佘薇薇；赵晓东；赵耀
目的 探讨人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)标准株在不同细胞中的复制动力学,确定适合分离和培养hMPV的细胞.方法 将hMPV A亚型标准株hMPV/NL/1/00和B亚型标准株hMPV/NL/1/99分别接种于Vero、Vero-E6、LLC-MK2,A549和Hep-2细胞,盲传数代,逐日观察细胞病变(CPE),并于接种后第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天提取细胞RNA,逆转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR检测hMPV F蛋白基因.结果 接种hMPV后3d可在Vero、Vero-E6、LLC-MK2和A549细胞中观察到CPE,不同亚型的hMPV所致的CPE无差别;hMPV可在Vero、Vero-E6和LLC-MK2细胞中稳定复制,不能在A549和HEp-2细胞中稳定传代.结论 Vero、Vero-E6和LLC-MK2细胞是适合培养hMPV的细胞,A549和Hep-2细胞不适合用于培养hMPV.
作者：佘薇薇；赵晓东；赵耀 刊期： 2011年第03期
目的 原核表达并纯化单核李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)溶血素(Listeriolysin O,LLO)蛋白.方法 用1对LM LLO基因特异性引物从LM基因组DNA中扩增LLO基因,并构建重组原核表达质粒pET-30a(+)/rLLO,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的rLLO蛋白经镍离子金属鳌合柱纯化后,进行SDS-PAGE及质谱分析.结果 重组表达质粒pET-30a(+)/rLLO经PCR、双酶切及测序,证明构建正确.表达的rLLO融合蛋白相对分子质量约为78 000,主要以包涵体形式表达.质谱分析显示,两个相对分子质量分别为35 000和45 000的小分子也均为LLO蛋白.结论 已成功地在大肠杆菌中表达了rLL0蛋白,并进行了纯化,为进一步研究LLO蛋白的生物学功能及研制基于LLO蛋白的特异性诊断制剂奠定了基础.
作者：郭建巍；马骢；王珍光；钱扬会；张云；郝秀红 刊期： 2011年第03期
目的 探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对人胚肾293(HEK293)细胞凋亡的影响以及干扰素(IFN)在此机制中的作用.方法 取对数生长期的HEK293细胞,分为6组,ALU-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU)、peDNA3.1-293组[瞬时转染空质粒peDNA3.1(-),作为阴性对照],Poly Ⅰ:C-293组[瞬时转染dsRNA的多聚肌苷胞苷酸(Poly Ⅰ:C),作为阳性对照]、IFNβ-293组(加入1.65×104U IFNβ,作为阳性对照)、空白对照组(未经处理的HEK293细胞)和HBs-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-HBs),转染后48 h,采用MTT法检测细胞的增殖活性;Cellular DNA Fragmentation ELISA和DNA Ladder 法检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR检测细胞中IFNβ基因mRNA的水平.结果 瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU能够抑制HEK293细胞增殖,并促使其凋亡,且细胞中IFNβ mRNA的水平显著上调.结论 RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列能够通过激活干扰素系统来诱导细胞凋亡.
作者：李璇；高建；杨梅；胡文艳；田绿；彭湃澜；王峰；高昌益；任红；唐开福 刊期： 2011年第03期
目的 初步建立流感病毒感染豚鼠模型.方法 通过滴鼻方式分别将A/威斯康星/67/2005(H3N2)、A/广岛/52/2005(H1N1)和B/马来西亚/2506/20043个型别的流感病毒感染豚鼠,观察感染动物的临床症状,并于感染后第1、3、5、7、9、11和13天,取鼻腔洗液和肺组织,采用细胞培养法检测病毒效价.结果 3个型别的流感病毒均能感染豚鼠,感染后3 d,鼻腔和肺组织中病毒效价达峰值,随后逐步下降,直至被清除.结论 豚鼠对H3N2、H1N1和B型流感病毒较为易感.
