孙骏；侯筱魁；李旭；张如明
背景:促红细胞生成素能够促进内皮祖细胞增殖、迁延形成新生血管,因此促红细胞生成素可能在骨髓间充质干细胞增殖分化中起重要作用.目的:观察促红细胞生成素对人骨髓间充质干细胞增殖和细胞周期的影响.设计、时间及地点:于2007-07/11在兰州军区兰州总医院血液病研究所完成对比观察性细胞实验.材料:骨髓液标本来源于自愿捐献患者,所有患者对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.方法:采用Percoll淋巴细胞分离液,以密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪榆测第2,3代细胞增殖周期.在无血清条件下,以0.25,0.50,1.00,2.00,5.00 U/mL的促红细胞生成素与骨髓间充质干细胞共培养,以不加促红细胞生成素培养的骨髓间充质干细胞为对照;将10 U/mL促红细胞生成素与骨髓间充质干细胞共培养72 h,应用流式细胞仪检测细胞周期情况.主要观察指标:①培养24,48,72 h后,以MTT方法检测骨髓间充质干细胞增殖情况.②10 U/mL促红细胞生成素与骨髓间充质干细胞共培养72 h,流式细胞仪检测细胞周期情况.结果:骨髓间充质干细胞与促红细胞生成素共培养后,骨髓间充质干细胞的增殖指数明显增加,促红细胞生成素呈时间、剂量依赖性促进骨髓间充质干细胞增殖,以5 U/mL促红细胞生成素促骨髓间充质干细胞增殖作用明显.与对照组比较,促红细胞生成素干预组G0/G1期比例降低,S期和G2/M期细胞比例增加,两组差异显著(P<0.05).结论:在促红细胞生成素培养条件下可以促进更多的骨髓间充质干细胞进入DNA合成期,从而有更多的细胞分裂,产生大量的增殖细胞,并且这种影响呈时间、剂量依赖性.
作者：张海红；侯相麟；王小蕊 刊期： 2008年第29期
背景:近年的研究发现,染料木黄酮具有抗氧化、抑制血管生成、调节细胞周期等生物活性.目的:观察染料木黄酮在体外诱导HL-60细胞凋亡过程中,对HL-60细胞c-Myc,Bcl-2和增殖细胞核抗原表达水平的影响,并分析其作用途径.设计、时间及地点:对比观察的细胞分子生物学实验,于2006-03/2007-09在广东医学院血液疾病研究室完成.材料:人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60来源于中国典型培养物保藏中心.方法:HL-60细胞分别以0.1,0.5和1.0 mmol/L的染料木黄酮处理12～16 h,显微镜下观察并经DNA凝胶电泳检测细胞凋亡情况.分别经碘化丙啶染色和经异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人Bcl-2,c-Myc及增殖细胞核抗原单克隆抗体作用后,用流式细胞仪检测凋亡细胞和Bcl-2,c-Myc和增殖细胞核抗原阳性细胞的表达百分率.主要观察指标:①HL-60凋亡细胞的形态学变化.②HL-60细胞凋亡百分率和c-Myc,Bcl-2及增殖细胞核抗原表达阳性率.结果:①HL-60细胞经染料木黄酮处理12～16 h,显微镜下可见核碎裂和凋亡小体等细胞凋亡形态学改变:DNA凝胶电泳显示典型的凋亡DNA梯形条带.②0.1～1.0 mmol/L的染料木黄酮在诱导HL-60细胞凋亡同时,下调Bcl-2,c-Myc和增殖细胞核抗原表达水平,且均呈剂量效应关系.结论:染料木黄酮可能通过抑制Bcl-2和c-Myc的表达水平从而诱导HL-60细胞凋亡;而增殖细胞核抗原表达下调,则可能是染料木黄酮诱导HL-60细胞凋亡的结果.
