL抗体结合,具备配体结合活性并能与人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1、2的N端片段结合.结论 获得了可表达rhMBLΔN的菌株和具活性的rhMBΔN蛋白,为进一步研究提供了条件.
作者：雷鸣；左大明；王明永；张雅妮；陈政良 刊期： 2008年第03期
目的 构建表达GST-STX2A1融合蛋白并鉴定其免疫原性.方法 通过PCR反应从EHEC O157:H7 EDL933标准株菌中扩增STX2A1基因,将此基因克隆到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6p-1,得到阳性克隆PGEX-6p-1/STX2A1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导GST-STX2A1融合蛋白的表达,采用亲和层析纯化该蛋白,SDS-PAGE分析其表达量、表达形式和纯度;用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,免疫双向扩散鉴定抗血清效价,Western blotting鉴定抗血清的特异性.结果 成功构建重组质粒PGEX-6p-1/STX2A1,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致,并在大肠杆菌中表达出Mr约为5.3×104大小的可溶性目的 蛋白,经亲和层析纯化后纯度可达90%,免疫Balb/c小鼠产生的抗血清效价为1:16,Western blotting表明可与天然STx2A蛋白反应.结论 在大肠杆菌中成功表达了可溶性的GST-STX2A1融合蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,为O157:H7亚单位疫苗及制备抗STX2A1的单克隆抗体提供了必要的物质基础.
作者：罗萍；曾浩；易勇；张卫军；郭鹰；刘璐；陈洪章；邹全明 刊期： 2008年第03期
目的 设计、构建猪链球菌GDH真核表达载体并研究DNA疫苗免疫小鼠的体液免疫.方法 在猪链球菌保护性抗原GDH基因5'末端引入人IL-2信号肽序列,通过PCR进行拼接,得到的融合DNA片段经过酶切克隆入质粒pcDNA3.0,构建核酸疫苗重组质粒pcDNA3.0-gdh.通过肌肉注射途径将重组质粒pcDNA3.0-gdh免疫小鼠,经ELASA实验和Western blot进行检验.结果 构建的表达载体在小鼠体内表达出正确的目的 蛋白,能诱导体液免疫.结论 构建的DNA疫苗能够引起体液免疫,为研究猪链球菌核酸疫苗提供分子工具.
作者：潘秀珍；赵华梅；葛俊超；王长军；郑峰；李先富；唐家琪 刊期： 2008年第03期
目的 探讨含CpG序列的寡脱氧核糖核苷酸(CpG Oligodeoxynucleotide, CpG-ODN)对小鼠膀胱肿瘤的治疗作用.方法 建立BTT739荷瘤小鼠动物模型,随机分为CpG-ODN治疗组和PBS对照组,于肿瘤细胞接种后第7、14天给予治疗,每组分两亚组,分别用于测量瘤重、体积及用于观察荷瘤小鼠存活情况.ELISA法检测小鼠血清中IL-12水平.流式细胞仪检测肿瘤组织中浸润性树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86的表达.结果 第2次治疗7d后,平均瘤重CpG-ODN组为(3.30±0.81)g,对照组为(4.50±0.47)g(P<0.01),平均体积CpG-ODN组为(3.57±0.84)cm3,对照组为(4.84±0.58)cm3(P<0.01),CpG-ODN组荷瘤小鼠生存期长于PBS对照组(P<0.05).治疗组及对照组小鼠血清中IL-12浓度分别为(391.5±28.4)pg/mL和(257.2±13.7)pg/mL(P<0.01).肿瘤组织中浸润性树突状细胞(Tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)表面CD80、CD86表达水平治疗组分别为(17.75±3.13)%、(18.72±2.79)%,对照组分别为(11.32±1.18)%(P<0.01)、(12.65±1.22)%(P<0.01).结论 CpG-ODN对膀胱肿瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效应和生存期延长作用,其机制主要是通过诱导DC成熟、促进Th1型细胞因子分泌、诱导免疫应答向Th1细胞分化.
作者：聂志林；靳风烁；张克勤；梁培禾；叶锦 刊期： 2008年第03期
树突状细胞(dendritic cells, DCs)是体内重要的抗原提呈细胞,其对外源性抗原的高效的加工、处理和提呈是启动T细胞应答的关键步骤;同时DCs又是免疫应答的重要调节者,不同微环境中的DCs受不同因子的作用而发生不同的成熟活化过程,从而诱导机体产生针对该环境所需要的不同的免疫应答.胸腺基质淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是一类优先表达于肺、肠、皮肤等上皮细胞的细胞因子,尤其在超敏反应性炎症部位表达极高.TSLP对DCs具有重要调控作用,可促进DCs的活化、成熟,增强其对CD4+T细胞的活化能力,并促使Th0细胞向Th2分化,在特应性皮炎、哮喘等炎症发生中具有重要意义.
作者：史丽云；张立煌 刊期： 2008年第03期
免疫学杂志
主管:第三军医大学
主办：第三军医大学,中国免疫学会
