王丽婵；卫辰；张路民；徐颖华；骆鹏；张庶民；侯启明
目的 筛选产磷脂酶A1(Phospholipase A1,PLA1,EC3.1.1.32)的菌株,并优化其发酵条件.方法 从富油土壤中筛选产PLA1的菌株,并对PLA1活力高的菌株进行分子生物学鉴定及发酵条件的优化.结果 筛选出的5个菌株中Dx208菌株PLA1活力高,摇瓶发酵酶活力达4.52 U/ml.根据该菌株的形态特征分析和16SrDNA基因序列,初步鉴定其为链霉菌属(Streptomyces)的灰色链霉菌(Streptomyces griseus).该菌株的佳发酵条件为:初始pH7.0,培养温度30℃,发酵时间5d,摇床转速200r/min,发酵液中PLA1活力可达7.15 U/ml,为优化前的1.58倍.结论 已筛选出1株高产PLA1的菌株,并优化了其发酵条件,为PLA1的生产及应用奠定了基础.
作者：赵梦梦；薛正莲；苏燕南；赵世光；陈涛 刊期： 2012年第07期
目的 了解大理地区志贺菌耐药性分布及其对氟喹诺酮类药物的耐药机制.方法 对2010～2011年从大理地区各医院收集的粪便标本进行分离培养和血清型鉴定;K-B琼脂扩散法检测分离的志贺菌对12种常见抗菌药物的耐药性;E-test法检测环丙沙星和萘啶酸对耐药菌株的小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC);经PCR和DNA测序检测耐药菌株基因突变;R质粒接合试验检测氟喹诺酮类药物耐药性与R质粒介导的相关性.结果 共分离到68株志贺菌,其中福氏志贺菌41株,宋内志贺菌25株,鲍氏志贺菌2株;志贺菌对萘啶酸耐药率高,其次为复方磺胺甲噁唑、氨苄西林,对头孢曲松和头孢噻肟较敏感,对喹诺酮类显示出不同程度的耐药率;环丙沙星对志贺菌的MIC在0.008～ 32 μg/ml之间,萘啶酸对志贺菌的MIC均≥1μg/ml,有4株MIC≥256 μg/ml;6株对氟喹诺酮类药物耐药的菌株中均存在gyrA基因Ser83→Leu和par口C基因Ser80→Ile的突变,其中有2株存在gyrA基因Asp87→Asn的突变,2株存在Asp87→Gly的突变,3株存在parC基因Gln91→His的突变;R质粒介导与氟喹诺酮类药物耐药无关.结论 治疗细菌性痢疾首选头孢曲松和头孢噻肟,志贺菌gyrA和parC基因突变与对氟喹诺酮类药物耐药性密切相关,与R质粒介导无关.
作者：王国富；薛士鹏；吴利先 刊期： 2012年第07期
目的 构建猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV )E2蛋白基因重组人5型腺病毒,并进行鉴定.方法 通过巢式PCR从猪瘟活疫苗中扩增CSFV E2全基因序列,克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA的多克隆位点处,构建重组穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA-E2,将其线性化后与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,进行重组腺病毒的包装.细胞完全病变后,采用RT-PCR法检测E2基因mRNA的转录;细胞病变法检测病毒滴度;连续传代后检测病毒的稳定性;Western blot法检测E2蛋白的表达;以105.82 TCID50重组腺病毒经腹腔免疫小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清猪瘟抗体效价.结果 重组穿梭质粒paeAd5 CMVK-NpA-E2经双酶切及测序证明构建正确;重组腺病毒rAd5v-MxE2转染的293AD细胞可检测到E2基因的转录和蛋白的表达;重组腺病毒的滴度为105.82 TCID50/ml;第5、30代重组腺病毒均可扩增出目的基因条带,病毒滴度无明显变化;重组腺病毒免疫小鼠后,可产生CSFV抗体.结论 成功构建了CSFV E2基因重组人5型腺病毒,其免疫原性良好,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础.