作者：杨志刚；熊丹；蔡玉桂；梁亮；李庆华 刊期： 2008年第29期
目的:拟利用人转化生长因子β 1基因转染骨髓基质干细胞,再与可降解藻酸钙材料复合构建具有较好生物学活性的组织工程化人工骨软骨,以期获得良好的软骨间整合.方法:雄性12个月龄的崇明山羊18只.由上海交通大学附属第九人民医院动物实验中心提供.携带人转化生长因子β 1基因的重组腺病毒由上海交通大学附属第九人民医院骨科研究室提供.制备藻酸钙凝胶的氯化钙、藻酸钠为Gibco公司产品.从羊髂嵴抽取8 mL骨髓,贴壁法分离培养骨髓基质干细胞,传至第3代以携带人转化生长因子β 1基因的重组腺病毒转染过夜.18只山羊均于双膝股骨内髁负重区建立骨软骨缺损模型,造模后分为3组,6只,组:转染细胞-藻酸钙组将转染人转化生长因子β 1基因的骨髓基质干细胞悬于1.2%藻酸钠中,调整细胞密度为5×1010L-1,吸取5 mL注入骨软骨缺损处,随后缓慢滴入过量的2.5%氯化钙,使氯化钙与藻酸钠发生交联反应形成藻酸钙凝胶.复合对照组同法注入未转染人转化生长因子β 1基凼的骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶,模型组不给予任何干预.转染后Western blot法检测细胞外源基因的表达.移植后组织形态学检查及缺损评分.结果:人转化生长因子β 1基因转染后,骨髓基质干细胞表达人转化生长因子β 1,并分泌细胞外基质Ⅱ型胶原及Aggrecan.移植后24周,转染细胞-藻酸钙组缺损获得类透明样软骨修复,复合对照组及模型组均为纤维组织或纤维样软骨修复.与模型组比较,移植后第12,24周复合对照组、转染细胞.藻酸钙组骨软骨缺损组织形态学评分均明显升高(P<0.05),且转染细胞-藻酸钙组升高幅度显著大于复合对照组(P<0.05);转染细胞.藻酸钙组缺损评分随着修复时间的延长而明显升高(P<0.05).结论:实验成功将组织工程学与分子生物学有机结合,经基因修饰的骨髓基质干细胞可使人转化生长因子β1持续高效发挥作用,并逐步转化为成熟的软骨细胞且分泌软骨基质,与藻酸钙复合修复骨软骨缺损效果满意.
作者：孙骏；侯筱魁；李旭；张如明 刊期： 2008年第29期
背景:细胞分化、细胞融合乃至克隆均需要应用分离细胞核的方法以获得大量有活性的细胞核,但是目前很难在数量和质量上同时达到较高的水准.目的:探索简单易行的分离细胞核的方法,为神经元细胞核移植、细胞拆合以及细胞核成分的研究提供大量完好有活性的细胞核.设计、时间及地点:对比实验,于2006-09/2007-01在南京医科大学基础医学院卫生部抗体技术重点实验室完成.材料:Cytochalasin B为Sigma公司提供,清洁级SD孕大鼠来源于南京医科大学动物实验中心.方法:取胎鼠大脑皮质,进行神经元的培养并鉴定.用Cytochalasia B结合梯度离心法及细胞核分离液法两种方法进行细胞核分离的对比观察.主要观察指标:用碘化丙啶标记后进行流式细胞仪检测凋亡率并用免疫荧光染色对细胞核进行形态学观察.结果:两种方法均成功地分离出大量有活性神经元细胞核,且梯度离心法可以得到较为完整的胞质体,与完整细胞细胞核荧光强度比较无显著性差异(P>0.05).结论:Cytochalasin B结合梯度离心法及细胞核分离液法均能够有效地进行神经元细胞核的分离,且细胞核在短期内有较高的活性.
