学术投稿

表达人泛素样修饰子基因细胞株的构建及其鉴定

鲁可可;朱虎;胡艳秋;袁娲;周作民;沙家豪;李建民

关键词:人泛素样修饰子(hUBL), 基因克隆, 蛋白表达, 逆转录病毒载体, 293T细胞
摘要:目的:构建人泛素样修饰子(hUBL)基因的逆转录病毒载体并转染293T细胞,以探讨其生物学功能.方法:将hUBL克隆到原核表达质粒PET28a中,构建重组质粒PET28a-hUBL,转化BL21菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.用其纯化蛋白免疫小鼠,获得多克隆抗体.重组蛋白用Western blot鉴定.将hUBL基因克隆到逆转录病毒质粒中并转染293T细胞,用免疫组化染色法鉴定hUBL基因的表达.结果:hUBL在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了hUBL-PET28a的融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗hUBL蛋白的小鼠多克隆抗体.免疫组化染色表明,hUBL重组逆转录质粒可在293T细胞中高效表达hUBL蛋白.结论:成功地构建了hUBL重组逆转录病毒载体,使得其在293T细胞中表达,获得稳定表达的细胞株.
南京医科大学学报(自然科学版)杂志相关文献
  • 不同浓度酒精对慢性饮酒大鼠胃黏膜细胞增殖的影响

    目的:探讨不同浓度酒精刺激对慢性饮酒大鼠胃黏膜细胞增殖的影响及其在适应性细胞保护作用中的意义.方法:分别以1%、3%、6%、12%和24%(V/V)的酒精水溶液作为大鼠饮水的唯一来源,饮用3天后,再向胃内灌注100%酒精,观察大鼠胃黏膜的损伤情况.同时用免疫组化法检测增殖性细胞核抗原(PCNA)的表达,应用计算机图像处理技术观察饮酒不同时程的大鼠胃黏膜的细胞增殖和凋亡以了解其细胞更新的情况.结果:与对照组相比,100%酒精灌胃后大鼠胃黏膜的损伤情况如下,饮用1%和3%酒精的大鼠差异无显著性,而饮用6%和12%酒精的大鼠的胃黏膜损伤显著性降低,但饮用24%酒精的大鼠差异无显著性.饮用6%和12%酒精的大鼠胃黏膜的细胞增殖显著增加,提示胃黏膜的细胞更新增强.结论:慢性饮酒大鼠胃黏膜的细胞更新增强可引起胃黏膜的适应性细胞保护作用,此作用和饮用的酒精浓度有关.

    作者:孙阳;杜军;陈敏;戈应滨 刊期: 2004年第04期

  • 辛伐他汀对糖尿病大鼠尿转化生长因子-β1排泄率的影响及对肾脏保护的研究

    目的:观察他汀类药物辛伐他汀对链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病大鼠早期糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)的保护作用.方法:50只雄性SD大鼠分为3组:①正常对照组;②糖尿病对照组;③糖尿病辛伐他汀干预组.干预8周后检测肾重/体重比,观察肾结构病变,测大鼠尿蛋白及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的排泄率.结果:糖尿病对照组尿TGF-β1及蛋白排泄量明显高于正常对照组,肾重/体重比增高,并出现了肾脏器质性损伤,而辛伐他汀则减轻了这种病变.结论:辛伐他汀可以延缓DN进展,这种作用可能是通过抑制TGF-β1的分泌实现的.

