石慧颖；张冲；李懿；杨永娟；宋冬梅；陈明；宁海京；刘宇；赵敏；支惠；沈心亮
近年来,国际上不断提高对疫苗生产质量的要求,并逐步强化生产工艺的验证.各国的疫苗质量管理部门越来越意识到生产工艺验证对保证疫苗质量的重要性,因此纷纷验证其生产工艺是否符合预定的质量标准.疫苗生产企业根据制定并经注册的生产工艺,将前验证、同步验证、回顾性验证以及过程确认或再验证有效地合理应用到产品中,建立适合产品的验证及确认方法,达到控制疫苗生产工艺的目的.
作者：过琴媛；李芙 刊期： 2008年第12期
目的 研究风疹疫苗病毒松叶株(Matsuba)传代病毒E2基因的遗传特征及其基因稳定性.方法 将Matsuba株毒种RV14在原代兔肾细胞上连续传代至第23代,取第14、16、17、18和23代病毒,利用RT-PCR方法扩增其E2蛋白基因,并与pUC18质粒连接后测序,对各代病毒及参考株的E2基因序列进行比对分析.结果 Matsuba株E2基因全长846 bp,传至23代时仍有很高的同源性,第14、16、17、18和23代与一致序列的核苷酸同源性分别为100%、100%、99.8%、99.8%和99.6%,氨基酸同源性分别为100%、100%、100%、99.3%和99.2%.Matsuba株E2基因与参考株核苷酸序列同源性为91.0～98.7%.Matsuba株各代病毒核苷酸、氨基酸序列高度保守,各关键功能区未发生变异.结论 风疹病毒Matsuba疫苗株E2基因遗传特性稳定,为在分子水平保证Matsuba株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据.
作者：高雪军；可美毓；刘晨鸣；赵雅静；魏至栋；朱莉萍 刊期： 2008年第12期
目的 观察国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的接种反应及其免疫原性.方法 观察组200例和对照组50例暴露后,按照0、3、7、14、28 d免疫程序,分别接种国产、进口冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞).观察组接种疫苗后,观察全身和局部反应情况.采用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测观察组和对照组接种后的血清中和抗体水平.结果 观察组疫苗接种后,局部红肿、硬结、疼痛、瘙痒发生率分别1.4%、0.8%、17.1%和2.4%;全身反应发热、皮疹、头痛、疲劳乏力和其他反应发生率分别为1.2%、0.4%、2.4%、4.2%和0.3%,且在第7天完全消失.观察组与对照组疫苗首剂接种后7 d,抗体阳转率分别为加.3%和37.0%,14 d分别为95.5%和97.7%,差异无统计学意义;且首剂接种后45 d,抗体阳转率均为100%.观察组和对照组疫苗首剂接种后7、14、45 d,血清中和抗体GMT差异无统计学意义,14、45 d血清中和抗体GMT均大于0.5 IU/ml.结论 国产冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)接种反应轻微,并具有良好的免疫原性.
作者：王凌云；孙美平；张雪春；徐若辉；邹艳杰；左永波；齐华 刊期： 2008年第12期
目的 表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建市榆测PT的双抗体夹心ELISA法.方法 PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性.结果 表达的重组蛋白相对分子质量约为19 000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好.结论 已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础.
作者：杨瑜；朱为；应通峰；黄帼英；徐帆洪；瞿爱东 刊期： 2008年第12期
鲍特百日咳杆菌分泌腺苷酸环化酶毒素,该毒素能够将其催化基团转运到真核细胞中,并由真核细胞的钙调蛋白激活,产生大量的cAMP.因此,腺苷酸环化酶毒素既可作为表位运输的工具,又有助于研究细菌毒素蛋白进入真核细胞的机制.本文就百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素的研究进展作一综述.