作者：冯伟生；阮成钧；冯振卿；仇振宁；顾萍；张化彪 刊期： 2008年第29期
背景:有实验证实人和动物起源的胚胎干细胞或成体干细胞可分化为胰岛素分泌细胞,但其分泌胰岛索的功能及对实验性糖尿病的治疗价值尚需要验证.目的:观察从大鼠的胰腺组织分离纯化干细胞在体外将诱导分化胰岛素分泌细胞后胰岛素mRNA的表达、分泌胰岛素的能力及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用.设计:随机对照观察.单位:中日友好医院临床医学研究所.材料:实验于2004-08/2007-12在北京中日友好医院临床医学研究所病理生理研究室完成.选用8～10周龄雄性SD大鼠及雌性裸鼠各10只,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.尼克酰胺、链脲菌素均为Sigma公司产品,nestin抗体为BDBiosciences产品.大鼠胰岛素放射免疫检测试剂盒购自Linco research.胰岛索抗体及胰高糖素抗体为Santa Cruz产品.方法:应用nestin结合的免疫磁珠从SD大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞,经体外扩增及诱导分化形成胰岛素分泌细胞.①采用RT-PCR法检测细胞分化过程中胰岛素mRNA的表达.②将干细胞经诱导分化形成的胰岛进行冰冻切片,采用免疫荧光染色观察胰岛素及胰商糖索阳性细胞表达.③对干细胞分化胰岛的胰岛素释放功能进行评价,放射免疫法测定上清中胰岛素检测干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素的能力.④鼠按220 mg/kg链脲菌素腹腔注射法制备为1型糖尿病模型,造模后随机摸球分为天然胰岛组及干细胞胰岛组,每组5只.将大鼠天然胰岛(SD大鼠分离)及干细胞分化形成的胰岛分别移植于糖尿病裸鼠左肾包膜下,观察移植后鼠尾静脉血糖变化.主要观察指标:①细胞分化过程胰岛索mRNA表达.②胰岛样结构中胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达.③干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素情况.④移植后鼠尾静脉血糖变化.结果:①RT-PCR检测结果表明胰岛素mRNA的表达随诱导时间延长而明显升高.②免疫荧光染色结果显示胰岛结构的中间存在大量胰岛素阳性细胞,胰高糖素阳性细胞主要分布于胰岛样结构的周边.③干细胞分化的胰岛在高浓度葡萄糖刺激后明显缺乏快速相的胰岛索释放,而是表现细胞外上清中胰岛素浓度的缓慢升高.④天然胰岛组移植后3 d使血糖降低到10 mmol/L以下,至观察到60 d仍维持在正常水平:干细胞胰岛在移植后8 d使血糖降低至10 mmol/L以下,且在移植35 d后血糖逐渐升高并恢复到胰岛移植前的水平.结论:大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后可分化胰岛素分泌细胞,但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌.将胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病模型裸鼠后可一定程度地改善糖代谢的紊乱.
作者：蔡寒青；葛焕琦；门秀丽；许世清；娄晋宁 刊期： 2008年第29期
背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞.主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率.荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165 cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP.收获的病毒具有较高滴度和感染活性.
作者：黄向辉；时志斌；王坤正；党晓谦；杨佩；余鹏博 刊期： 2008年第29期
应用计算机检索Pubmed数据库1995-01/2008-01期间和CNKI、维普数据库2001-01/2008-01期间与组织工程心脏瓣膜种子细胞相关的44篇资料显示:临床应用的机械瓣和生物瓣存在一些缺点,而组织工程心脏瓣膜优点包括无需抗凝治疗、抗感染、有活力、具有生长和修复能力,具有很好的前景.组织工程心脏瓣膜种子细胞可来源于:血管、骨髓、血液、脐带、绒毛膜和胚胎干细胞等,这些细胞具有相应特异的细胞表型.并适合产生用作组织工程的细胞外基质.组织工程心脏瓣膜研究已经取得了相当大的进展和令人鼓舞的成绩,但有许多技术问题和临床实际问题尚待解决和克服.要想组织工程心脏瓣膜成功应用于临床,需要更深入的研究:比如可降解多聚物支架材料特性、干细胞分化、尽量发挥自体细胞功能、使用无创技术评价瓣膜生长和重构的速度及质量等,这样就会催生更新进的技术应用于体内安全性实验以及临床前期研究.
作者：邱雪峰；董念国 刊期： 2008年第29期
背景:目前研究证实全反式维甲酸在调控多种组织和细胞的增殖、生长发育、代谢以及维持内环境稳定等方面具有广泛生物学作用.目的:探讨全反式维甲酸诱导神经干细胞分化为神经元过程中的作用及其分子机制.设计、时间及地点:对照观察,体外细胞学实验,于2006-07/2007-06在上海同济大学附属医院实验室完成.材料:普通级孕13～14 d雌性SD大鼠6只,取胎鼠用于制备神经干细胞.诱导剂全反式维甲酸为Sigma公司产品.方法:取第3代神经干细胞,以2×108 L-1密度接种,分为全反式维甲酸诱导1 d,3 d,7d,10d组和空白对照组,各诱导组均加入1 μ mol/L全反式维甲酸,空白对照组仅加入等量生理盐水.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定结果,计数分化为神经元的比例,应用半定量RT-PCR法检测维甲酸受体α mRNA的表达.结果:全反式维甲酸诱导后神经元特异性烯醇化酶染色呈阳性,细胞有多个细长突起,胞体呈绿色荧光,胞核呈蓝色荧光.与空白对照组比较,诱导3 d,7 d,10 d组神经元特异性烯醇化酶染色阳性细胞率均明显升高(P<0.05),且诱导7 d组达峰值.与空白对照组比较,各诱导组维甲酸受体α mRNA的表达量均明显升高(P<0.01).结论:全反式维甲酸能显著提高大鼠胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,同时发现细胞维甲酸受体α mRNA的表达增加.