作者：杨洋；高博；宫婷；李业伟；孙程龙；张守峰；刘晔；扈荣良 刊期： 2012年第07期
目的 观察淋病奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface protein A,NspA)基因真核表达质粒不同免疫途径诱导的小鼠特异性体液免疫应答效果.方法 将NspA基因真核表达质粒pcNspA通过肌肉、滴鼻和阴道3种途径免疫BALB/c小鼠,分别于0、2、3、4周各免疫1次,末次免疫后2周,收集各组小鼠血清、支气管肺泡洗液和阴道洗液,采用间接ELISA方法检测特异性抗体效价;并检测抗体介导的补体溶菌活性.结果 滴鼻免疫和肌肉免疫pcNspA质粒均可诱导小鼠体内产生较高水平的特异性IgG和IgA抗体,而且滴鼻免疫组在支气管肺泡洗液和阴道洗液中均可检测到特异性sIgA抗体,而阴道免疫组仅在阴道局部检测到较低水平的特异性sIgA抗体;滴鼻免疫组小鼠血清具有溶菌活性.结论 淋病奈瑟菌NspA基因真核表达质粒可诱导小鼠体内产生特异性抗体,并具有抗菌活性;滴鼻免疫可能是其更有效的免疫途径.
作者：李国才；蒋桂花；焦红梅；陈红菊；潘兴元；严华；季明春 刊期： 2012年第07期
目的 比较不同新生牛血清对体外培养的BHK-21细胞的影响.方法 以不同厂家和同一厂家不同批次的共6种新生牛血清培养BHK-21细胞,观察细胞传代后在不同血清培养条件下的形态、增长倍数和细胞维持时间.结果 6号血清培养的细胞生长状态好,增长倍数高,维持细胞存活时间长;3号血清培养效果次之;2号、4号和5号血清培养的细胞至第4天仍未长满单层;1号血清培养的细胞基本未生长.结论 不同厂家和同一厂家不同批次的新生牛血清对BHK-21细胞体外培养的效果存在差异.
作者：孙招金；陈柄企；王玲；叶贺佳；童菊芸；罗开健 刊期： 2012年第07期
目的 探讨ATP结合盒转运子A1 (ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)和血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)在人脑胶质母细胞瘤中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组化法检测ABCA1和HO-1蛋白在44份人脑胶质母细胞瘤及14份瘤旁正常脑组织标本中的表达情况,分析ABCA1和HO-1的表达与患者临床病理特征之间的相关性.结果 ABCA1和HO-1蛋白在胶质母细胞瘤中表达的阳性率(77.3％和75％)与瘤旁正常组织(均为7.1％)相比,差异均有统计学意义(P均＜0.001),且ABCA1与HO-1的表达呈正相关(rs＝0.313,P＜0.05);患者性别、年龄、手术切除范围、肿瘤大小、有无复发、术后放化疗情况与ABCA1、HO-1蛋白的表达无相关性(P＞0.05).结论 ABCA1和HO-1蛋白在胶质母细胞瘤中高表达可能对胶质母细胞瘤的发生、发展具有一定的作用.
作者：王晨；余天平；滕志朋；刘斌；李昱 刊期： 2012年第07期
目的 探讨水痘减毒活疫苗(以下简称水痘疫苗)的豚鼠异常毒性检查法.方法 按照《中国药典》三部(2010版)规定,对本公司生产的41批水痘疫苗进行豚鼠异常毒性检查;分别对本公司生产的水痘疫苗在不同实验室、4个不同厂家的水痘疫苗、本公司生产的不同批号水痘疫苗及不同体重的豚鼠注射本公司生产的水痘疫苗后进行异常毒性检查.注射前每只豚鼠称重,应为250～350 g.每只豚鼠腹腔注射供试品5.0nl,观察7d.结果 观察期内,豚鼠全部健存,且无异常反应,到期时每只豚鼠体重均增加.其中,同一实验室的豚鼠在注射同一批水痘疫苗后出现体重增加差异;不同实验室的豚鼠体重增加有差异,每天称重影响豚鼠体重的增加;在注射疫苗后的第1、2天,多数豚鼠体重出现略微下降,随后开始逐渐增加.结论 本公司生产的水痘疫苗安全性良好,建议采用清洁级以上的豚鼠进行异常毒性检查,同时规定实验动物的性别和注射前的观察期限,并设立阳性、阴性对照,对生物制品的安全性作出更为合理的评价.