作者：吴丽洁；徐颖华；张庶民 刊期： 2008年第12期
目的 研究轮状病毒(RV)LLR疫苗株VP7基因的遗传特征,为疫苗的质量控制和发展提供依据.方法 将LLR株轮状病毒毒种LLR38在原代牛肾细胞上连续传至49代.提取第38、43、44、49代病毒RNA.通过RT-PCR扩增VP7基因片段,将其克隆人质粒pGEM-T中,进行序列测定与分析.结果 LLR株VP7基闪全长1 062 bp,含编码326个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF).各代次病毒的VP7基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与GenBanK中LLR参考株(L11602)同源性分别为99.9%和99.7%.与14株G10血清型RV毒株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.3%～87.4%和92.7%～94.9%;与不同血清型RV代表株间,VP7基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为62.2%～76.8%和72.9%～83.1%;在A、B、C 3个重要抗原表位,LLR株与同一血清型RV代表株B223氨基酸同源性高达97.5%,而与不同血清型仅为42.5%～62.5%.结论 轮状病毒LLR疫苗株VP7基因具有良好的遗传稳定性,与来自不同国家同一型别的RV株VP7蛋白氨基酸序列之间无明显差异,在遗传上密切相关,从VP7基因分子水平证明LLR株毒种及其制备的疫苗是安全可靠的.
作者：赵雅静；高雪军；刘晨鸣；魏至栋；冯德杰；朱莉萍 刊期： 2008年第12期
目的 以长链PCR(Long-PCR)技术为基础,应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒(JEV)全长基因组.方法 根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物,分别扩增JEV SA14-14-2株的5'和3'半长分子,在5'端上游引物中引入T7启动子核心序列.利用细胞培养增殖病毒,提取病毒RNA,逆转录后采用Long PCR方法得到JEV的5'和3'两个半长分子,在此基础上进行融合PCR,得到JEV全长cDNA分子,克隆入pGEM T-easy载体,酶切鉴定并测序.结果 扩增出均6 000 bp的JEV的5'和3'两个半长分子及约11 000 bp的全长cDNA片段,其二级结构丰富的非编码区未发生缺失.JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性高达99%,其氨基酸序列同源性高达96.3%.其E蛋白基因与野毒株和减毒株进行比较,核苷酸序列同源性高达98%～99%,氨基酸序列也未出现较大差异.结论 已获得了乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长基因组,为进一步构建感染性克隆奠定了基础.
作者：李静；俞永新；安琪；杨力宏；孔艳 刊期： 2008年第12期
目的 制备新型癌抗原125(CA125)化学发光免疫试剂盒,并进行验证.方法 用1株针对CA125蛋白特异性位点的单克隆抗体作为包被抗体,1株针对CAl25分子糖链的碱性磷酸酶(ALP)标记单抗和另1株针对蛋白特异性位点的ALP标记单抗分别作为酶标抗体,采用双抗体夹心法,金刚烷增敏化学发光体系作为酶底物制备试剂盒,检测CA125,并对试剂盒进行验证.结果 新型CA125试剂盒检测灵敏度达0.1 U/ml,测定范围在0.1～430 U/ml之间,与传统CA125试剂盒一致;与CA199、CA153和CA50糖蛋白无交叉反应;精密性和准确性良好.与传统CA125试剂盒比较,检测结果有显著性差异,特别是在卵巢癌标本检测方面,糖链单抗酶标抗体制备的试剂盒与普通抗体酶标抗体制备的试剂盒检测结果的比值与其他标本两者的比值之间差异具有统计学意义.结论 已制备了新型CA125化学发光免疫试剂盒,其与传统试剂盒检测标本结果的比值更适用于对卵巢癌进行特异性诊断.
作者：王克珍；买制刚；蒋宏伟；丁新荣；杨俊生；庄秋娟 刊期： 2008年第12期
目的 构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达.方法 经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达.结果 融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24 h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267 bp的目的 基因片段.结论 已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白.