作者：王飞；潘庆刚；邓东风；刘宁涛；海舰；沈峰 刊期： 2008年第29期
背景:研究人骨髓间充质干细胞定向分化为多巴胺神经元及分化后细胞的功能特征,对细胞移植治疗包括帕金森病在内的神经精神性疾病具有重要临床意义.目的:采用脑源性神经营养因子、forskolin及多巴胺联合诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元定向分化,观察诱导产生的多巴胺神经元的结构和功能.设计:随机对照观察.单位:郑州大学及河南大学.材料:实验于2005-03/2006-09在郑州大学和河南大学实验室完成.实验用骨髓取自15名健康志愿者.脑源性神经营养因子、多巴胺、forskolin及单克隆抗体酪氨酸羟化酶为美国Sigma公司产品.方法:①通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化骨髓间充质干细胞.采用50 μmol/L 脑源性神经营养因子,10 μ mol/Lforskolin和10 μmol/L多巴胺联合对骨髓间充质干细胞进行诱导.②诱导2周后应用电子显微镜观察细胞超微结构;免疫细胞化学染色检测神经元烯醇化酶(NSE)和酪氨酸羟化酶(TH)的表达:采用RT-PCR检测多巴胺神经元分化过程中转录因子Nmr1,Ptx3,Lam1b及酪氨酸羟化酶mRNA表达;同时以未诱导的细胞为对照,应用高效液相色谱检测细胞多巴胺的释放水平.主要观察指标:①细胞超微结构.②NAE和TH的表达变化.③细胞内关键转录因子及酪氨酸羟化酶mRNA变化.④细胞释放多巴胺情况.结果:①细胞超微结构:诱导2周后细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体以及神经微丝的形成.②NSE和TH表达的变化:免疫细胞化学染色结果表明诱导分化后NSE和TH阳性细胞的表达随诱导时间的延长逐渐增高(P<0.001).③细胞内酪氨酸羟化酶及关键转录因子变化:RT-PCR结果显示细胞均可表达Nurr1,Ptx3,Lmx1b和酪氨酸羟化酶的mRNA.④细胞释放多巴胺情况:诱导2周后的细胞多巴胺释放水平高于未经诱导的细胞,差异有统计学意义(P<0.05).结论:脑源性神经营养因子、forskolin及多巴胺可在体外诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺神经元分化,并具有多巴胺神经元的结构和功能特征.
作者：柴立辉；吴素霞；陈宗德；曹孟德；马远方 刊期： 2008年第29期
背景:将大量的神经干细胞定向诱导分化后的神经细胞能否与其他神经细胞建立功能联系是目前解决神经干细胞应用于临床的重要问题之一.目的:观察神经生长因子对体外培养的神经干细胞生长和分化的影响,以及神经生长因子对神经轴突形成和生长的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-12在中国医科大学设备处完成.材料:清洁级二三天龄新生SD雄性大鼠3只,神经生长因子为peprmech公司产品.方法:酶消化和机械分离法相结合体外分离培养新生鼠神经干细胞,传至第4代的细胞克隆团行巢蛋白免疫细胞化学染色观察,剩余细胞团用机械法分散,采用有限稀释法进行单克隆神经干细胞培养.加入完全培养基制成108L-1的单细胞悬液,分为2组滴入培养板,对照组加入10%FBS,诱导组加入10%FBS+50 μg/L神经生长因子,培养5-7 d.连续观察5个神经元特异烯醇化酶染色阳性且未与其他神经元发生连接的孤立神经元,求助于以神经元为圆心的同心圆,分别计数内径为37.5 μ m和75 μm圆环内的突触数量,特两者均值视为神经元轴突数量,通过此同心圆测量长轴突的长度.主要观察指标:通过巢蛋白、神经元特异烯醇化酶、胶质原纤维酸性蚩白免疫组化染色对培养细胞进行鉴定.检测神经元数量及轴突数量、长度.结果:所培养出的细胞团均为巢蛋白阳性,诱导分化后均可产生神经元特异烯醇化酶、胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞.诱导分化第6天,诱导组神经元数量、单个神经元轴突数量、长轴突长度均明显高于对照组0=3.301,2.982,4.012,P均<0.01).结论:神经生长因子可促进神经干细胞向神经元的分化,还可以增加由神经干细胞分化而来的神经元突起数量及长度.
