曾鸿；黄志雄；张桂玲；陈妙芬；吕海韵；梁洁雅
20世纪80年代,我国自主研发的卡介菌多糖核酸(BCG polysaccharide nucleic acid,BCG-PSN)是采用热酚法从BCG中提取其有效成分而制成的免疫调节剂,临床上广泛用于预防和治疗慢性气管炎、感冒和哮喘等疾病,具有较好的疗效.本实验以BCG-PSN免疫小鼠,观察其对小鼠免疫功能的影响,现将结果报道如下.
作者：孙宝华；宋水燕；房丽君；董纪英；薛云；周华伟；陆璐；颜淑芹 刊期： 2012年第03期
目的 初步建立嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和温和气单胞菌(Aeromonas sobria)二联灭活疫苗的生产工艺.方法 用50 L发酵罐培养嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,确定发酵培养时间、甲醛灭活浓度及与佐剂乳化比例,对制备的疫苗进行质量检测,并分析佐剂与无佐剂二联灭活疫苗的免疫效果.结果 50 L发酵罐培养嗜水气单胞菌和温和气单胞菌菌株10～ 12h时,A650值达峰值；0.3％的甲醛于37℃灭活24 h,可完全灭活菌液；以灭活菌液与佐剂1∶1.5比例混合较合适；制备的佐剂二联灭活疫苗各项质量指标均合格,免疫保护效果优于无佐剂二联灭活疫苗.结论 已初步建立嗜水气单胞菌和温和气单胞菌二联灭活疫苗的生产工艺.
作者：陶家发；任燕；罗霞；赖迎迢；康光辉；张悠；石存斌；吴淑勤 刊期： 2012年第03期
目的 人工合成恒河猴粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Macaca mulatta granulocyte-macrophage colony stimulating factor,mGM-CSF)基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化.方法 根据大肠杆菌遗传密码子偏爱性优化设计并合成mGM-CSF基因,克隆至原核表达载体pET-43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET-43.1a-mGM-CSF,转化大肠杆菌BL21-CodonPlus( DE3)-RIPL,IPTG诱导表达.表达的重组mGM-CSF蛋白经Sephacryl S-200分子筛层析纯化,复性后,Western blot检测其反应原性,MTT法检测其生物学活性.结果 重组表达质粒pET-43.1a-mGM-CSF经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为15000,表达量约占菌体总蛋白的30％,主要以包涵体形式存在；纯化复性后的重组蛋白纯度可达95％以上,并可与大鼠抗人GM-CSF单克隆抗体特异性结合,比活性为1.2×107 IU/mg.结论 在大肠杆菌中高效表达了重组mGM-CSF蛋白,纯化复性后的蛋白具有良好的生物学活性.
作者：刘娟；陈丹；李璐；刘新颖；王冉；史洪娜；王维龙；沈林；刘勇；李鼎锋 刊期： 2012年第03期
目的 构建旋毛虫(Trichinella spirais)新生幼虫期特异性T314基因真核表达质粒,并在BHK细胞中进行表达.方法 从旋毛虫新生幼虫RNA中通过RT-PCR技术扩增无信号肽T314全长基因,定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组真核表达质粒T314-pEGFP-N1,脂质体法转染BHK细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,Western blot检测T314融合蛋白的表达.结果 重组真核表达质粒T314-pEGFP-N1经双酶切及测序证实构建正确；转染的BHK细胞48 h转染效率高；表达的T314融合蛋白可与旋毛虫感染的猪血清发生特异性反应.结论 已成功构建了T314基因重组真核表达质粒T314-pEGFP-N1,并在BHK细胞中融合表达,为进一步研究旋毛虫包囊形成机制奠定了基础.
作者：于建立；白雪；吴秀萍；刘明远 刊期： 2012年第03期
目的 克隆并原核表达斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai,E.stiedai)兰州株Rhomboid基因.方法 通过分析基因保守区设计引物,采用RT-PCR方法与3'RACE技术相结合,扩增获得兔斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因cDNA全序列,并对其进行序列分析；将获得的Rhomboid基因克隆至原核表达载体pET-28a中,转化E.coli Rosetta (DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果 Rhomboid基因开放阅读框全长774 bp,编码257个氨基酸残基,预测蛋白质相对分子质量和等电点分别为28 120和8.64,与鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tellan)Rhomboid蛋白氨基酸序列的同源性为84.44％;构建的重组原核表达质粒pET-Rhomboid经双酶切和测序证实构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,并可与兔抗E.stiedai阳性血清发生特异性反应.结论 成功克隆并表达了Rhomboid基因,为其生物学功能及以其作为斯氏艾美耳球虫疫苗候选基因的研究奠定了基础.
