许鹏；窦科峰；陈志南；邢金良；李郁；孔令恩
目的: 证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用.方法: 采用脂质体介导的DNA转染技术, 以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304, 再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子.并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响.结果: ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1.NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%, 两者差异具有显著意义(P <0.01).结论: HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应.
作者：张彩娥；韩军艳；杨惠军；吴雄文；黄亚非；梁智辉；龚非力 刊期： 2005年第06期
目的: 研究我国汉族人群甘露聚糖结合凝集素(MBL)结构基因外显子1第52、54、57位密码点突变(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA).方法: 收集广东地区汉族普通人群的血标本,提取白细胞基因组DNA, 以PCR扩增目的基因片段,应用荧光探针杂交可视技术检测其MBL基因的点突变.结果: 从202份样本中,检出GGC54GAC点突变纯合子6例和杂合子44例(等位基因频率为0.139), GGA57GAA点突变杂合子1例(频率为0.002),未发现CGT52TGT点突变(频率为0).结论: 广东地区汉族人群MBL基因点突变的频率较高,为防治MBL缺损病提供了一定的实验依据.
作者：钟成全；王方勇；吕成伟；余新沛；卢晓；张丽芸；陈政良 刊期： 2005年第06期
目的: 构建抗人宫颈癌单链抗体(scFv)基因CSAs-1,并进行二级结构和三级结构预测、理化性质分析及进化树构建.方法: 采用重叠延伸PCR方法, 以能特异性分泌抗人宫颈癌mAb的杂交瘤细胞株CSA125为原料,构建抗人宫颈癌scFv基因CSAs-1, 进行测序; 并通过Internet对其进行结构预测和进化树构建.结果: 抗人宫颈癌scFv基因CSAs-1有834 bp,对应278个氨基酸的多肽, 等电点预测值7.215,为碱性蛋白质; PHDsec二级结构显示CSAs-1属于α+β蛋白, V H和V L区均有多个蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点; CSAs-1三级结构建模显示V L和V H形成一个疏水的“口袋”, Linker游离于此结构之外.以上结果表明: CSAs-1符合scFv的结构特点,明显具有抗原结合位点的空间构象, 理论上应该具有良好的抗原结合活性.进化分析发现脊椎动物V基因形成三个进化群, CSAs-1 V区分布于进化树的A群中.结论: 构建一个鼠源性抗人宫颈癌scFv基因CSAs-1,为该基因的进一步原核和真核表达打下了基础; 应用信息学技术所获得的预测和分析结果为CSAs-1表达、纯化和活性研究提供了大量的信息; 为进一步分析抗体V H、V L在抗体功能中的作用、改造抗体、实现抗体的人源化、提高抗体的活性等方面提供了一定的依据.
作者：王莹；李旭；陈葳 刊期： 2005年第06期
目的: 比较小鼠经中子及γ线照射后,肠组织中TNF-α的表达及其意义.方法: 350只二级雄性BALB/c小鼠, 经不同剂量的中子和γ线照射,于照后6、12 h,1、2、3、4、5、7、10、14、21、28 d分批活杀,采用免疫组化染色等技术观察TNF-α在肠组织中的变化.结果: 在正常肠黏膜中, TNF-α主要见于肠绒毛间质、黏膜下及淋巴组织中巨噬细胞浆内; 2.5Gy中子照后2 d内, 上述阳性部位TNF-α的表达进行性减少; 3～7 d其在巨噬细胞及隐窝细胞浆内的表达明显增加, 5 d达高峰, 14 d恢复至正常水平. 4.0、5.5Gy中子及12Gy γ线照射后4 d内,TNF-α的表达进行性减少; γ线5.5Gy照后6～12 h, TNF-α的表达增多,照后1 d减少, 2～5 d增加, 3 d达高峰,10 d恢复至正常水平.TNF-α的表达在肠黏膜损伤时减少, 于损伤后恢复的早期增多.结论: 中子和γ线照后,肠内源性TNF-α表达具有不同的变化规律,并参与了肠放射损伤及修复的病理生理过程.