作者：陈哲文；金于兰；马相虎；张建光；朱玉美；王亮 刊期： 2012年第07期
目的 探讨低氧对分化型甲状腺癌KAT、WRO细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenehymal transition,EMT)的影响.方法 以氯化钴(CoCl2)模拟细胞低氧微环境,采用MTT法检测细胞的增殖活力,筛选CoCl2的适作用浓度;倒置显微镜观察低氧下细胞的形态特征;Western blot检测低氧0、3、6、12h后KAT和WRO细胞中HIF-1a蛋白的表达及低氧6h后KAT和WRO细胞上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和间质细胞波形蛋白(Vimentin)的表达.结果 CoCl2适作用浓度为150 μmol/L,低氧使KAT和WRO细胞逐渐获得了间质细胞的形态特征.低氧6h后,KAT和WRO细胞中HIF-1a蛋白的表达达峰值,与低氧0h组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).低氧组KAT细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显低于正常组(P＜0.01),Vimentin蛋白的表达水平与正常组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);低氧组WRO细胞中E-cadherin蛋白的表达水平明显低于正常组(P＜0.oi),Vimentin蛋白的表达水平明显高于正常组(P＜0.01).结论 HIF-1a可能通过下调E-cadherin、上调Vimentin而促进分化型甲状腺癌细胞KAT和WRO发生上皮间质转化,使其获得侵袭、转移潜能.
作者：贾朝莉；刘智敏；曾得康；杨俊艳；龙方懿；刘小花 刊期： 2012年第07期
目的 探讨免疫复合物型增效乙型肝炎疫苗的稳定性.方法 将复合物型增效乙型肝炎疫苗分别于37℃保存6周(加速稳定性试验),2～8℃保存30个月(长期稳定性试验),进行各项质量指标检测,并比较其小鼠效力(ED50值)与常规重组乙型肝炎疫苗(酵母)的差异.结果 经37℃保存6周,2～8℃保存30个月后,免疫复合物型增效乙型肝炎疫苗各项质量指标均符合其暂定规程质量标准;小鼠效力(ED50值)不同时间点检测结果均低于常规乙肝疫苗,且升高趋势慢于常规乙肝疫苗,除37℃保存2周和4周外,其余差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 免疫复合物型增效乙型肝炎疫苗稳定性良好;其小鼠效力(ED50值)优于常规乙肝疫苗,且比常规乙肝疫苗具有更好的稳定性.本研究为确定免疫复合物型增效乙型肝炎疫苗的有效期提供了实验依据.
作者：张昀；何亚丽；孙进文；陈国明；张德有；周根喜 刊期： 2012年第07期
目的 探讨低氧诱导因子-1α( Hgpoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、锌指转录抑制因子Twist和钙黏蛋白E(E-cadherin)在人乳腺癌中的表达及其意义.方法 采用免疫组化SP法检测术前未接受过放疗、化疗及激素治疗的69名患者乳腺癌组织标本中HIF-1α、Twist和E-eadherin的表达,并分析三者表达的相关性.结果 在69份乳腺癌组织标本中,HIF-1α、Twist 和E-cadherin的阳性表达率分别为71.01％(49/69)、57.97％(40/69)和50.72％(35/69);HIF-1α、Twist和E-cadherin的阳性表达率与TNM分期和腋淋巴结转移有关(P＜0.05或P＜0.01),与患者年龄、肿瘤大小和病理类型无关(P＞0.05).HIF-1α与Twist的表达呈显著正相关(r＝0.286,P＜0.05),Twist与E-cadherin的表达呈显著负相关(r＝－0.371,P＜ 0.01).结论 HIF-1α、Twist和E-cadherin在乳腺癌中的表达情况可作为监测乳腺癌发展的指标.
作者：龙方懿；印国兵；刘智敏；吴婷婷；贾朝莉；杨俊艳；刘小花 刊期： 2012年第07期
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在蚕蛹中高效表达狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)糖(G)蛋白.方法 从狂犬病病毒CVS-11株总RNA中扩增G基因片段,插入供体质粒pFastBac I-G中,构建重组供体质粒pFastBac I-G,转化大肠杆菌DH 10Bac,构建重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-G,将其转染BmN细胞,获得含G基因的重组杆状病毒.将重组病毒感染蚕蛹,收集血淋巴,进行Western blot分析.结果 重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-G经PCR鉴定证明构建正确;狂犬病病毒糖蛋白在重组杆状病毒感染的BmN细胞中和蚕蛹中获得正确表达,在蚕蛹中表达的重组蛋白可与His标记的单克隆抗体和狂犬病病毒阳性血清特异性结合.结论 成功构建了重组狂犬病病毒糖蛋白杆状病毒,并在蚕蛹中获得了表达,表达产物具有良好的抗原性.