作者：曲晗；宫鹏涛；张西臣；张国才；杨举；李赫；李建华 刊期： 2012年第03期
目的 测定我国人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白G基因序列,并对其进行生物信息学分析.方法 RT-PCR扩增3株病毒糖蛋白G基因,分别克隆至pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,进行测序.应用DNAstar MegAlign软件分析3株病毒糖蛋白的同源性,AntheProt 5.0及DNAstar Protean软件分析3株病毒糖蛋白的结构及潜在B细胞抗原表位的差异.结果 4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒均属基因Ⅰ型狂犬病病毒；其糖蛋白G区基因同源性为76.0％～88.4％,G区ORF基因同源性为84.4％～91.5％,氨基酸序列同源性为90.5％～92.2％；3株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潜在信号肽结构,其中第19位氨基酸为三者潜在信号肽断裂位点,第17位氨基酸为4aGV株病毒糖蛋白潜在信号肽断裂位点；3株病毒糖蛋白分别在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潜在可折叠螺旋的疏水性区域,为明显跨膜区域；4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸残基均富含潜在α螺旋、β折叠及卷曲结构,其比例分别为30％、31％、39％,28％、30％、41％和29％、30％、41％,易发生扭曲、折叠,形成丰富的二级结构；3株病毒糖蛋白潜在B细胞抗原表位位置与数量相似.结论 已对3株人用狂犬病疫苗株G基因进行了全面生物信息学分析,为完善我国人用狂犬病疫苗生产用毒种的质控标准提供了支持.
作者：李加；曹守春；石磊泰；唐建蓉；田宏；高向东；董关木 刊期： 2012年第03期
目的 探讨血清肿瘤标志物糖类抗原(Carbohydrate antigen,CA )242(CA242)、CA724联合检测在胰腺癌诊断中的应用价值.方法 采用放射免疫法分别检测34例胰腺癌、26例慢性胰腺炎患者及60名健康体检者的血清CA242和CA724水平.结果 进展期胰腺癌组血清中CA242和CA724的水平均明显高于早期胰腺癌组、慢性胰腺炎组和正常对照组(P均＜0.01),早期胰腺癌组、慢性胰腺炎组和正常对照组之间CA242和CA724的水平差异无统计学意义(P＞0.05)；胰腺癌患者血清中CA242、CA724单独和联合检测的敏感性分别为61.7％、57.3％和84.9％,特异性分别为91.0％、87.6％和90.3％.结论 血清肿瘤标志物CA242、CA724的定量测定是诊断胰腺癌敏感、特异的指标,但其早期敏感性较差；其测定结果与胰腺癌的分期及预后明显相关；联合检测可使其敏感性明显提高,而特异性无明显改变.
作者：杨锐；太京华；金珍婧；潘留兰；牟文玲 刊期： 2012年第03期
目的 构建戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV )RdRp基因真核表达质粒,并检测其在PLC/PRF/5、A549和HepG2 3种细胞中的表达,为后续RdRp的研究提供实验依据.方法 利用RT-nPCR法从阳性HEV粪便中扩增RdRp基因片段,插入pcDNA3.0真核表达载体中,并在其3’端插入EGFP报告基因,构建融合表达质粒pcDNA3.0-RdRp-EGFP,脂质体法转染PLC/PRF/5、A549和HepG2细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-nPCR检测RdRp基因mRNA的转录情况,Western blot检测RdRp蛋白的表达.结果 重组表达质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确；RdRp基因和蛋白在A549和HepG2细胞中可高效、特异性表达.结论 成功构建了RdRp基因对真核表达质粒,并在A549和HepG2培养细胞中大量表达,为进一步研究RdRp在HEV复制过程中的功能奠定了基础.