作者：彭瑞云；高亚兵；陈浩宇；付凯飞；马俊杰；王晓民；胡文华；王德文 刊期： 2005年第06期
内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)是一种起源于骨髓的原始细胞, 类似于胚胎期的成血管细胞(angioblast), 在一定条件下可定向分化为成熟的内皮细胞.在体外, EPC能吸收乙酰化低密度脂蛋白, 结合荆豆凝集素(ulex europeas lectin), 形成毛细血管管腔样结构; 在体内, EPC能募集、归巢到血管损伤区, 分化为内皮细胞, 促进血管再生.
作者：颜雪芸；陈书艳 刊期： 2005年第06期
目的: 研究器官移植接受者外周造血干细胞数的变化及其意义.方法: 采用SE-9000型全自动血液分析仪分别检测了24例急性器官移植排斥反应接受者、39例器官移植非排斥反应接受者及40例正常人外周血中造血干细胞的数量.结果: 急性器官移植排斥反应接受者外周血中造血干细胞的数量为(1.252±0.162)×109/L,检出率为100%; 器官移植非排斥反应接受者为(0.012±0.011)×109/L,检出率为7.69%; 正常人为未检出.与正常人及器官移植非排斥反应接受者相比较,急性器官移植排斥反应接受者外周血中造血干细胞的数量明显增高(P<0.01).结论: 检测外周血中造血干细胞的数量可作为急性器官移植排斥反应早期筛选和辅助诊断的指标.
作者：郑善銮；郝晓柯；于文彬；杨麦贵 刊期： 2005年第06期
目的: 构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40L-Ig)基因的重组腺病毒载体,确定其表达和功能学意义.方法: 通过PCR获得人源IgGFc和sCD40L基因并予以连接,将其插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中, 构建重组质粒pAdTrack-sCD40L-Ig.将其与pAdEasy-1-BJ5183菌行同源重组后,用293细胞包装,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blot分析等方法鉴定重组腺病毒,并进行双向混合淋巴细胞反应(MLR)以确定其功能.结果: 所构建的sCD40L-Ig基因的重组腺病毒, 经酶切和PCR鉴定正确.原代腺病毒的滴度达到2.69×1011 pfu/L, 并有相对分子质量(Mr)为61×103的目的蛋白表达.MLR显示,重组腺病毒对淋巴细胞的增殖有抑制作用.结论: 成功地构建了含有sCD40L-Ig基因的重组腺病毒,并对MLR有抑制作用.
作者：李钊伦；田普训；薛武军 刊期： 2005年第06期
目的: 在原核细胞中表达经噬菌体抗体库筛选可与HepG2细胞特异性结合的单链抗体(scFv), 并对其特性进行鉴定.方法: 采用正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2, 从人源噬菌体抗体库中筛选可与HepG2细胞特异结合的scFv.对scFv DNA测序后, 以其阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在IPTG诱导下表达scFv并以金属离子螯和层析(IMAC)进行纯化, 用100 g/L SDS-PAGE、Western blot及ELISA分析纯化的scFv.将纯化的scFv与HepG2细胞共孵育后, 观察其对细胞生长的影响.结果: 经筛选获得的2个相对特异性的scFv,分别命名为SLH04及SLH10.经IPTG诱导获得可溶性scFv的表达.Western blot分析证明, 表达产物的相对分子质量(Mr)均为36 000左右, 与理论预期值相符.ELISA检测表明,纯化的scFv能与HepG2细胞特异性结合, 并抑制HepG2细胞的生长.结论: 从人源噬菌体抗体库中, 筛选出能与HepG2细胞特异性结合的scFv, 并在大肠杆菌中表达, 有望用于肝癌生物治疗的实验研究.
作者：余冰；倪明；朱慧芬；张悦；杨静；邵静芳；沈关心 刊期： 2005年第06期
目的: 构建与肝癌细胞特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白,并诱导表达.方法: 提取从大型人源噬菌体抗体库中筛选的含有与HCC特异性结合的scFv-10基因的质粒,用Sfi I、 Not I分别酶切, 连接至经同样双酶切后的原核分泌型表达载体pDAP2上, 转化和筛选后, 阳性细菌经IPTG诱导表达, 细胞ELISA鉴定融合蛋白活性.结果: 重组质粒经PCR扩增, Eco 91Ⅰ单酶切及Eco 91Ⅰ/Not I双酶切鉴定, 证明scFv-10基因已插入到原核分泌型表达载体pDAP2上.表达产物的定位分析表明融合蛋白主要分泌性表达到周质腔,细胞ELISA证明表达产物有与HCC结合的活性.结论: 成功地构建并表达了与HCC特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白,为其应用奠定了基础.