作者：乌优图；王运杰 刊期： 2008年第29期
目的:有研究表明,针刺足三里穴能够提高衰老机体的免疫系统功能,关于足三里穴适宜的针刺深度及对健康机体影响的研究较少.实验观察不同深度针刺足三里穴对健康大鼠免疫功能的影响.方法:实验于2006-09/10在北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室完成.实验选用健康清洁级雄性Wistar大鼠24只,按随机数字表法分为3组:空白组、皮下组、肌肉组,每组8只.皮F组将毫针沿15.角斜向上平刺入足三里穴皮下,肌肉组将毫针直刺入足三里穴肌肉层,留针20 min,1次/d,共14次,空白组不做针刺处理.测定针刺前后各组大鼠体质量的变化、大鼠胸腺指数、脾脏淋巴细胞增殖能力及外周血细胞计数等变化.结果:针刺作用后,肌肉组大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力均较空白组明显升高(P<0.05),皮下组和空白组大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力无统计学差异(P>0.05).肌肉组与皮下组大鼠白细胞总数、红细胞计数、血红蛋白含量及血小板总数与空白组比较,差异均不显著(P>0.05).针刺一二周后,肌肉组与皮下组大鼠体重质量均明显低于空白组(P<0.01).结论:肌肉层深层针刺足三里穴可提高健康大鼠胸腺指数及淋巴细胞增殖能力,增强大鼠机体免疫能力,同时对于机体外周血细胞无明显影响.
作者：田阳春；郑玲；袁英；石玥 刊期： 2008年第29期
背景:骨髓间充质干细胞可定向诱导为软骨细胞.目的:建立二维培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导体系,分析转化生长因子β 1作为诱导条件的佳浓度,以及诱导骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的相关影响因素,观察细胞诱导后的细胞形态及表型变化.设计:随机对照动物实验.单位:贵阳医学院动物实验中心.材料:实验于2005-09/2006-11在贵阳医学院动物实验中心完成.4周龄雄性SD大鼠24只由贵阳医学院动物中心提供,体质量(98.23±7.97)g,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:取SD大鼠的股骨及胫骨,采用贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞行流式细胞术检测鉴定其表面抗原,分别以含1,5,10,15,20 μ g/L 的转化生长因子β 1的诱导培养基在二维培养条件下对第4代骨髓间充质干细胞诱导培养,对照组加入阴性诱导培养基.2周后采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测,采用二甲基亚甲蓝比色法定量检测诱导后细胞外基质糖胺多糖的表达.主要观察指标:各组细胞表面抗原检测、Ⅱ型胶原定性检测及细胞外基质糖胺多糖表达检测.结果:贴壁培养法可分离并纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞,所得第4代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44阳性,CD34、CD45阴性.经诱导培养2周后细胞形态变为不规则,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示,15,10,15,20 μg/L 转化生长因子β1组可见阳性细胞,二甲基亚甲蓝比色法检测显示各实验组细胞外基质糖胺多糖含量均明显高于对照组(P<0.01).10 μg/L 转化生长因子β 1组细胞分泌的细胞外基质糖胺多糖明显多于其它剂量组(P<0.01),并且细胞分泌细胞外基质糖胺多糖的能力与细胞密度呈正相关(r=0.822,P<0.01).结论:10 μg/L转化生长因子β 1存在的二维培养条件下,较高的细胞密度有利于骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化.