    作者:王昕;刘超;刘翠萍;魏群利;吕国良;唐伟 刊期: 2004年第04期

  • 胰岛素样生长因子-1基因表达对糖尿病大鼠血糖的影响

    目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因表达对糖尿病(DM)大鼠血糖的影响.方法:将含人IGF-1基因的重组转运质粒pCMV/IGF-1 DNA每鼠400μg肌内注射于DM大鼠模型(T组,n=7)体内,对照组(C组,n=7)给予同等剂量pCMV空载质粒DNA,同时设立正常对照组(N组,n=7)和DM对照组(DM组,n=7).观察大鼠血糖和血IGF-1浓度(ELISA法),用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法比较治疗前后大鼠肝、肾、骨骼肌等组织IGF-1 mRNA表达量变化.结果:IGF-1基因治疗后,T组血糖较治疗前明显下降,由(28.71±1.79)mmol/L至(17.02±1.69)mmol/L,同时血IGF-1较基础水平明显升高,由(109.34±10.90)ng/ml至(1 35.61±6.15)ng/ml;T组大鼠在接受治疗后,血糖明显低于C组和DM组(P<0.000 1),而血IGF-1明显高于C组和DM组(P<0.000 1);RT-PCR结果显示,T组大鼠肝脏和骨骼肌IGF-1 mRNA表达量明显高于DM组(P<0.000 1,P=0.002),肾组织IGF-1基因含量与DM组比较,无明显统计学差异(P=0.387).结论:IGF-1基因表达能有效降低DM动物血糖,为开展DM治疗新策略奠定基础.

    作者:段宇;周红文;汪承亚;陈家伟 刊期: 2004年第04期

  • 良性前列腺增生内腔镜手术的配合

    腔镜在泌尿外科手术中的运用越来越广,我院陆续开展了经尿道前列腺电切术(TURP)、经尿道前列腺汽化切割术(TUVP)和经尿道前列腺等离子汽化术(TUPVP).腔镜手术具有创伤小、手术时间短、术后恢复快等优点,受到患者的欢迎.我院自2002年1月~2003年6月完成良性前列腺增生内腔镜手术221例,由于术前做好充分的准备,术中严密观察、密切配合,均取得了满意的效果.

    作者:冯建萍 刊期: 2004年第04期

  • 外周血人类斯钙素1基因表达与消化道恶性肿瘤微转移关系的研究

    目的:探讨靶基因人类斯钙素1(hSTC-1)在消化道恶性肿瘤患者外周血中的表达以及与肿瘤微转移的关系.方法:采用RT-PCR方法检测69例消化道恶性肿瘤患者外周血中的人类斯钙素1(hSTC-1)mRNA,12例健康成人、4例妊娠期妇女、14例消化道炎症疾病患者,并检测12例消化道恶性肿瘤患者手术中新鲜组织标本中的hSTC-1 mRNA.结果:69例消化道恶性肿瘤患者外周血中,食管癌组hSTC-1 mRNA的阳性率为52.9%(9/17例),胃癌组的阳性率为57.7%(15/26例),大肠癌组的阳性率为53.8%(14/26例),消化道恶性肿瘤患者手术中新鲜组织标本的阳性率为100%(12/12例);而健康成人、妊娠期妇女、消化道炎症疾病患者外周血中无1例出现阳性.将肿瘤患者hSTC-1 mRNA检测结果与临床病理结合分析发现:外周血中的hSTC-1 mRNA的表达与肿瘤的浸润深度、临床病理分期、淋巴结转移有显著相关性.结论:应用RT-PCR方法检测消化道恶性肿瘤患者外周血中的hSTC-1 mRNA具有较高的敏感性和特异性,可成为检测肿瘤外周血微转移的一个新指标.

    作者:吴平平;黄培林;郭英;谢维 刊期: 2004年第04期

  • 腹腔镜下经腹膜外途径前列腺癌根治术2例报告

    患者1,66岁,因反复尿频、尿急2年加重1周而就诊.直肠指检:前列腺Ⅱ度,质地硬,表面光滑无结节,中央沟消失;血清前列腺特异性抗原(PSA)35.9 lμg/L;B超检查:前列腺4.5 cm×4.5 cm×3.0 cm,前列腺周围带有一低回声区.给予苯甲酸雌二醇1 mg,每日2次,治疗10天后复查PSA为5μg/L.

    作者:宋宁宏;吴宏飞;孙跃明;华立新;苏建堂 刊期: 2004年第04期

  • 射频肝肿瘤灭活对兔肾功能的影响

    目的:探讨射频肝肿瘤灭活术对肾脏的影响.方法:22只植有VX2肝肿瘤的新西兰白种兔随机分为2组:A组(治疗组n=15),开腹后对肝肿瘤进行射频治疗,功率为30 A,持续3~4 min.B组(对照组n=7),开腹后关腹,不作任何治疗.分别于术前、术后3、7、14天观察血中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿中红细胞和病理变化.结果:A组术后3天尿素氮升高,肌酐升高,尿中红细胞增多,肾小管上皮发生颗粒样变性.术后7天肌酐恢复正常水平,14天后各项指标均恢复正常.B组无明显变化.结论:射频肝肿瘤灭活术对肾脏有影响作用,但是为可逆性暂时性的损害.