作者：程欣；黄永建；黄宇；朱慧芬；余冰；唐珍洁；李文涵；沈关心 刊期： 2005年第06期
目的: 制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体(mAb),并建立一种可用于检测gp120的ELISA法.方法: 采用基因工程抗原HIV-1 gp120免疫BALB/c小鼠, 通过B细胞杂交瘤技术制备抗HIV-1 gp120的mAb.用ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、效价及特异性.用饱和硫酸铵(SAS)纯化mAb,并用HRP标记后建立双mAb夹心ELISA法.结果: 筛选出10株稳定分泌抗HIV-1 gp120 mAb的杂交瘤细胞株,9株为IgG,其中4株的腹水效价为32×10-4～256×10-4.所得mAb与HIV-1 gp41、HIV-1 p24及HIV-2 gp36 Ag均无交叉反应,仅与HIV-1 gp120产生特异性反应.用 mAb 6H9和9H12建立了双夹心ELISA法, 检测gp120抗原的灵敏度是10 μg/L.结论: 获得10株特异性强、效价高的抗HIV-1 gp120的mAb, 并建立了灵敏度良好的双mAb夹心ELISA法.
作者：安庆军；王润田；张坤娟；郝林娟；张红中；王蕙芬 刊期： 2005年第06期
目的: 比较心脏移植前后,外周血单个核细胞(PBMC)表面蛋白分子的表达与组织病理学改变时相间的差别,探讨免疫分子的活性变化与移植器官排斥反应时间进程间的关系.方法: 6例心脏移植患者于术前、术后不同时间点取外周血,用不同荧光单克隆抗体(mAb)标记PBMC表面的蛋白分子后,用流式细胞仪检测MHC-II、CD3、CD4、CD8、HLA-DR和ICAM-I的表达.常规移植术后供心组织病理检查, 根据国际器官移植排斥反应的病理诊断标准分级.结果: (1)6例实施心脏移植的患者中, 有3例在不同时间发生不同程度的急性排斥反应.(2)发生排斥反应的病例在整个30 d的观测期内, CD3、CD4及CD8的表达水平, 均高于未发生排斥反应的病例.(3)发生移植排斥反应的患者,其PBMC上HLA-DR的表达于移植术后72 h出现高峰, 出现高峰的时间较用活组织检查诊断排斥反应的时间早4～7 d.(4)发生排斥反应的患者PBMC上MHC-II及ICAM-I的表达,分别于术后3 d及2 d 出现高于术前的表达峰,于术后15 d达峰值,峰值的出现时间与病理改变基本同步.结论: (1)心脏移植患者术前的免疫功能状况,与移植术后排斥反应的发生率及严重性有一定的相关性.(2)监测PBMC表面HLA-DR、MHC-II及ICAM-I分子的表达, 对临床早期发现心脏移植排斥反应具有一定的指导意义.
作者：顾云；黄益民；孟旭；白涛；李玉梅；辛毅 刊期： 2005年第06期
目的:构建人TIM-3真核表达载体, 在真核细胞中表达人TIM-3, 建立稳定转染细胞株.方法:设计特异性引物, 利用PCR技术扩增出TIM-3全编码区基因片段, 插入到真核表达载体pIRES2EGFP中, 重组质粒pIRES2EGFP-hTIM-3用脂质体转染法转染哺乳动物细胞, 以流式细胞术(FCM)和Western blot分析蛋白质的的表达, 借助FCM和选择性培养基筛选建立稳定转染细胞株.结果:成功构建了pIRES2EGFP-hTIM-3真核表达载体, 转染哺乳动物细胞COS-7和CHO后, FCM和Western blot分析证实TIM-3高效表达于细胞膜表面, 建立了稳定转染的CHO细胞株.结论:成功构建了人TIM-3真核表达载体, TIM-3高效表达在转染的哺乳动物细胞表面, 并建立了稳定转染的细胞株.为进一步研究TIM-3及其配体的生物学功能以及制备和筛选抗人TIM-3 mAb提供了条件.