作者：汤洋；王海漩；乌美妮；胡凝珠；胡云章 刊期： 2011年第03期
目的 探讨肺癌抑癌基因1(Tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1)对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响.方法 采用RT-PCR法从乳腺癌细胞株MCF-7中扩增TSLC1基因全长编码区序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-TSLC 1,转染HNE-1细胞,RT-PCR及Western blot检测TSLC1基因mRNA和蛋白的表达水平.MTT和Transwell小室试验检测TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖及侵袭能力的影响.结果 重组表达质粒peDNA3.1-TSI.C1经双酶切及测序证明构建正确;稳定转染重组表达质粒的HNE-1细胞中TSLC1基因出现过表达;TSLC1基因过表达可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力.结论 TSLCI基因过表达对HNE-1细胞增殖与侵袭能力具有明显的抑制作用,为鼻咽癌的基因治疗提供了理想的分子靶点.
作者：吴晓；冉永刚；陈炯玉；游颜杰 刊期： 2011年第03期
空肠弯曲菌病在世界各地均有发生,主要导致人和动物的细菌性胃肠炎及急性腹泻等.通过细菌蛋白质组学技术研究该类病原菌应对环境变化,尤其是应对宿主的反应机制,以及重要功能蛋白的亚细胞定位等,能够在蛋白水平深人研究弯曲菌病的致病机理.本文就空肠弯曲菌蛋白组学的研究进展作一综述.
作者：祝令伟 刊期： 2011年第03期
目的 探讨白黎芦醇(Resveratrol,Res)对大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤的影响.方法 将SD大鼠随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组,线栓法复制大鼠右侧大脑中动脉栓塞模型),Res低剂量组(15 mg/kg,I/R+R1组)和Res高剂量组(30 mg/kg,I/R + R2组),于缺血2h再灌注24 h进行神经功能缺损评分;化学比色法测定大鼠血清和脑组织中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性;TTC法测定脑梗死体积;干湿重法测定脑含水量,HE染色观察脑组织的病理改变.结果 与I/R组相比,Res能改善大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失(P<0.01),降低血清及脑组织中MDA的含量(P<0.01),提高SOD活性(P<0.01),缩小脑梗死体积(P<0.01),降低损伤侧脑含水量(P<0.01),改善脑组织的病理变化,且呈剂量依赖性.结论 Res对大鼠局灶性脑缺血再灌注氧化应激损伤具有良好的保护作用,其机制可能与清除自由基,减轻氧化性损伤有关.
作者：任俊伟；杨琴 刊期： 2011年第03期
目的 探讨血管生成素-2(Angiopoietin-2,Ang-2)对人结肠癌细胞SW1116增殖的影响及其机制.方法 用不同浓度的Ang-2处理SW1116细胞,MTT法检测其对SW1116细胞增殖的影响;将SW1116细胞分为正常对照、无血清DMEM、Ang-2(1.2mg/L)及PI3K/Akt阻断剂LY29400200(10 μmol/L)+Ang-2组,作用24 h后,MTT法检测LY294002对SW1116细胞增殖的影响,Western blot分析Tie-2、PI3K和Akt蛋白的表达.结果 Ang-2在1.2 mg/L时,对SW1116细胞增殖的影响显著;LY294002能有效抑制由Ang-2引起的SW1116细胞的增殖;Ang-2组与无血清DMEM组比较,Tie-2的表达略有上升,但差异无统计学意义(P>0.05),Akt蛋白的表达显著增强(P<0.01),而PI3K蛋白的表达显著降低(P<0.01),LY294002+Ang-2组中3种蛋白的表达与Ang-2组相比,均明显降低(P均＜0.01).结论 Ang-2能促进SW1116细胞增殖,LY294002可抑制由Ang-2引起的SW1116细胞的增殖,其机制可能与Tie-2/PI3'-kinase/Akt调节的信号通路有关.
