张益；芜为；王佶；申辛欣；何小周；杨梦婕；马学军
目的 阐明不明原因发热(fever of unknown origin,FUO)的血液样本中用常规方法难以检测到的潜在病原.方法 利用二代测序技术序列非依赖的特性对病原核酸进行随机捕获,随后采用多重链置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)方法进行富集.在得到测序结果后,进行宏基因组数据分析,构建进化树,终实现对未知病原的鉴定.结果 对10份不明原因发热的血液样本进行宏基因组二代测序分析时未发现引起发热的常见病原体序列,但发现了大量人细环病毒(Torque teno Virus,TTV)存在的现象.将所有相关测序读长进行组装拼接,并计算得到的一致性序列在匹配的参考序列上的基因组覆盖度.在对组装出的置信序列进行进化分析后,发现其分属于αTTV、β TTV和γ TTV三个属.结论 对本研究中发现的TTV的基因组特征、进化特征以及作为免疫水平评估的意义进行了分析.而对于本研究中只检测出三个属的TTV的现象,可能是因为TTV具有潜在的病原性以及感染性疾病所导致的宿主免疫水平低下,也有可能是由于其他非感染性病因导致的宿主免疫水平降低所导致.
作者：张益；芜为；王佶；申辛欣；何小周；杨梦婕；马学军 刊期： 2018年第02期
目的 了解新型腺病毒55型(HAdV-55)在中国的流行状况和基因变异及进化规律,为其预防和控制提供科学依据.方法 本研究对2011-2014年在中国5个省市(北京、河北、山东、湖南和云南)发热呼吸道症候群患者标本中分离到的HAdV-55毒株进行了hexon、fiber和penton base 三个基因的序列测定,同时下载GenBank数据库中中国以及全球其他国家和地区、不同时间流行的HAdV-55病毒株的三个基因的序列进行比对,并利用多种序列分析软件进行了同源性和基因进化分析.结果 2006-2016年10年期间,在中国的15个省(市、自治区和直辖市)分离到HAdV-55病毒.进化分析结果显示,HAdV-55的三个主要结构基因均高度保守,其核苷酸和氨基酸序列同源性均大于99％;HAdV-55病毒在进化上是极为保守稳定,在进化树上聚集在一个分支,并有一定的时间聚集进化趋势.HAdV-55的hexon和fiber基因进化速率分为5.228×10-5和1.238×10-4substitutions/site/year,hexon基因的早共同进化祖先tMRCA可追溯到1963年.结论 HAdV-55已经在中国形成了广泛传播和持续流行态势,建立有效的监测系统和开展疫苗相关研究对于其预防和控制至关重要.
作者：毛乃颖；朱贞；雷振强；李岩；黄芳；尹洁；陈萌；向星宇；李红；唐浏英；崔爱利；李忠；刘倜；许文波 刊期： 2018年第02期
目的 评价狂犬病病毒抗体胶体金(colloidal gold,CG)检测试剂的实际效能.方法 采用狂犬病病毒抗体CG检测试剂和快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测狂犬病免疫球蛋白系列稀释品和狂犬病疫苗免疫人群血清样品,比较2种方法检测狂犬病病毒抗体定性结果的一致性,率的比较采用四格表卡方检验.结果 对狂犬病免疫球蛋白稀释品,狂犬病病毒抗体CG检测试剂的检出限高于6.53 IU/ml而低于9.53 IU/ml;对血清样品,狂犬病病毒抗体CG检测试剂的检出限高于2.80 IU/ml而低于3.30 IU/ml.CG和RFFIT检测血清狂犬病病毒抗体的阳性率分别是26％和67％,差异具有统计学意义(x2=13.66,P=0.000).以RFFIT检测结果为金标准,狂犬病病毒抗体CG检测试剂在实际检测中存在假阴性结果,但是不存在假阳性结果.结论 狂犬病病毒抗体CG检测试剂灵敏性差,实际应用时应注意漏检现象.
作者：吕书玉；赵方红；张苗苗；刘宏乾 刊期： 2018年第02期
目的 通过对浙南地区无偿献血者血清学和核酸筛查数据的回顾性分析,探讨核酸检测(Nucleic acid test,NAT)在降低输血相关传染性疾病中的作用.方法 选取2016年1月至2016年12月浙南地区无偿献血人员179 369人次,用酶联免疫吸附试验(ELISA)对血液传染性指标乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、人类免疫缺陷病毒抗原和抗体进行检测,同时采用罗氏、浩源核酸检测系统对HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA进行6或8人份混样三项目联合检测,统计分析血清学三项无反应性标本核酸检测(NAT)结果.结果 共检出259例ELISA-/NAT+样本,其中HBV-DNA+ 255例,HCV-RNA+5例,1例HBV-DNA重HCV-RNA+,阳性率为0.14％;罗氏核酸检测分析系统混检阳性率为1.40％,拆分阳性率为60.72％;浩源核酸检测分析系统混检阳性率为1.63％,拆分阳性率为41.67％.结论 核酸检测能弥补血清学检测的不足,有效降低输血相关传染性疾病的漏检,保障了地区的血液安全.