    作者:褚朝顺;苗毅;郭峰;奚春华;黄承荣 刊期: 2004年第04期

  • 中枢性尿崩症对91例重症脑功能障碍患者的预警价值

    在加强重症监护病区(ICU)收治的危重病患者中,出现脑功能障碍并不少见.在多器官功能障碍患者中,脑功能障碍程度是影响病情严重程度和预后的重要因素之一[1].ICU多器官功能障碍患者中脑功能衰竭者住院时间长,病死率高[2].一些重症脑功能障碍患者可并发中枢性尿崩症.本研究对2000年1月~2002年3月本院ICU收治91例重症脑功能障碍患者的多项指标进行分析,以探讨中枢性尿崩症对评估重症脑功能障碍患者病情及预后的价值.

    作者:陈峰;孙华 刊期: 2004年第04期

  • 表达人泛素样修饰子基因细胞株的构建及其鉴定

    目的:构建人泛素样修饰子(hUBL)基因的逆转录病毒载体并转染293T细胞,以探讨其生物学功能.方法:将hUBL克隆到原核表达质粒PET28a中,构建重组质粒PET28a-hUBL,转化BL21菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.用其纯化蛋白免疫小鼠,获得多克隆抗体.重组蛋白用Western blot鉴定.将hUBL基因克隆到逆转录病毒质粒中并转染293T细胞,用免疫组化染色法鉴定hUBL基因的表达.结果:hUBL在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了hUBL-PET28a的融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗hUBL蛋白的小鼠多克隆抗体.免疫组化染色表明,hUBL重组逆转录质粒可在293T细胞中高效表达hUBL蛋白.结论:成功地构建了hUBL重组逆转录病毒载体,使得其在293T细胞中表达,获得稳定表达的细胞株.

    作者:鲁可可;朱虎;胡艳秋;袁娲;周作民;沙家豪;李建民 刊期: 2004年第04期

  • 钾通道开放剂KRN4884对猪冠状微血管内皮源性超极化因子介导松弛的影响

    目的:高钾溶液能够减少血管内皮源性超极化因子(EDHF)介导的舒张,本研究拟观察ATP敏感的钾通道开放剂KRN4884(ATP-SPCOs)能否影响经高钾溶液孵育后的猪冠状微动脉中EDHF介导的舒张.方法:将猪冠状微动脉血管段(200~450 μm)固定于肌张力描记装置的器官小室中,37℃下以高钾溶液(K+20 mmol/L)孵育1 h后,用血栓素类似物(U46619)收缩血管,在环氧化酶抑制剂吲哚美辛(INDO),一氧化氮合成酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(L-NNA)以及NO捕捉剂氧合血红蛋白(HbO)存在的条件下,观察缓激肽(BK,Ⅰ组)诱导的EDHF介导的舒张功能,以及将不同浓度的KRN4884加入高钾溶液中对血管进行孵育后(II-1,2,3组),这种功能的变化情况.结果:经高钾溶液呼育后,BK诱导EDHF介导的大舒张明显被减少,(72.5±7.8)%比(41.6±10.6)%;P<0.05.KRN4884在浓度为-4log mol/L和-7log mol/L时降低U46619诱发的血管收缩力,(1.7±0.3)比(7.1±1.9)mN.P<0.05;3.2±1.6比7.8±1.7mN,P<0.05;在浓度为-8log mol/L(5.8±1.7)比(7.1±1.5)mN,n=11;P>0 05时,其降低血管收缩力的作用不明显.用KRN4884(-8log mol/L)加入高钾溶液可部分恢复这种被减少的EDHF的功能(59.9±5.6)%比(77.2±5.3)%,P<0.008.结论:在猪冠状微动脉,高钾溶液可以损伤EDHF介导的微血管舒张功能,而KRN4884可能部分恢复这种被损伤的功能.