作者：张继红；温春阳；尹俐；李相军；李希宁；任立群 刊期： 2011年第03期
目的 探讨激活素A(Activin A)及激活素结合蛋白(Follistatin,FS)在急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中的表达.方法 通过1次/12h给予小鼠5 g/Kg酒精连续灌胃3次,复制急性酒精性肝损伤小鼠模型,采用实时定量RT-PCR检测小鼠肝组织Activin A及FS mRNA表达水平,免疫组织化学染色观察小鼠肝组织Activin A及FS蛋白的表达水平.结果 急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组(P < 0.01); FS mRNA和蛋白表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 急性酒精性肝损伤小鼠肝组织Activin A-FS表达失衡,以Activin A升高为主,提示Activin A-FS系统失衡可能与酒精性肝损伤有关.
作者：于昉；王轶楠；杨清；孟小丹；孙洋；台桂香；柳忠辉 刊期： 2011年第03期
目的 在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)-木聚糖酶(Xylanases,Xyn Ⅱ)融合基因.方法 通过PCR技术将hLY基因与Xyn Ⅱ基因连接,中间插人肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-Xyn Ⅱ-EKsite-hLY,经Sac Ⅰ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCH鉴定为阳性的克隆用甲醉进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和Xyn Ⅱ的活性.结果 获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和Xyn Ⅱ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,Xyn Ⅱ的活性达244 U/ml.结论 已在毕赤酵母中成功表达了Xyn Ⅱ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高.
作者：高金湖；唐存多；邬敏辰 刊期： 2011年第03期
目的 预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP1蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位.方法 以CSBV LN-QY株RNA为模板,RT-PCR扩增结构蛋白VP1基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,对经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对,获得LN-QY株VPl的核苷酸序列和推导的氨基酸序列,建立VPl结构蛋白的3D模型,在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域,亲水性,表面可能性以及抗原指数等参数.结果 VP1结构蛋白的空间构象比较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于47-53,139-145,273-284氨基酸区段.结论 本研究为CSBV LN-QY株VP1蛋白表位疫苗的设计以及血清诊断试剂盒的研制奠定了理论基础.
作者：程健；张佩；马鸣潇；李明；杨松 刊期： 2011年第03期
目的 改进嗜水气单胞菌J-1株灭活疫苗的生产工艺,提高培养效率.方法 采用改良培养基和产毒素培养基,利用机械式通风搅拌培养J-1菌株.确定发酵培养时间,并比较两种培养基的培养效果;用摇瓶灭活和罐灭活J-1菌株培养液,比较不同浓度甲醛的灭活效果.结果 用机械搅拌发酵罐培养J-1菌株,菌体生长12～14 h达峰值,产毒素培养基菌液活菌数平均为102×108 CFU/ml,改良培养基活菌数平均为216×108 CFU/ml,较产毒素培养基提高了111.7%,活菌数大可达300×108 CFU/ml;改良培养基培养J-1菌株,培养液毒力略高于产毒素培养基;0.3%的福尔马林于37℃灭活24 h,可完全灭活J-1菌株培养液,且制备的灭活疫苗福尔马林残留量符合质量标准.结论 改良培养基培养J-1菌株的效果明显优于产毒素培养基,机械式搅拌发酵罐培养嗜水气单胞菌,可比原工艺缩短培养时间一半.