作者：张胜桃；刘晓军；金霞；何培根；袭非力；杨东亮 刊期： 2005年第06期
目的: 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体(scFv),并构建双价抗体(diabody).方法: 以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,4轮后挑取集落,用ELISA法鉴定其特异性,并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析.选取活性好的抗体基因进行改造, 构建diabody.结果: 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象, 获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体, 经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因, 分泌抗Dig抗体的阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第1亚群,重链基因分别属于第3和第4亚群.选取4号克隆进行基因改造, 构建diabody的表达载体, 获得活性较好的diabody.结论: 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗Dig的抗体,并改造成应用前景较好的diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物的中毒提供了具有实用价值的人源抗体.
作者：陈宇萍；张国民；乔媛媛；王刚；刘玉峰；化冰；王琰 刊期： 2005年第06期
目的: 研究白藜芦醇(RSV)对小鼠T淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响, 为阐明其免疫抑制作用提供实验依据.方法: 无菌分离小鼠淋巴结细胞, 加入不同浓度的RSV预先孵育1 h, 用多克隆刺激剂佛波醇酯和离子霉素刺激T细胞活化增殖.采用 3H-TdR掺入法检测RSV对T细胞增殖的影响; 用RT-PCR检测IL-2及IFN-γ mRNA的表达; 用胞内细胞因子染色法分析IL-2和IFN-γ的分泌.结果: RSV能抑制T细胞增殖, 也能在mRNA水平及蛋白水平上抑制IL-2及IFN-γ的分泌.结论: RSV对T细胞的免疫抑制作用, 可能与其抑制T细胞的活化、增殖和细胞因子的分泌有关.
作者：俞瑜；曾耀英；季煜华；肇静娴；刘良 刊期： 2005年第06期
目的: 制备抗果蝇ECP蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法: 用大肠杆菌表达并纯化的GST-ECP融合蛋白, 免疫6～8 wk的雌性BALB/c小鼠, 取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合, 经间接ELISA筛选和克隆化培养制备杂交瘤细胞系.用间接ELISA及Western blot等方法对mAb的Ig亚类(型)、腹水效价及特异性进行鉴定.结果: 获得1株杂交瘤细胞株, 命名为8G9.Ig亚类(型)鉴定表明, 此株mAb为IgG1(κ型).腹水mAb的效价为 1∶ 1×105.Western blot分析表明, 该株mAb可与果蝇的幼虫、蛹及成虫组织中表达的ECP特异性结合, 可特异性的识别ECP抗原的231～300aa区段.结论: 获得1株能稳定分泌抗ECP mAb的细胞株, 为进一步研究ECP的功能奠定了基础.
作者：刘加彬；汪道涌；孙明宽；徐敏；刘琍；谢维 刊期： 2005年第06期
目的: 制备抗醛糖还原酶(AR)的单克隆抗体(mAb),并与本室制备的抗醛糖还原酶相似蛋白(ARL-1) mAb进行比较. 方法: 经RT-PCR获得AR基因, 将基因插入Pgex- 4T-1(His)6C中, 构建重组质粒Pgex- 4T-1(His)6C-AR, 以重组质粒转化E.coli Rosetta诱导表达GST-AR蛋白.以纯化的GST-AR蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb.应用间接ELISA和Western blot方法对mAb进行筛选和鉴定.使用Clustalx和 Antheprot软件, 比较AR与ARL-1的同源性, 表达GST-Dar[80～142氨基酸(aa)], 与ARL-1差异较大; 并分析AR的抗原性, 表达GST-Da1(1～79 aa)、GST-Da2(80～99 aa)、 GST-Da3(111～142 aa)、 GST-Da4(143～316 aa).利用AR全长及截短蛋白, 采用Western blot分析制备的抗AR mAb识别AR抗原的部位.结果: 获得3株稳定分泌抗AR mAb的杂交瘤细胞系ARB3、 AR7B3G4和ARF10.3株抗GST-AR的 mAb均为IgG1(κ型), 腹水mAb效价为1∶ 4×105, 细胞培养上清mAb效价为1∶ 1×104, 3株mAb均可与胎盘组织中的AR蛋白起反应, 而与GST-ARL-1和GST蛋白无交叉反应.它们分别为抗GST-Da1、GST-Da3和GST-Da4蛋白的mAb.结论: 成功地制备了3株特异性抗AR mAb,可分别识别AR的 1～79、111～142、143～316位氨基酸.将它们与抗ARL-1 mAb联合应用,将有助于进一步研究AR与ARL-1蛋白的功能, 并为深入探讨AR、ARL-1与相关疾病的关系及进行大规模的流行病学调查提供了有力的工具.