作者：彭吾训；王蕾；邓进；李鹏 刊期： 2008年第29期
脂肪间充质干细胞具有较强的体外增殖能力,因存在生物学特性稳定、来源充足、体外培养条件低等优势已引起各国学者的关注.在一定条件下,可成功地将其诱导为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪前体细胞、心肌细胞、神经样细胞.现阶段尚未找到脂肪间充质干细胞的特异性分子标记,对其多向分化潜能判定的公认方法是观察检测分化所得细胞的形态学变化及表面标记物的表达,基本未涉及细胞特异性功能分析.脂肪间充质干细胞凭借其多向分化潜能,是人体干细胞库潜存的重要来源,可作为多种组织工程种子细胞应用于组织缺损的修复,但多向分化潜能的科学性、重复性及安全性等问题均有待深入分析.
作者：房林；宋维铭 刊期： 2008年第29期
背景:动物实验已经证实,来源于骨髓或外周血干细胞能够在血管损伤部位分化形成新生血管,进而改善肢体血液供应.目的:观察自体骨髓干细胞移植治疗慢性下肢缺血的临床疗效.设计、时间及地点:自身对照加非随机对照的双盲试验,于2004-09/2007-09在山东大学附属省立医院血管外科及科研中心完成.对象:受试对象为下肢血管缺血性病变失去外科手术或介入治疗适应症,并愿意接受自体干细胞移植的患者60例,男36例,女24例,年龄33～83岁,平均65岁.方法:实验采用干细胞分离液,利用梯度密度法分离患者自体骨髓干细胞,制备干细胞悬液.根据缺血范围选取缺血肢体肌肉多点穿刺注射.主要观察指标:以治疗后6个月患者下肢疼痛症状、行走能力、皮肤溃疡、踝肱指数、足坏疽评分的变化来评价临床疗效.结果:治疗后6个月,患肢疼痛、麻木感和冷感觉改善率为78.33%,47例患者静息痛消失或明显减轻,5例患者跛行距离由不足50 m提高到大于100 m.10例伴有溃疡的患者,溃疡愈合或面积逐渐减小.11例踝肱指数增加大于0.1,4例足趾坏疽患者中1例症状明显缓解,静息痛消失,行坏疽足趾切除,愈合良好;2例疼痛消失,睡眠改善,坏疽组织有脱落迹象:1例于膝下截肢.结论:自体骨髓干细胞移植对肢体疼痛、冷感、麻木疗效确切,对创面愈合有促进作用.
作者：吕晓霞；尹至；金星；吴学君；侯向前；宋颖博；李建峰 刊期： 2008年第29期
背景:通过直接转入基因可强化调控骨髓间充质干细胞特异性分化.所以,有效的基因转染技术是髓间充质干细胞可以在组织工程中使用的关键.目的:选择Nucleofector TM技术转染大鼠骨髓间充质干细胞的优化转染方案,为高效体外转染大鼠髓间充质干细胞提供一个新方法.设计、时间及地点:对比观察细胞基因工程实验,于2007-10/12在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠,三四周龄,清洁级,体质量60～70 g.实验过程:采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,采用全骨髓法+神经干细胞培养基获得巢蛋白阳性细胞.运用NucleofectorTM技术的A33及A31程序,分别用1,5,10 μ g重组质粒pEGFP-C1转染骨髓间充质干细胞及巢蛋白阳性细胞,并将转染后的细胞分别培养在含体积分数为0.10及体积分数为0.20胎牛血清的培养基中.主要观察指标:①通过Leica DMIRE荧光显微镜F观察和计数表达绿色荧光的细胞计数转染率.②台盼蓝排斥实验检测细胞活力.③用RT-PCR法分析胰腺十二指肠同源基因1基因在转染细胞中的表达.结果:应用NucleofectorTM技术的A33程序转染神经干细胞较转染骨髓间充质干细胞的转染率高,并优于A31程序.转染后在含体积分数为0.20胎牛血清中培养的细胞24 h转染率及存活率均显著高于在含体积分数为0.10胎牛血清培养的细胞(P<0.05).RT-PCR检测转染重组质粒的巢蛋白阳性细胞中可见胰腺十二指肠同源基因1的mRNA表达,未转染胰腺十二指肠同源基因1的巢蛋白阳性细胞无胰腺十二指肠同源基因1的mRNA表达.结论:运用Nucleofector TM技术的A33程序以5 μ g的DNA转染骨髓来源的巢蛋白阳性细胞,转染后的细胞接种于含体积分数为0.20胎牛血清的培养基中可获得较高的转染效率及较高的存活率.