作者：陶家发；赖迎迢；任燕；江小燕；康光辉；张悠；石存斌；吴淑勤 刊期： 2011年第03期
目的 探讨吲哚美辛对人羊膜上皮细胞水通道蛋白(Aquaporin,AQP)8表达的影响.方法 原代培养人羊膜上皮细胞,采用免疫细胞化学法进行鉴定.将细胞分为实验组和对照组,实验组以不同浓度的吲哚美辛(10、20、50、100、200 μmol/L)作用24 h,另以200 μmol/L吲哚美辛分别作用6、12、24、36和48 h,以正常培养的细胞为对照,采用RT-PCR和Westem blot检测各组细胞AQP 8 mRNA及蛋白的表达变化.结果 除10 μmol/L作用细胞外,其他浓度的吲哚美辛均可显著下调人羊膜上皮细胞AQP 8 mRNA及蛋白的表达(P<0.01),其中200 μmol/L吲哚美辛作用组的表达水平低;200 μmol/L吲哚美辛作用的细胞,从作用12h开始,AQP 8 mRNA和蛋白的表达水平均显著低于对照组(P<0.01),且呈时间依赖性,48 h时达低.结论 吲哚美辛可下调人羊膜上皮细胞AQP 8 mRNA和蛋白的表达.
作者：段赵宁；漆洪波；罗欣 刊期： 2011年第03期
目的 制备抗H7N7亚型马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的单克隆抗体,以建立特异、灵敏、简便的H7N7亚型流感病毒金标试纸检测方法.方法 以H7N7亚型EIV为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过血凝抑制(HI)试验和间接ELISA筛选能稳定分泌抗H7N7亚型EIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其分泌的单抗进行生物学特性鉴定.结果 筛选出3株能稳定分泌抗 H7N7亚型EN单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为5B2、1C10和2B7;5B2和100株单抗为IgG2a亚型,2B7单抗为IgGM亚型,轻链均为K链;3株单抗均只与H7N7亚型EIV发生特异性反应,而不与H3N8亚型EIV、马动脉炎病毒(EAV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、马乙型脑炎病毒(JEV)发生交叉反应,特异性良好.结论 已制备出3株针对H7N7亚型EIV的单克隆抗体,为H7N7亚型马流感疫情的快速诊断以及流行病学调查提供了良好的材料.
作者：肖成蕊；宋战昀；刘阳；王伟利；孟庆峰；孟日增 刊期： 2011年第03期
目的 探讨新辅助化疗联合生物治疗对低位直肠癌患者手术治疗前细胞免疫功能的影响.方法 选取直肠癌Dukes C期患者15例,术前采用新辅助化疗XELOX方案两个疗程后进行生物治疗.利用流式细胞仪测定新辅助化疗前及生物治疗前、后T淋巴细胞亚群、NKT细胞以及NK细胞的百分比,并评价患者的近期疗效.结果 患者新辅助化疗前免疫功能低下,经新辅助化疗后,T淋巴细胞亚群、NKT细胞和NK细胞百分比均显著降低((P<0.05);经生物治疗后,T淋巴细胞亚群、NKT细胞和NK细胞百分比与生物治疗前相比,均明显升高.且差异均有统计学意义(P<0.05);患者的临床症状也有所改善,治疗有效率为20.00％,肿瘤缓解率为66.7%.结论 新辅助化疗使直肠癌患者免疫功能进一步降低,在等待手术前应用生物治疗可以提高患者的细胞免疫功能,新辅助化疗联合生物治疗的方法对于提高患者的免疫状态,缩短住院时间,降低复发率具有重要意义.
作者：王旻；杨艳明；刘林林；张宇；季福健；于杰；房学东 刊期： 2011年第03期
病毒小体(Virosome)是含有病毒包膜蛋白的单层脂质囊泡,可作为基因转运、抗原呈递的载体.由于不含病毒基因组及膜蛋白组分可变,病毒小体作为基因载体无潜在致病性,并可人工改变靶向性.目前研究多的病毒小体为流感病毒小体和仙台病毒小体.本文就国内外可用于基因转移的病毒小体构建策略的研究进展作一综述,为进一步开发和完善用于基因转移的病毒小体提供依据.