作者：黄国永；张锋；林碧；蔡淑锋；朱紫苗；刘燕飞；叶峥嵘 刊期： 2018年第02期
目的 探究PegIFN治疗的CHB患者不同应答组用药前差异表达microRNAs,并分析其相应靶基因与HBsAg清除之间的关系.方法 建立PegIFN治疗研究队列,运用高通量芯片获得PegIFN用药前不同应答组之间差异表达microRNAs,运用实时荧光定量PCR的方法进行验证,生物信息学分析差异microRNAs的靶基因及信号通路.结果 芯片结果显示417条microRNAs在PegIFN的不同应答组之间差异表达,其中上调表达有342条,下调表达有75条,实时荧光定量PCR验证出miR-3960,miR-126-3p,miR-23 a-3p和miR-335-5p在HBsAg清除组下调.生物信息学分析,差异microRNAs的靶向基因相关的信号通路有:AMPK信号通路、NOD样受体信号通路、NF-kappa B信号通路、mTOR通路等.结论 差异microRNAs可能通过调控免疫相关的基因表达,增强HBV清除相关的免疫应答,促进HBsAg清除.
作者：杨艳琳；刘明；邓樱；郭艳；张绪清；向德栋；蒋黎；游忠岚；伍艺；李茂仕；毛青 刊期： 2018年第02期
目的 观察对比流感病毒唾液酸a2,3-半乳糖(SAa2,3-gal)和唾液酸a2,6-半乳糖(SAa2,6-gal)受体在哮喘小鼠气道组织中的分布和表达以及地塞米松干预对其表达的影响.方法 30只BALB/c小鼠被随机分成正常组(N组)、哮喘组(A组)和地塞米松干预组(D组).A组小鼠以卵蛋白(OVA)致敏后激发建立哮喘模型,D组激发前腹腔注射地塞米松,余同A组.行BALF细胞计数,ELISA测定BALF中IL-5浓度,HE染色观察肺组织病理学改变及气道炎症评分,AB-PAS染色观察黏液分泌,免疫组化法(IHC)观察肺组织Muc5ac蛋白表达,免疫荧光法观察各组小鼠气道组织中唾液酸受体分布和表达的差异.结果 A组小鼠BALF嗜酸性粒细胞数、IL-5浓度、气道炎症评分、气道黏液分泌较N组小鼠均升高,而D组小鼠上述指标较A组降低.SAa2,3-gal和SAa2,6-gal受体在各组气道组织中均有表达.SAa2,3-gal受体在哮喘组气道上皮细胞表达的平均阳性率较N组升高,SAa2,3-gal和SAa2,6-gal受体在D组气道上皮细胞分布和表达的平均阳性率均较N组和A组升高(P＜0.05).结论哮喘组小鼠气道上皮SAa2,3-gal受体的表达增强;地塞米松上调SAa2,3-gal和SAa2,6-gal受体的表达.两者可能是哮喘患者对流感病毒易感性增强的原因之一.
作者：周亮；张建勇；张泓；陈玲；王莉 刊期： 2018年第02期
目的 了解门诊和住院儿童急性呼吸道感染病例中呼吸道病毒和肺炎支原体、衣原体的流行特征,为防控急性呼吸道感染、指导临床用药奠定基础.方法 采集2011-2013年杭州某儿童医院呼吸道门诊病例咽拭子、住院病例气管吸取物.采用实时荧光PCR方法,对收集到的样本进行呼吸道病毒和肺炎支原体、衣原体的核酸检测.结果 本研究908例病例中,610例检出至少1种病原体,总的病原体检出率为67.2％(610/908),住院患儿检出率(76.7％)显著高于门诊患儿(43.0％)(x2=94.79,P＜0.001).206例检出2种或2种以上病原体,住院患儿合并感染率(29.0％)高于门诊患儿(6.6％)(x2 =52.34,P＜0.001).呼吸道合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、流感病毒、博卡病毒、腺病毒、saffold心肌炎病毒及肺炎支原体、衣原体在两组病例间检出率的差异均有统计学意义.住院病例中,检出率高的是呼吸道合胞病毒(34.5％),其次是肺炎支原体(15.0％)、鼻病毒(14.6％);门诊病例中,检出率高的是腺病毒(15.2％),其次是流感病毒(11.7％)、副流感病毒(7.8％).住院病例中除了呼吸道合胞病毒和流感病毒外,其他病原合并感染率均大于其单一感染率.腺病毒在门诊和住院病例中的合并感染率差异具有统计学意义(x2=18.90,P＜0.001).未发现住院病例单一感染与合并感染临床特征的显著性差异.结论 住院病例呼吸道病原体的检出率较门诊病例高,多种病原体合并感染在住院病例中较常见,提示合并感染和疾病的严重程度有一定相关性.