作者：赵丽丽；孙伟洋；冯昊；胡桂秋；李岭；李露；郭鹤；赵平森；王化磊；杨松涛；夏咸柱 刊期： 2012年第07期
目的 原核表达抗慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)细胞人源化单链抗体(Humanized single-chain variable fragment,hscFv),并检测其抗原结合活性.方法 从重组质粒pUC57-hscFv中扩增hscFv基因,插入含6×His标签的原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-hscFv,转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的重组融合蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE分析其纯度;Western blot分析其反应原性;间接免疫荧光试验检测其抗原结合活性.结果 重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约为46 000,表达量约占菌体总蛋白的37％,主要以可溶性形式存在;纯化的重组融合蛋白纯度为94％,可与鼠抗6×His单抗及K562细胞表面抗原特异性结合.结论 成功原核表达并纯化了抗CML细胞hscFv,为其进一步应用于CML的临床分子诊断和生物靶向治疗奠定了基础.
作者：朱小影；王东；李身锋；张利军；钟梁；冯文莉 刊期： 2012年第07期
目的 检测人卵巢癌组织中前胸腺素α(Prothymosin α,PTMA)的表达、分布,并分析其与肿瘤分级的相关性.方法 利用卵巢癌组织微阵列,从2块巢癌组织标本和1块癌旁正常组织标本中共获取172份卵巢癌组织和8份癌旁正常组织,对每份肿瘤组织进行病理分级和确定组织类型.采用Western blot法检测卵巢癌和癌旁正常组织中PTMA蛋白的表达水平;免疫组化法检测卵巢癌组织中PTMA蛋白表达的分布.结果 172份卵巢癌组织标本中,病理分级I级22份,Ⅱ级67份,Ⅲ级83份,除4份为子宫内膜腺癌外(均为Ⅱ级),其余均为乳头状腺癌.癌旁正常组织中PTMA的表达量明显低于卵巢癌组织,且差异有统计学意义(P＜0.01).8份癌旁正常组织标本中,5份(62.5％)细胞核染色阳性,多出现在卵巢上皮细胞中,3份染色阴性;172份卵巢癌组织标本中,164份(95.3％)为阳性表达,其中细胞核表达44份,细胞质表达40份,混合表达80份;肿瘤分级与PTMA的分布明显相关(P＜0.01),卵巢癌Ⅲ级多为混合型分布;卵巢癌I级PTMA蛋白的表达水平明显高于卵巢癌Ⅱ、Ⅲ级,且差异有统计学意义(P＜0.01).结论 与癌旁正常组织相比,卵巢癌组织中PTMA蛋白的表达增强,在不同分级的肿瘤组织中,PTMA蛋白的表达分布有变化,为进一步研究其在卵巢癌组织中异常表达的临床意义奠定了基础.
作者：张卓梅；何飞 刊期： 2012年第07期
目的 克隆牛布氏菌virB8基因并在大肠杆菌中进行表达.方法 从牛布氏菌S19基因组DNA中PCR扩增virB8基因片段,插入pEASY-E1载体中,构建重组表达质粒pEASY-virB8,转化E. coli BL.21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经HisTrapTM FF纯化后,进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定.结果 扩增的virB8基因大小为720 bp;重组表达质粒pEASY-virB8经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,表达量占菌体总蛋白的17.3％;纯化的重组蛋白纯度为85％,Lowry法测定蛋白浓度为1.52 mg/ml,可与鼠抗His单抗特异性结合.结论 成功克隆了牛布氏菌virB8基因,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为新型疫苗的研发及布氏菌鉴别诊断方法的建立提供了有效的候选抗原.
作者：张瑞；王秀然；夏力亮；李晓艳；王兴龙；王景龙；冉会玲；钱晶 刊期： 2012年第07期
目的 从兔肋软骨膜中分离间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),并进行鉴定.方法 取3～4周龄新西兰大白兔,采用机械消化法和酶消化法结合的两步消化法获取肋软骨膜细胞,体外培养观察其生长形态;免疫组化法鉴定其表型特征;并检测其诱导成骨、成脂的分化潜能.结果 从肋软骨膜中分离的原代细胞聚集成团,以圆形和多角形为主,从第2代开始细胞形态均一,以梭形为主,呈漩涡状排列,并开始表达CD29和CD90,不表达CD34和Ⅱ型胶原,现已传至15代,生长良好;第3代细胞经诱导可分化为成骨细胞或脂肪细胞.结论 从兔肋软骨膜中可获得干细胞,其具有与MSCs相似的特性.