作者：黄芬；禹文海；马天武；井申荣；曾韦锟；华修国 刊期： 2012年第03期
目的 研究染料木黄酮对大鼠慢性栓塞性肺动脉高压(Chronic thromboembolic pulmonary hypertension,CTEPH)的减缓作用及对肺组织一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)水平的影响,并探讨其可能的机制.方法 雄性SD大鼠麻醉后,经颈静脉同输体外制备的自体血栓栓子,2周后同法进行二次栓塞,将造模成功的大鼠分为染料木黄酮治疗组、栓塞4周组和8周组.全程腹腔注射抗纤维溶解剂氨甲环酸,达目标日期后,采用右心导管法检测平均肺动脉压；开胸取心肺组织,心脏左右心室、室间隔分别称重后,计算有心室肥厚指数,电镜下观察肺小动脉结构变化；Western blot法检测肺组织中eNOS水平.结果 染料木黄酮治疗组及栓塞8周组大鼠平均肺动脉压及右心室肥厚指数较栓塞4周组明显升高(P均＜0.01),染料木黄酮组较栓塞8周组显著降低(P＜0.01)；染料木黄酮治疗组及栓塞8周组大鼠肺小动脉结构重塑(平滑肌细胞明显增殖)；染料木黄酮治疗组大鼠肺组织中eNOS水平较栓塞4周和8周组明显升高(P＜0.01).结论 染料木黄酮能减缓大鼠慢性栓塞性肺动脉高压的进展,其机制可能与其上调eNOS的水平有关.
作者：张玉坤；王导新；李长毅 刊期： 2012年第03期
目的 探讨胃癌组织中食管癌相关基因4(Esophageal cancer-related gene 4,ECRG4)启动子区的甲基化情况及其临床意义.方法 应用甲基化特异性PCR (Methylation specific-PCR,MSP-PCR)法,检测49份胃癌组织、30份癌旁组织和15份正常组织标本中ECRG4基因启动子区的甲基化情况,并分析其与临床病理特征之间的相关性.结果 胃癌组织[69.4％(34/49)]和癌旁组织[53.3％(16/30) ]ECRG4基因甲基化检出率均明显高于正常组织[6.7％(1/15)](P＜0.01)；Ⅲ+Ⅳ期ECRG4基因甲基化检出率[80％(24/30)]明显高于Ⅰ+Ⅱ期[52.6％(10/19)]( P＜0.05),表明ECRG4基因甲基化检出率与病理分期相关,而与患者年龄、性别及淋巴结转移无相关性(P＞0.05).结论 ECRG4基因启动子区异常甲基化与胃癌的发生发展密切相关,可作为胃癌早期辅助诊断的分子标志物之一.
作者：王玉彬；巴彩凤 刊期： 2012年第03期
目的 探讨外源性S100A6对黑色素瘤B16细胞增殖、凋亡的影响及其机制.方法 采用MTT、台盼蓝拒染、Hoechst、Western blot、免疫细胞化学、免疫荧光和荧光素酶活性分析法检测S100A6对B16细胞增殖、凋亡、β-catenin的水平和分布、β-catenin/TCF4转录活性及经典Wnt信号途径(即Wnt/β-catenin信号)的下游靶基因c-myc表达的影响.结果 GST-hS100A6可抑制B16细胞的增殖,且呈时间-剂量依赖性；GST-hS 100A6作用72 h后,B16细胞的凋亡率较GST对照组增加1.43倍；携带S100A6基因的重组腺病毒AdS100A6作用72 h后,B16细胞中β-catenin的表达量较对照腺病毒AdGFP组增加43.9％；GST-hS100A6可使B16细胞中β-catenin的表达增加,且以胞核增加为主；GST-hS100A6作用后,B16细胞的β-catenin/TCF4转录活性增至GST对照组的7.4倍,且该信号途径的靶基因之一c-myc的表达也增加70.4％.上述结果与GST对照组之间的差异均有统计学意义(P均＜0.05或0.01).结论 S100A6具有抑制黑色素瘤增殖、促进凋亡和上调其Wnt/β-catenin信号途径活性的作用,且上调Wnt/β-catenin信号途径活性可能是S100A6对黑色素瘤抑制性作用的机制之一.
作者：陈英华；孙双双；卫佳；李星星；游莉；邹正渝；黎玉叶；何通川；周兰 刊期： 2012年第03期
目的 检测重组人B7-H1IgV(rhB7-H1)工程菌生物学特性的稳定性.方法 将重组质粒pQE30-B7-H1IgV转化的大肠杆菌rhB7-H1/DH5α工程菌连续传代50代,每隔10代进行工程菌B7-H1IgV蛋白表达量检测、扫描电镜观察、革兰染色、各项生化反应及质粒的酶切鉴定.结果 各代工程菌中B7-H1IgV蛋白的表达量均为菌体总蛋白的10％左右；各代工程菌提取的质粒双酶切后均可见381 bp的目的基因片段；各代工程菌均呈典型的大肠杆菌形态,革兰染色显示为阴性杆菌,各项检测结果与原始菌种无显著差异.结论 该工程菌生物学特性稳定,可作为生产用菌种用于大规模生产.