作者：于新芬；寇宇；周银燕；李钧；钱昕；杨旭辉；潘劲草 刊期： 2018年第02期
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所的各实验室自行研究建立了一系列实验方法,这些方法相比国标方法,行标方法等具有独特的优势,如何让这些方法通过一定法律程序成为公共产品,以便更广泛的为疾病预防控制服务,是作为国家级病毒学实验室义不容辞的任务.本文通过对“RT-RAA法检测EV71/ CA16等病毒”方法的实证研究,探索基于实验室资质认定条件下病毒学非标方法建立、确认、验证、核查等一系列问题.
作者：李洁；何小周；杨梦婕；马学军；武桂珍 刊期： 2018年第02期
隐匿性乙肝病毒感染(Occult hepatitis B infection,OBI)患者中病毒DNA水平极低,血清中难以检测到常规血清学标志物,即乙肝表面抗原(HBsAg),对临床诊治和输血安全带来了挑战.其相关机制和临床意义越来越受到关注.OBI发生机制复杂,可能涉及宿主因素、病毒本身的因素以及其他病毒或非病毒因素.OBI存在传播HBV的风险,可被重新激活并会导致肝脏疾病加重.
作者：李伟；武文；黄象艳 刊期： 2018年第02期
Oxford Nanopore Technologies (ONT)公司开发出了商业化的纳米孔测序仪—MinION.相对于二代测序技术平台,MinION的主要特点是读长长、简单快速、便携性高且可以实时分析测序数据.各国的研究人员也已经逐步将MinION应用于病毒检测、病毒全基因组测序、新病毒的发现、病毒准种与进化研究等领域.本文回顾了近几年纳米孔测序技术在病毒基因组研究中的应用,讨论了病毒基因组测序目前存在的问题,并展望了纳米孔测序技术未来的发展前景.
作者：王佶；马学军 刊期： 2018年第02期
从基础研究、关键技术与产品开发及典型应用示范三个层面阐述了我国在新发突发病原体及其传染病防控等方面所取得的新科技进展,并对未来科技发展方向进行了展望.
作者：陈洁君 刊期： 2018年第02期
目的 建立非洲地区较为高发的7种重要病毒病基于荧光微球的多重核酸检测方法完成初步的评价分析.方法 比较分析引起裂谷热、黄热,马尔堡,埃博拉、拉沙热、克里米亚-刚果出血热和基孔肯雅热等病原体的基因组序列,结合前期实时荧光PCR检测方法,设计合成特异性多重扩增引物和杂交探针,建立基于荧光微球的核酸检测方法,采用化学合成DNA和体外转录RNA等方法制备相关病原体模拟样本和参考品,评价检测方法的灵敏度和稳定性,利用30份登革热、汉城出血热等疑似患者标本和32份正常人血标本评价特异性.结果 所建立的基于荧光微球的针对7种非洲多发病毒病核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸,检测限可达102 ～105拷贝/μl,特异性为100％,组内变异系数均在12％以下,组间变异系数在15％以下,具有较高的稳定性.结论 初步建立了基于荧光微球的7种非洲多发病毒病核酸检测方法,为相关疑似传染病筛查提供了新的选择.
作者：闫芳域；殷强玲；李阿茜；芜为；李川；梁米芳；李德新；李建东 刊期： 2018年第02期
目的 为研究P[6]基因型轮状病毒受体结合特性,利用原核表达纯化得到P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株的VP8*核心区蛋白.方法 将P[6]基因型毒株LL4 260株的质粒利用PCR扩增得到核心区基因片段,克隆到pET30a载体中构建重组质粒pET30a-LL4260VP8+ core,重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达,经亲和层析和分子筛层析纯化表达后得到目的蛋白.结果 P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株核心区pET30 a-LL4260VP8* core蛋白为可溶表达,经纯化及电泳鉴定,得到相对分子质量为22×103的目的蛋白.结论 本研究构建的P[6]基因型轮状病毒LL4260毒株pET30 a-LL4260VP8* core重组质粒,表达纯化了相应核心区目的蛋白,为进一步分析蛋白的性能和结构提供基础.