作者：佟加贝；鲁艳芹；韩金祥 刊期： 2011年第03期
目的 比较截短、全长、全长融合等3种不同形式的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)核酸疫苗在小鼠体内的体液免疫和细胞免疫效果,获得佳的免疫原设计方案.方法 构建经密码子优化的不同形式HBcAg核酸疫苗质粒:pRec2.0-Ct(表达截短至144 aa的Core蛋白),pRec2.0-C(表达全长183 aa的Core蛋白)和pRec2.O-C-preS1(表达全长Core和PreS1融合蛋白),转染293T细胞,Western blot检测目的 抗原基因的表达.将3种核酸疫苗分别免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗-HBc抗体水平,IFNγ ELISPOT法检测小鼠休内HBcAg特异性T细胞免疫应答.结果 3种核酸疫苗质粒经酶切及测序证实构建正确;3种核酸疫苗质粒在293T细胞中均可表达相应蛋白;经3种核酸疫苗免疫后的小鼠均产生了HBcAg特异性抗体和T细胞应答,其中pRec2.0-C组抗-HBc抗体水平和T细胞免疫反应水平均显著高于 pRec2.O-C-preS1组和pRec2.0-Ct组(P<0.05).结论 将HBcAg截短至144个氨基酸或与preS1融合均可降低其体液免疫及细胞免疫应答.
作者：沈林；陈丹；张晓溪；孙志丹；袁京云；王维龙；刘新颖；李鼎锋；刘勇 刊期： 2011年第03期
目的 构建RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒,并在Vero细胞中表达.方法 应用重叠延伸PCR方法,采用一定的linker序列(Gly4Ser)2将已克隆的狂犬病病毒糖蛋白(Rabies virus glycoprotein,RV-G)基因片段和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli heat-labile enterotoxin subunit B,LTB)基因片段进行融合,扩增融合基因Clinker-LTB,并插入真核表达质粒pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-G-linker-LTB,转染Vero细胞,间接免疫荧光试验和Western blot法检测融合蛋白的表达.结果 重组真核表达质粒pVAXI-G-linker-LTB经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染Vero细胞后,可检测到融合蛋白的表达.结论 已成功构建了RV-G/LTB双基因融合真核表达质粒,并在Vero细胞中表达了融合蛋白.
作者：刘娟；刘明远；于录；郭恒；李扬；赵丽晶；孙树民；李慧萍；刘学；王学林 刊期： 2011年第03期
目的 构建人S100A8(hS100A8)重组腺病毒质粒,为hS100A8的深入研究奠定基础.方法 从pGST-hS100A8中扩增hS100A8片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8.经酶切、PCR及测序鉴定,再经Pme I酶切线性化后电转化感受态AdEasier细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A8,经Pac I酶切后转染至HEK293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定.结果 重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8及腺病毒质粒pAdhS100A8经鉴定均构建正确;重组腺病毒AdhS100A8在HEK293中成功包装,扩增后病毒滴度为1011IU/ml;hS100A8在HEK293细胞中成功表达.结论 成功构建了hS100A8重组腺病毒质粒,为深入研究hSl00A8奠定了基础.
作者：郭元元；游莉；徐兰兰；邹正渝；黎玉叶；孙双双；罗进勇；周兰 刊期： 2011年第03期
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科,是有包膜的单正链RNA病毒.HCV基因组约有9 600个碱基,编码的单一开放读码框(Open reading frame,ORF)翻译出约3 000个氨基酸残基的多聚蛋白前体,在宿主细胞及病毒蛋白酶的作用下,剪切成至少10种结构蛋白和非结构蛋白.近年来,一种新的病毒蛋白在一些实验室相继被发现,称为读码框移位蛋白(Alternative reading frame protein,ARFP),或称为F蛋白(Frameshift protein),也有学者称之为Core+1蛋白.F蛋白是由核心基因读码框移位产生的,虽然从发现至今已有10余年,但其生物学功能仍不明确,对其在肝脏疾病和肝细胞癌的发生发展中的作用及其对HCV复制和感染的影响尚有争议.本文就F蛋白的发现、产生机制、抗原性、生化特性及生物学功能等作一综述.
作者：王文博；任浩 刊期： 2011年第03期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