作者：陈霖；李伯安；毛远丽；张伟；张英起 刊期： 2012年第03期
目的 研究轮状病毒(Rotavirus.RV)P[8]G1和P[2]G3株灭活疫苗的免疫原性及不同血清型间的交叉识别作用.方法 采用Veto细胞转瓶培养RV,经纯化灭活、佐剂吸附等工艺,制备RV P[8]G1和P[2]G3株灭活疫苗,分别经肌内免疫Wistar大鼠和猕猴,采用ELISA法和微量病毒中和试验检测大鼠和猕猴血清中RV特异性抗体效价和中和抗体效价,流式细胞术检测猕猴血液中CD4+和CD8+T细胞的数量.结果 P[8]G1和P[2]G3株疫苗样品的RV抗原含量分别为10 240和5 120 EU/ml;免疫2次后,P[8]G1和P[2]G3株疫苗诱导大鼠产生的血清IgG抗体GMT分别为(43 407.71±1 654.51)和(41 520.61±2047.61),诱导猕猴产生的血清IgG抗体GMT分别为(13 654.45±3 125.27)和(10 350.68±997.83);单一血清型疫苗免疫后产生的中和抗体具有型间交叉识别作用；2株疫苗免疫猕猴后均能刺激其CD4+T淋巴细胞增殖,CD8+T淋巴细胞无明显变化.结论 2株RV灭活疫苗均具有良好的免疫原性及型间交叉识别作用.
作者：吴晋元；易山；张光明；李鸿钧；谢天宏；李思成；郜岩；贾琴妹；杨星；赵晓南；孙茂盛 刊期： 2012年第03期
目的 原核表达并纯化人细小病毒B19(Human parvovirus B19,HPVB19)结构蛋白VP1,并初步建立IgM ELISA检测方法,用于B19病毒感染的检测.方法 采用PCR法从B19 IgM阳性血清中扩增VP1基因片段,亚克隆至表达载体pGEX-2T中,构建重组表达质粒pGEX-2T-VP1,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达.表达产物经疏水纯化后进行Western blot分析.以纯化的重组蛋白包被酶标板,建立IgM间接ELISA检测方法,确定Cut-off值,并进行初步应用.结果 重组原核表达质粒经双酶切鉴定构建正确；表达的重组融合蛋白相对分子质量为61000,主要以包涵体形式存在,纯度为96％,可与B19 IgG阳性血清发生特异性反应；建立的间接ELISA方法Cut-off值为0.102,灵敏度为91.7％,特异性为98.6％,与对照试剂检测结果的符合率为97.1％；用建立的方法检测4 500份健康献血者及39份类风湿性关节炎患者血清的B19 IgM抗体,阳性率分别为1.04％和10.3％.结论 原核表达并纯化了HPVB19 VP1蛋白,并初步建立了IgM间接ELISA检测方法,为B19病毒感染的早期诊断提供了参考.
作者：梁莉莉；叶祥忠；周厚清；张娜；李良红；李益民；刘岩峰 刊期： 2012年第03期
目的 建立重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(TACI-Fc)的质控方法和质量标准.方法 采用以B淋巴细胞刺激因子作为配体的受体结合法测定TACI-Fc的生物学活性；反向液相色谱(RP-HPLC)法测定蛋白含量及纯度；ELISA法分别测定残留CHO细胞蛋白和蛋白A；胰蛋白酶酶切后分析肽图；其余检测项目均按《中国药典》三部(2010版)规定进行.结果 用建立的方法对重组人TACI-Fc原液和成品进行检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2010版)的要求.结论 建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定.
作者：高凯；陶磊；史新昌；裴德宁；王兰；李响；饶春明；王军志 刊期： 2012年第03期
目的 探讨高尔基体囊泡转运蛋白P115基因沉默对胃癌BGC-823细胞凋亡的影响及其可能的相关机制.方法 将含p115基因的重组质粒P115 shRNA-1318转染BGC-823细胞,并设shNC(阴性对照)转染组和空白对照组,免疫荧光显微镜检测转染效果；RT-PCR法检测细胞中p115和巨噬细胞游走抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)基因mRNA的转录水平；Western blot检测细胞中P115、MIF及核内肿瘤抑制蛋白质P53的表达水平；MTT法检测细胞的增殖活力；流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的分布.结果 转染后48 h,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,表明转染成功；与对照组相比,p115 shRNA-1318组细胞中的p115和MIF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显降低(P＜0.05),细胞核内P53蛋白的表达水平明显增加(P＜0.05),细胞的增殖活力明显下降(P＜0.05),细胞凋亡数量明显增加(P＜0.05),G1/C2期细胞数量明显增多,S期细胞数量明显减少(P＜0.05).结论 沉默p115基因可促进胃癌细胞的凋亡,其调控机制可能是通过调控MIF因子来完成的.