作者：李敏；刘俊；姜蓉；汪维伟 刊期： 2012年第07期
目的 克隆海藻糖合成酶(Trehalose synthase,Tres)基因,并在大肠杆菌中表达重组酶.方法 以长白山温泉The rmus thermophilus SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增Tres基因,克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-Tres,转化E.coli BL21(DE3),分别采用IPTG和乳糖诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot和薄层色谱(Thin layer chromatography,TLC)分析.结果 重组表达质粒pET-30a(+)-Tres经双酶切及测序证实构建正确;IPTG和乳糖均能诱导重组蛋白的表达,且乳糖诱导的蛋白表达量较高;表达的重组酶Tres相对分子质量约为110 000,可与鼠抗6×His单克隆抗体特异性结合;粗酶液的酶活力为8 760 U/μg,是野生菌酶活的10倍;重组酶水解麦芽糖产物经TLC分析证实,其具有较强的海藻糖合成酶活性.结论 已成功在大肠杆菌中表达了重组Tres,为大规模生产海藻糖奠定了基础.
作者：尚宏丽；顾英；付莉；张挺 刊期： 2012年第07期
基因转移载体主要分为病毒和非病毒载体,研究其生物分布特点对于寻找毒性靶器官,评价生殖系转移危险具有重要参考价值.本文对不同种类基因转移载体的生物分布特点作—综述,为基因转移载体的选择、毒性评价等提供参考.
作者：苗玉发 刊期： 2012年第07期
目的 探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgi α-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响.方法 构建GMⅡ基因真核过表达质粒EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine 2000转染BGC-823细胞,用400 mg/LG418筛选稳定转染的细胞.采用RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞中GMⅡ基因mRNA的转录水平以及蛋白的表达水平,Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞术(Annexin V/PI双染)检测过表达GMⅡ后细胞的凋亡情况.结果 转染重组质粒EX-E2372-M03后,BGC-823细胞GMⅡ基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平明显增加(P＜0.05);细胞凋亡率明显降低(P＜0.05).结论 过表达GMⅡ可能通过抑制胃癌细胞的凋亡,进而促进胃癌的发生发展.
作者：李钒；杨雅莹；易永芬 刊期： 2012年第07期
目的 探讨p16基因对骨肉瘤U-2OS细胞的抑制效应.方法 将p16基因真核表达质粒pcDNA3-HA-p 16和pcDNA3-HA质粒分别转染U-2OS细胞,并设未转染阴性对照组,采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,PI单染法分析细胞周期的分布,DNA ladder法结合PI单染法检测细胞的凋亡情况.结果 p16基因可显著抑制U-2OS细胞的增殖(P＜0.05),且在一定范围内呈剂量效应关系;p16基因可使U-2OS细胞G1期比例显著升高(P＜0.05),S期比例显著降低(P＜0.05);p16基因可使U-2OS细胞凋亡率明显上升(P＜0.05),细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳后呈典型的DNA ladder.结论 p16基因可显著抑制U-2OS细胞增殖,使细胞阻滞于G1期,并促进细胞凋亡.
作者：夏羿凡；余娴；冯丽；袁斌 刊期： 2012年第07期
目的 动态监测百日咳疫苗效价检定用攻击菌在液氮中保存的毒力稳定性.方法 百日咳菌种复苏、培养3代后收集菌苔,比浊稀释后冻存.2008～ 2011年,每年采用改良脑腔攻击试验进行菌毒力的动态监测,分析其毒力稳定性.结果 2008 ～ 2011年,制备的百日咳攻击菌于液氮中保存,4年中毒力无明显变化(P＞0.05),稳定性良好.结论 百日咳攻击菌液氮保存毒力稳定,可用于百日咳疫苗效力试验攻击菌的保存.
作者：王丽婵；卫辰；张路民；徐颖华；骆鹏；张庶民；侯启明 刊期： 2012年第07期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