作者：何永林；朱道银；伊正君；杨春；徐蕾；王瑜伟 刊期： 2008年第12期
目的 应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒.方法 用7 L、75 L和550 L生物反应器逐级放大培养Veto细胞,每天取样进行细胞计数.在550 L生物反应器巾培养脊髓厌质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度.结果 一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数高;病毒培养体积达350 L,病毒收获液滴度大于7.625 IgCCID50/ml.结论 通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒.
作者：衡燮；李桂兰；奚光跃；温嘉纳；沈伟；何秀莲；唐成丽；廖国阳；姜述德；孙明波 刊期： 2008年第12期
目的 观察在不同温度保存条件下噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子的稳定性.方法 将噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子样品分为两组,一组添加等体积的80%甘油,另一组不添加甘油,分别于不同温度条件下存放不同时间后取样,用妹噬斑法检测滴度.结果 在37℃和25℃条件下保存,噬菌体疫苗种子滴度下降较快,在4℃和-20℃条件下保存噬菌体疫苗种子滴度下降相对较慢;37℃、25℃及4℃条件下保存,添加甘油并无明显的保护作用,而在-20℃条件下保存,添加甘油有明显的保护作用.结论 噬菌体展示的1型糖尿病疫苗种子可在4℃条件下短期保存,-20℃条件下长期保存,并可添加甘油作为保护剂.
作者：王海漩；段金梅；胡凝珠；任万军；兰芸；胡云章 刊期： 2008年第12期
2008年2月7日,浙江省松阳县裕溪乡裕溪村一条本地犬咬人后自毙,其脑组织被送至丽水市疾病预防控制中心检测.犬伤者孝某某,女,80岁,右脚而被咬伤,属二级暴露,于被咬当日在当地防保站接种狂犬病疫苗(辽宁成大生物股份有限公司产品,批号20070902-5),按照0、4、7、14、28的程序进行全程接种,未接种狂犬病免疫球蛋白.
作者：叶茂华；雷永良；王晓光 刊期： 2008年第12期
目的 探讨表皮生长因子(EGF)G61A位点(EGF+61)多态性与慢性乙型肝炎肝细胞癌的相关性.方法 运用多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,检测中国人群中215例慢性乙型肝炎肝细胞癌患者和104例正常对照者EGF+61位点的基因型,分析基因型及等位基因的分布频率.结果 EGF+61位点基因型及等位基因在乙型肝炎肝细胞癌患者及对照者的分布频率差异均无统计学意义.TNM Ⅰ、Ⅱ及TNMⅢ、Ⅳ两组的基因型及等位基因的分布频率差异也无统计学意义.结论 在中国人群中,EGF+61位点的基因多态性与乙型肝炎肝细胞癌的发生和进展程度无密切关系.
作者：戚鹏；陈岳明；高春芳；房萌；孙小娟；刘艳 刊期： 2008年第12期
microRNA是一种长约22 nt的非编码性小RNA,通过与靶基因的3'非翻译区(3'-UTR)结合来调控靶基因的表达.microRNAs的功能涉及多种生物学过程,与细胞分化、器官形成、肿瘤发生等密切相关.近年来发现,microRNAs在免疫细胞的产生、发育以及免疫应答过程中有着重要的作用.本文主要对microRNAs在免疫系统中的发展及对免疫功能调控的新研究进展作一综述.
作者：丁瑜；张学峰；张嘉保 刊期： 2008年第12期
目的 在原核表达系统巾表达肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测.方法 PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基凶,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+).espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达.以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的 蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果.通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用.结果 重霍延伸PCR方法扩增出1 319 bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的 蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%.两种温度下,目的 蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%.Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应.融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157:H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应.融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%.免疫小鼠血清町以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用.结论 已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHEC O157:H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础.