作者：屈玉玲；易永芬；邓玮；文雪；闫田静 刊期： 2012年第03期
目的 探讨溶血磷脂酸受体1( Lysophosphatidic acid receptor 1,LPAR1)在人脑胶质瘤组织中的表达及意义.方法 收集临床切除的经病理证实的良性胶质瘤组织、恶性胶质瘤组织及正常脑组织,采用RT-PCR法及免疫组织化学染色法检测各组脑组织中LPAR1在mRNA及蛋白水平的表达,并分析LPAR1表达与脑胶质瘤临床病理特征之间的相关性.结果 正常脑组织、良性胶质瘤组织、恶性胶质瘤组织中均有LPAR1 mRNA及蛋白的表达；胶质瘤组织中LPAR1 mRNA及蛋白的表达水平均明显高于正常脑组织,差异有统计学意义(P＜0.05),且恶性胶质瘤组织中LPAR1蛋白的表达水平明显高于良性胶质瘤组织(P＜0.05)；LPAR1的表达与脑胶质瘤临床病理分级相关,而与年龄、性别、肿瘤部位无关.结论 LPAR1在脑胶质瘤组织中表达增高,可能在胶质瘤发生发展的过程中发挥重要作用.
作者：杨志青；刘辉；许万振；李蕴潜 刊期： 2012年第03期
目的 观察Y-盒结合蛋白-1(Y-box binding protein-1,YB-1)基因对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖、凋亡及侵袭能力的影响.方法 通过脂质体介导的方法将YB-1 shRNA重组质粒pGSi2和阴性对照质粒HK转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中YB-1、基质金属蛋白酶-2( Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9在mRNA和蛋白水平的表达；MTT法及流式细胞术检测细胞增殖活力、细胞周期及凋亡的变化；Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化.结果 pGSi2组MDA-MB-231细胞较HK组细胞YB-1 mRNA及蛋白的表达水平均明显降低(P＜0.01)；沉默YB-1表达可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导其凋亡,且细胞侵袭能力及MMP-2和MMP-9的表达也较HK组明显下降(P均＜0.05).结论 YB-1 shRNA可以沉默MDA-MB-231细胞中YB-1的表达,抑制细胞增殖,诱导其凋亡,并抑制细胞侵袭能力及MMP-2和MMP-9的表达.
作者：邱欣欣；涂植光；孔飞飞；陈光辉；成凤；匡文斌；钟梁 刊期： 2012年第03期
目的 克隆与乳腺癌MCF-7细胞相关的旋毛虫TS498基因,并进行原核表达.方法 从含TS498基因的噬菌体文库中PCR扩增TS498基因,亚克隆人原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-TS498,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物.结果 扩增的旋毛虫TS498基因与GenBank中登录的基因序列同源性为100％,重组表达质粒pET-28a-TS498经双酶切和测序证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约23 000,表达量约占菌体总蛋白的20％,能够被兔抗旋毛虫肌幼虫阳性血清识别.结论 成功克隆并在大肠杆菌中表达了与MCF-7细胞相关的旋毛虫TS498基因,为进一步研究其特性和功能奠定了基础.
作者：任保彦；左绍志；高江明；付成福；张旭；宫鹏涛；李建华；张西臣 刊期： 2012年第03期
目的 构建重组免疫毒素EBI3-Luffin P1的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达,纯化后初步检测其生物学活性.方法 从质粒pET-32a-EBI3中扩增EBI3基因,与合成的Luffin P1基因连接,克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a-EBI3-Luffin P1,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的重组EBI3-Luffin P1蛋白经亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性,体外试验初步鉴定其生物学活性.结果 重组质粒pET-32a-EBI3-Luffin P1经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组EBI3-Luffin P1蛋白相对分子质量约为50 000,主要以包涵体形式存在,诱导8h表达量可达菌体总蛋白的44％；纯化的重组蛋白纯度约为98％,可与EBI3蛋白免疫小鼠血清发生特异性反应,并可显著抑制小鼠脾脏细胞分泌IFNγ.结论 成功构建了重组免疫毒素EBI3-Luffin P1的原核表达质粒,表达并纯化了重组蛋白,为进一步研究其在缓解、治疗免疫性疾病及红白血病中的作用奠定了基础.
作者：吴昊；陆强；高闻达；陈柳茜；任翠平；沈际佳 刊期： 2012年第03期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