作者：王海澜；蒋泽生；李爱辉；潘明新；高毅 刊期： 2008年第29期
背景:骨髓间充质干细胞在一定条件下可分化成为多种结缔组织细胞,也可分化成神经系统的神经元和神经胶质细胞.目的:观察采用免疫磁珠法分离成人骨髓来源神经干细胞的生物学特征.设计、时间及地点:以患者自身骨髓组织为观察对象的实验,于2003-03/2007-06在菏泽市立医院检验科完成.材料:骨髓组织来自菏泽市立医院神经内科住院的中风、老年性痴呆、帕金森病、脑缺血等神经系统疾病患者.方法:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合,在磁场作用下使结合磁珠与其他细胞分离,从而获得神经干细胞,再将所分离的纯化神经干细胞接种到含体积分数为0.20胎牛血清的Eagles MEM培养液,再在培养基中加入碱性成纤维因子和表皮生长因子进行原代培养.主要观察指标:采用免疫组织化学染色与免疫荧光染色鉴定细胞,并采用流式细胞术测定细胞DNA含量.结果:在相差显微镜下观察培养的神经干细胞,细胞形态丰满,胞核及核仁清晰可见,神经突起粗大,网络稠密.免疫组织化学和免疫荧光染色显示,细胞神经元特异性烯醇化酶、神经蛋白、胶质纤维酸性蛋白酶、微管相关蛋白为阳性.传代后的细胞用流式细胞术测定DNA含量为正常二倍体,无诱发突变.结论:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合方法从成人骨髓分离出神经干细胞,在神经化学和形态上已具备神经细胞的特征.
作者：李善玉 刊期： 2008年第29期
背景:核基质附着区是染色质被限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列,不仅可影响邻近内源基因的表达,还能克服转基因沉默,提高外源基因的转录与表达.目的:探讨在CHO细胞中β-干扰素核基质附着区对氯霉素乙酰转移酶转基因表达的影响.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2007-04在新乡医学院生物化学与分子生物学实验室及分子研究室完成.材料:CHO细胞株由中国典型培养物保藏中心提供.含氯霉素乙酰转移酶报告基因及G418筛选标记的质粒pCATG载体由本实验室构建.方法:将PCR扩增得到的人β-干扰素核基质附着区分别用Sac I/Kpn I及BamHI/SalI酶切,连接至用相应内切酶酶切的pCATG载体上,转化E.coliJM109,提取质粒行酶切电泳,将构建好的载体命名为pCAT-MAR,该载体含氯霉素乙酰转移酶报告基因表达盒及两侧的β-干扰素核基质附着区.分别用载体pCATG及pCAT-MAR转化CHO细胞,提取具有G418抗性的细胞株基因组DNA,PCR扩增氯霉素乙酰转移酶基因.主要观察指标:ELISA法分析氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达.PCR法检测pCAT-MAR载体是否稳定整合在宿主基因组上.结果:①pCATG转化的CHO细胞共筛选出16个阳性细胞株,pCAT-MAR转化的CHO细胞筛选出17个阳性细胞株.β-干扰素核基质附着区可使氯霉素乙酰转移酶报告基因表达水平提高2.8倍,pCATG转化CHO细胞的变异系数为2.065 0,PCAT-MAR转化CHO细胞的变异系数仅为0.8131.②稳定转化的细胞株基因组DNA均扩增出437 bp目的片段,证明pCAT-MAR载体已经稳定整合到基因组上.结论:β-干扰素核基质附着区能提高转基因在CHO细胞的表达水平,并且可降低不同转化细胞株之间转基因表达的差异性.