    作者:邹卫;何国伟;严秉泉 刊期: 2004年第04期

  • 多层螺旋CT腹腔动脉成像在不同重叠率与成像方法的相关研究

    目的:通过比较3种不同的重叠率所获得的腹腔动脉及其分支图像质量,以获得多层螺旋CT(MSCT)血管成像(MSCTA)理想的重建参数.方法:随机选择45例临床推荐行腹部增强扫描的患者纳入研究,选择3.0mm×2.5 mm的扫描参数,对横断面扫描图像的原始数据分别用重叠率0%,50%和75%进行层厚3.0 mm轴面重建.采用大密度投影(MIP)和容积重建(VR)两种后处理成像方法.根据腹腔动脉及分支血管边缘的清晰度、腹腔动脉的分支级别显示情况进行综合评分,由2位有经验的放射科医师用双盲法评分,所有统计工作应用SPSS软件完成.结果:3种不同重叠率对腹腔动脉血管成像的总体质量以75%与50%重叠率图像质量佳,两者差异无显著性(P>0.05),75%、50%重叠率图像质量高于重叠率0%(P<0.05).结论:多层螺旋CT腹腔动脉血管成像选择3.0 mm层厚、50%重叠率能很好显示腹腔动脉及分支,VR比MIP重建的血管图像更优.

    作者:陈文华;黄庆娟;徐青 刊期: 2004年第04期

  • 婴幼儿喘息性疾病210例与呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒及肺炎支原体感染的关系及随访观察

    目的:了解婴幼儿喘息性疾病与呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体感染的关系,以及与支气管哮喘的相关性.方法:对同期下呼吸道感染的婴幼儿进行呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体抗体的检测,并收集特异性体质的表现及家族史,对有喘息症状的部分患儿进行随访.结果:喘息组患儿以上3种病原体感染率高于非喘息组;89例喘息患儿随访中,有68.91%的患儿转为哮喘,这部分患儿的特异性体质表现及家族史经统计分析与发病密切相关.结论:婴幼儿喘息性疾病与呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体感染密切相关,但是否发展为哮喘主要与特异性体质及家族史有关.

    作者:卢秋穗;张银美 刊期: 2004年第04期

  • 舌扁桃体肥大症305例微波治疗

    1998~2002年我院用微波治疗舌扁桃体肥大症305例,取得良好效果,现报告如下.

    作者:张继屏;刘昌定 刊期: 2004年第04期

  • 高效液相色谱法测定多菌灵在油菜籽中的残留量

    多菌灵是一种苯并吡唑类优良的广谱、内吸性杀菌剂,可有效防治多种农作物病害,在油菜的栽植过程中常常使用多菌灵控制病害.但它的化学性质稳定,能通过作物叶片和种子渗入植物体内,残效期长,并可通过食管引起中毒[1],因此,多菌灵的残留量分析越来越受到重视.多菌灵的残留分析目前主要有比色法、荧光分析法、薄层扫描法,高效液相色谱法(HPLC)法,气相色谱法(GC),紫外光谱法等.李桂凤等[2]报道了多菌灵在含油量多的花生中残留量的HPLC分析方法,但不适应于油菜籽的分析.本文报道油菜籽中多菌灵残留量的液相色谱分析方法及样品的前处理技术.

    作者:高蓉;赵人琤;杨俊;陈景衡;肖杭 刊期: 2004年第04期

  • 自体大张中厚皮片修复烧伤瘢痕癌缺损创面2例报告

    例1男性,34岁.4岁时因火焰烧伤右下肢在家中自行治疗2个月后大部分创面愈合,但咽窝中心部有一约6 cm×5 cm大小的创面,30年未愈合而入院.2年前,局部创面出现扩大,渗出物增多,并伴有恶臭,患肢疼痛剧烈.

    作者:聂兰军 刊期: 2004年第04期

  • 恶性嗜铬细胞瘤19例诊断与治疗分析

    目的:对恶性嗜铬细胞瘤临床诊治进行回顺分析,以提高其诊断和治疗水平.方法:临床有高血压或腹部疼痛不适症状1 8例,无症状1例.尿儿茶酚胺(CA)、尿香草基苦杏仁酸(VMA)阳性率分别为31.6%、63.2%.CT、磁共振成像(MR)等检查证实腹膜后病灶多呈异位或浸润性生长.19例均在全麻下行手术治疗.结果:12例完整切除肿瘤,7例部分切除或包膜内剜除.完整切除病灶者术后情况良好,随访1~5年未出现复发.结论:对恶性嗜铬细胞瘤应结合临床、手术及病理以早期诊断,肿瘤根治切除能获得良好的治疗效果.