作者：马达；金俊飞；孙明宽；单军；张建琼；谢维 刊期： 2005年第06期
人体每天从食物中摄取大量蛋白, 其中既有能引起超敏反应的异种蛋白抗原, 又有与人体自身蛋白有交叉反应的蛋白抗原.
作者：王莹；徐凌云 刊期： 2005年第06期
目的: 克隆人β2微球蛋白(β2m)基因启动子,并研究其在小鼠肥大细胞瘤细胞P815中对下游报告基因的启动活性.方法: 用PCR法从基因组内扩增β2m基因启动子.通过基因重组的方法, 构建含此启动子的EGFP基因真核表达载体, 然后分别瞬时和稳定转染P815细胞.通过 RT PCR、荧光显微镜摄像和流式细胞术分析, 观察IFN-γ作用前后EGFP的表达.结果: 从基因组内扩增出302 bp的人β2m基因的启动子, 成功地构建了含此启动子的真核报告载体.RTPCR的结果表明, IFN-γ对启动子的活性具有诱导作用, 且呈浓度依赖性.流式细胞术的结果显示,在5×10 5 U/L IFN-γ作用下,尽管表达EGFP的细胞数量没有差异, 但刺激组EGFP的表达强度是未刺激组的2倍.结论: 人β2m基因启动子在小鼠肥大细胞瘤细胞P815中具有高度的启动活性.通过该启动子中所含干扰素刺激反应元件(ISRE),可在IFN-γ诱导作用下调控下游目的基因的表达.
作者：张兴黔；梅文瀚；钱关祥 刊期： 2005年第06期
目的: 制备氯霉素(CAP)-牛血清白蛋白(BSA)及氯霉素(CAP)-卵清白蛋白(OVA)的偶联物并进行鉴定.方法: 分别采用混合酸酐法和重氮化法制备CAP-BSA及CAP-OVA的偶联物, 前者是将CAP先与琥珀酸酐反应生成CAP-半琥珀酸酯(CAP-HS), 再进行混合酸酐反应.将反应产物CAP-HS与BSA结合, 合成CAP-HS-BSA偶联物; 后者是将CAP分子中的苯环上的硝基还原为氨基后,进行重氮化处理, 然后分别与BSA和OVA连接, 合成CAP-BSA和CAP-OVA复合物.结果: 紫外图谱分析表明, CAP-BSA、CAP-OVA和CAP-HS-BSA的紫外大吸收峰分别是262 nm、213 nm 和275 nm; 计算得CAP与载体蛋白BSA、OVA及HS的偶联比分别为5∶1、12∶1和22∶1.结论: 成功的制备CAP-BSA及CAP-OVA的偶联物,为免疫动物制备抗CAP的抗体奠定了基础.
作者：胥传来；刘剑波；彭池方；郝凯；刘丽强；金征宇；王武康 刊期： 2005年第06期
目的: 构建稳定表达小鼠OX40的细胞株HUVEC,并探讨其对B细胞的促增殖作用. 方法: 从ConA活化的小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA, 应用RT-PCR法扩增小鼠OX40的cDNA, 并将其克隆到pUCm-T载体中,经PCR、酶切和测序分析,进而构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体.以脂质体法转染HUVEC,经G418筛选后,用流式细胞术检测OX40分子的表达.采用 3H-TdR掺入法,研究OX40信号对体外培养的B细胞的促分化作用.结果: 构建了OX40基因的真核表达载体.经PCR、酶切和测序证实, 插入的目的片段与GenBank登录的小鼠OX40 cDNA序列完全一致.用G418筛选后,获得能稳定表达小鼠OX40蛋白的HUVEC细胞.3H-TdR掺入法结果显示,小鼠OX40稳定表达的细胞HUVEC对体外培养的B细胞具有促增殖、分化的作用.OX40/OX40L信号与CD40/CD40L信号具有协同作用.结论: 成功地构建小鼠OX40稳定表达地细胞,OX40对B细胞具有促增殖、分化作用.
作者：原江水；冯永堂；王菲；宫伟雁；邸大琳；任杰；苗乃法 刊期： 2005年第06期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