作者：昝玉玺；王天云；张俊河；王俐 刊期： 2008年第29期
背景:目前尚缺乏关于人胚胎心脏来源间充质干细胞各代在体外生物学特征的报道.目的:以不同培养方法获取人胚胎心脏来源的间充质干细胞,并观察其生物学特征,筛选适合作为心肌修复细胞源的传代次数.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成.材料:流产人胚胎10例,均来自南京大学医学院附属鼓楼医院,经产妇及家属知情同意,实验获得医学伦理委员会批准.方法:取心脏组织,剪为约1 mm的碎块,胶原酶消化过筛.获得单细胞悬液采用细胞培养法,向细胞悬液中添加10%FBS的DMEM/F12培养基;消化后的残余组织采取组织块培养法,放于培养板中,于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中放置1.5 h后,添加10%FBS的DMEM/F12培养基.两种方法均采取直接贴壁方式获取贴壁细胞,常规传代.主要观察指标:倒置显微镜观察心脏组织来源各代细胞的形态特征;流式细胞仪检测各代细胞表面标志,分析细胞周期.结果:细胞培养与组织块培养至P3代后,细胞形态相似且均呈梭形.细胞培养的P3和P4代以及组织块培养的细胞群中CD29和CD44阳性比例较高,而c-Kit、CD31、CD45、GATA-4和c-Tnt均呈阴性;细胞培养的P2和P3代细胞群间充质干细胞的比例大,组织块培养的细胞中P3代细胞群间充质干细胞的比例大;且P2-P4代细胞状态较好,当传至P7代时细胞生长速度开始减慢.原代～P5代细胞绝大部分处于静息状态.但保留自我更生的潜能,符合干细胞特性.结论:利用细胞培养法或组织块培养法都可以成功获得人胚胎心脏来源间充质干细胞,P3代细胞更适合于心脏修复的细胞移植治疗.
作者：泥艳红；凌丽珍；胡娅莉；蒋文群；叶鸿苹；黄亚红；侯亚义 刊期： 2008年第29期
应用计算机检索Pubmed数据库1999-01/2008-01期间及万方数据库、维普数据库2001-01/2008-01期间与胚胎干细胞分化的调控因子相关的44篇文章显示:胚胎干细胞分化的调控是一个极其复杂的过程,是由多个因素组成的一个庞大的维持胚胎干细胞自我更新能力的调控网络,其中特异分子和各种转录因子的终表达量是决定胚胎干细胞是否分化的关键因素.当各种因子分泌量达到相互平衡状态时,胚胎干细胞维持自我更新,但是如果其中一个或几个因子的表达量发生改变时.就会促使胚胎干细胞向某一特定方向分化.目前研究主要集中在八聚体结合蛋白4、Nanog、SOX基因、白血病抑制因子等几条既平行又相互交错的通路所决定胚胎干细胞的自我更新.
作者：朱向情；陈强；丁亚楠；马丹；潘兴华 刊期： 2008年第29期
背景:转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1是肺纤维化形成过程中的重要细胞因子,已证实骨髓间充质干细胞可降低损伤肺组织中的胶原含量,减轻肺纤维化.目的:观察骨髓间充质干细胞对肺损伤大鼠转化生长因子β及单核细胞趋化蛋白1的影响.设计、时间及地点:随机对照,细胞学体外实验,于2005-05/2006-02在解放军第四军医大学完成.材料:清洁级雌性SD大鼠20只,随机分为正常对照组、细胞对照组、肺损伤组、细胞移植组,5只/组.雄性SD大鼠5只用于骨髓间充质干细胞的采集.方法:肺损伤组、细胞移植组大鼠经气管注入5 mg/kg博来霉素0.2～0.3 mL诱发建立肺损伤模型.造模后12 h,细胞移植组、细胞对照组大鼠经尾静脉注入骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL,约5×106个细胞;肺损伤组、正常对照组大鼠同法注入无血清DMEM-F12 0.5 mL.主要观察指标:苏木精-伊红染色观察肺组织形态学变化.酸解法测定肺组织羟脯氨酸含量.ELISA法检测血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达.结果:细胞移植2周后,正常对照组及细胞对照组的肺泡腔均匀完整;肺损伤组的肺泡结构破坏,肺泡间隔增厚,间质增生;细胞移植组肺损伤程度明显减轻.与正常对照组比较,肺损伤组、细胞移植组的肺组织羟脯氨酸含量均显著升高(P<0.01或0.05),细胞移植组升高幅度明显低于肺损伤组(P<0.01).各组大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达水平与肺组织羟脯氨酸含鼍基本相似.结论:骨髓间充质干细胞可减少肺损伤大鼠肺组织羟脯氨酸含量,减轻大鼠肺损伤及纤维化程度,可能与降低转化生长因子β、单核细胞趋化蛋白1的表达有关.
作者：赵峰；李圣青；遆新宇；宋立强；李志奎；吴昌归；戚好文 刊期： 2008年第29期
中国组织工程研究杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