    作者:邵鹏飞;钱立新;吴宏飞;张炜;顾民;徐正铨;眭元庚 刊期: 2004年第04期

  • 持续低温烧伤46例临床分析

    人们在生活中常会接触一些温度不太高的热源用作取暖工具,如热水袋、烫壶等.但由于使用人熟睡、昏迷或偏瘫等原因暂时失去知觉,使身体某一部位长时间持续接触此类低温热源,致使热量积蓄而导致接触部位的皮肤皮下组织烧伤称之为低温烧伤,由于冬季中取暖工具使用广泛故此种烧伤的发病率高|1,2|.我科于2002~2003年共收治46例低温烫伤的患者,经治疗后全部治愈出院,现报告如下.

    作者:成智 刊期: 2004年第04期

  • 选择性抑制剂celecoxib诱导肝癌细胞凋亡及其相关分子机制的实验研究

    目的:研究环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂celecoxib抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡过程中的作用及其可能的机制.方法:采用celecoxib作用于Bel-7402、SMMC-7721的2种肝癌细胞株,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定肿瘤细胞的增殖抑制率、TUNEL实验、流式细胞术检测细胞凋亡率、免疫细胞化学和Western blot实验测定细胞凋亡及Akt信号转导途径相关蛋白的激活状态.结果:MTT法显示celecoxib可抑制上述两株肝癌细胞增殖;TUNEL实验及流式细胞术结果证实,celecoxib处理后的肿瘤细胞可发生细胞凋亡;免疫细胞化学及Western blot实验显示,celecoxib诱导凋亡主要是通过抑制Akt的Thr308磷酸化,进而激活caspase-9、caspase-3进行的.结论:celecoxib明显抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,其主要机制可能通过Akt信号转导途径、激活caspase通路实现的.

    作者:刘宁波;彭韬;沈波;冷静 刊期: 2004年第04期

  • 脊柱滑脱外固定复位器研制及临床应用(附41例报告)

    目的:减少脊柱滑脱手术创伤及对其进行有效安全复位.方法:自行设计研制脊柱滑脱外固定复位器.一期经皮椎弓根钉脊柱滑脱外固定复位器体外固定缓慢复位.二期滑脱椎间前路植骨融合.临床应用47例,41例获随访,其中峡部裂性滑脱32例,退行性滑脱9例;Ⅰ°滑脱16例,Ⅱ°25例.随访10个月至6年,平均35个月.结果:41例随访病例中,腰痛41例,34例缓解,5例部分缓解,2例无明显改善.下肢放射痛15例,14例症状消失.间歇性跛行35例均消失,行走困难22例获改善.日常工作生活困难者32例均恢复.术后38例滑脱完全复位,3例部分复位.滑脱椎间融合均良好.1例术后完全复位拆架后4个月再现部分滑脱.结论:脊柱滑脱外固定复位器研制应用可行,疗效良好.

    作者:金正帅;王道新;吴逎庆 刊期: 2004年第04期

  • 球形幽门螺杆菌vacA基因的克隆及序列测定

    目的:克隆球形幽门螺杆菌(HpC)vacA基因全长片段,并进行序列分析.方法:采用亚抑菌浓度的抗生素作用,使幽门螺杆菌(Hp)标准株NCTC11637发生球形变异,收集球形Hp.从HpC基因组DNA中特异扩增出vacA基因片段,扩增的目的片段经纯化回收后克隆到pMD-18T中,转化入大肠杆菌JM109.阳性重组质粒用PCR及双酶切鉴定,并进行序列测定.结果:从HpC基因组DNA中扩增出3 888bp的vacA基因,构建重组质粒pMD-18T-vacA,酶切产物的大小与预期相符.测序结果显示,HpC与已公布的Hp vacA基因序列的同源性达99.8%.结论:成功地对HpC vacA基因进行体外扩增及构建原核重组质粒pMD-18T-vacA,并经酶切及序列分析所验证,证明HpC含有完整的vacA基因,其可能与Hp的致病性有关.

    作者:汪雪峰;王克霞 刊期: 2004年第04期

南京医科大学学报(自然科学版)杂志

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主管:江苏省教育厅

主办:南京医科大学