作者：程琰；罗萍；张卫军；顾江；邹全明；毛旭虎 刊期： 2008年第12期
目的 建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺.方法 利用7.5 L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞,接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种,根据葡萄糖的消耗量,分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度,每24 h取样,检测病毒滴度.收获的病毒液经纯化后,制备乙脑灭活疫苗,检测各项指标.结果 Vero细胞培养至96 h,葡萄糖消耗量达高峰,细胞密度达峰值;接种病毒后72 h,葡萄糖消耗量达高峰,灌流量为7 L/d,连续收获7～9 d,共可收获(40±5)L病毒液;96 h病毒滴度达高峰,为10.0 LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到<中国药典>三部(2005版)要求.结论 已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺.
作者：张晋；张月兰；赵玉秀；王辉；马乐；马可；牛志彬；梁宏阳 刊期： 2008年第12期
目的 观察左旋卡尼汀对大鼠缺血心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3表达的影响.方法 将SD大鼠随机分成3组:空白对照组、缺血组和左旋卡尼汀组.缺血组及左旋卡尼汀组给予异丙肾上腺素建立心肌缺血模型,左旋卡尼汀组提前经腹腔注射左旋卡尼汀.原位末端标记(TUNEL)法测定凋亡的心肌细胞,免疫组化法测定Bcl-2及Caspase-3蛋白的表达.结果 左旋卡尼汀组与缺血组相比,心肌组织Bcl-2蛋白表达率显著升高,细胞凋亡率和Caspase-3蛋白表达率显著降低.结论 左旋卡尼汀在异丙肾上腺素所致的心肌缺血大鼠模型中,对缺血缺氧心肌有保护作用,其机制可能是通过调节Bcl-2和Caspase-3介导的细胞凋亡而实现的.
作者：荆翠平；陈丽娟；刘磊；于景文 刊期： 2008年第12期
纳豆激酶是一种具有强烈溶栓功能的碱性丝氨酸蛋白酶,近年来,国内外学者对其进行了广泛的研究.本文介绍了纳豆激酶的理化性质、主要生物学活性、溶栓机理及其生物学活性体外检测方法的研究进展.
作者：丁有学；刘兰；袁力勇 刊期： 2008年第12期
目的 构建多拷贝脑钠肽(BNP)基因重组表达质粒,并探讨BNP基因的拷贝数与其表达水平的相关性.方法 通过人工合成和PCR技术扩增BNP基因,将其克隆至载体pCW111中,构建表达质粒pBNP11,并通过亚克隆构建含有不同数量表达盒的正向串联表达质粒,分别转化大肠杆菌DH5α和BL21(DE3),经温度诱导表达,SDS-PAGE分析,并经激光扫描测定目的 蛋白的表达量.结果 测序及酶切鉴定证明1～3拷贝BNP重组表达质粒构建正确,重组蛋白在大肠杆菌DH5a和BL21(DE3)中均可获得表达,表达量分别为菌体总蛋白的8.12%、9.94%、和9.18%.结论 已构建了多拷贝BNP的重组表达质粒,BNP的表达水平随BNP拷贝数的增加而升高,但并末成倍增加.
作者：易俊波；买制刚；卢海蓉；黄德新；李凌云；林枫 刊期： 2008年第12期
目的 建立具有焦谷氨酸封闭N-端的重组抗体N-端氨基酸序列分析方法.方法 利用高温稳定的焦谷氨酸肽酶,在重组人源抗狂犬病病毒单抗样品高温变性条件下,去除其N-端焦谷氨酸封闭.经还原SDS-PAGE和电印迹后,进行N-端氨基酸序列测定,并与电印迹后在PVDF膜上去封闭处理效果进行比较.结果 用该方法去封闭后的抗体样品N-端焦谷氨酸去除效果较好,可顺利进行N-端氨基酸序列测定;而电印迹后在PVDF膜上二去封闭处理,N-端焦谷氨酸不能充分去除,无法进行N-端氨基酸序列测定.结论 该方法适于具有焦谷氨酸封闭N-端的单抗的N-端氨基酸序列分析.
作者：魏敬双；程立均；贾茜 刊期： 2008年第12期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