作者：王璐瑶；李丹地；孙晓曼；章青；王宏；庞立丽；胡继宏；段招军 刊期： 2018年第02期
目的 通过原核系统表达纯化嵌合肠道病毒71型(EV71)中和表位SP70的病毒样颗粒(VLPs),作为备选的EV71基因重组亚单位疫苗.方法 将SP70插入乙肝病毒核心抗原(HBcAg)截短序列的主要免疫显性区域,合成融合蛋白基因后连接表达质粒转化入大肠埃希菌诱导表达,经DEAE离子交换层析、CsCl垫层离心以及密度梯度离心后得到纯化的重组VLPs,并通过Western Blot和ELISA实验鉴定其抗原性.结果 成功构建重组质粒pHBc-SP70,在大肠埃希菌中经IPTG低温诱导后高效表达,可溶性目的蛋白经离子交换层析、CsCl垫层离心和密度梯度离心三步纯化后纯度可达90％以上;纯化的融合蛋白可自发折叠组装为病毒样空心颗粒,与抗SP70单克隆抗体和抗HBc单克隆抗体均可特异性结合.结论 在原核系统中成功高效表达和纯化了表面展示EV71中和表位的嵌合HBc-SP70 VLPs,并证实其具有良好的抗原性,为该EV71基因重组疫苗的免疫效果评价奠定了基础.
作者：梁璞；伊瑶；苏秋东；毕胜利 刊期： 2018年第02期
目的 检测痘苗病毒早期、晚期蛋白表达水平,对复制缺陷型痘苗病毒天坛株(NTV)复制缺陷机制进行初步探究.方法 构建原核表达载体表达并纯化与痘苗病毒复制密切相关的早蛋白E3和晚期蛋白F17,免疫小鼠制备相应鼠多抗血清,用其对NTV病毒在非允许细胞中相应蛋白的表达水平进行检测.结果 在大肠埃希菌中分别表达、纯化了痘苗病毒E3和F17蛋白,并制备获得了相应的鼠多抗血清;Western blot鉴定在非允许细胞Hela中复制缺陷型痘苗病毒NTV的早期蛋白E3及晚期蛋白A27能正常表达,但晚期蛋白F17表达受到明显抑制.结论 F17蛋白表达受限可能是NTV复制缺陷的机制之一.
作者：黄盼盼；赵莉；任皎；赵颖；阮力；谭文杰；田厚文 刊期： 2018年第02期
目的 建立一种适用于不同浓度乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)的全基因组高通量测序方法.方法 分别采用HBV病毒核酸直接建库方法及巢式PCR扩增建库方法,对含高、中、低HBV拷贝的3个血浆样本进行文库构建.通过Illumina Miseq平台对HBV全基因组进行高通量测序.结果 基于两种不同建库方法获得数据产量差异巨大.HBV病毒核酸直接建库方法只有很少数据可以匹配到HBV基因组.巢式PCR扩增能够成功扩增出HBV全基因组,文库经高通量测序后,HBV基因组匹配率接近80％,且样本覆盖度和深度不受HBV浓度影响.3个不同浓度HBV样本共发现27个宿主内单核苷酸突变(intra-host single nucleotide variations,iSNVs),其中13个是低频突变.逆转录(reverse transcription,RT)区域的突变出现在低拷贝数和中等拷贝数样品中,而在高拷贝数样品中没有发现.结论 本研究建立的巢式PCR扩增结合高通量测序对HBV全基因组测序的方法,不仅可以快速准确的检测HBV感染,还可以发现低拷贝样品中整个HBV基因组的突变.
作者：王贤军；刘云惠；孟飞；杨宁敏 刊期： 2018年第02期
目的 分析3株甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)流行株全基因组和准种序列特征.方法 收集某地3例急性期甲肝患者血清标本,经病毒核酸提取、逆转录、分段巢式PCR,获得HAV近全长序列,并对全长VP1-2 A区进行克隆测序.结果 VP1-2 A连接区分型结果表明3株HAV均属于IA亚型,3株序列在此区核苷酸和氨基酸同源性为100％;全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9％ ～ 100％和100％,与GenBank中日本AH2株同源性高(核苷酸、氨基酸同源性为98.5％和99.7％);在已发表的抗原中和位点处未出现氨基酸变异.每株流行株全长VP1-2 A区克隆序列内、以及所有克隆序列间,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0％ ～ 100％、98.1％～100％和99.0％～100％、97.2％ ～ 100％,VP1-2 A连接区的核苷酸和氨基酸变异率高于部分VP1区.结论 3株流行株VP1-2 A连接区分型序列一致,全长基因组及准种序列间核苷酸、氨基酸序列同源性较高,推测可能为同源感染.本研究为甲肝病毒在传播过程中的遗传变异特点及溯源调查提供参考依据.
作者：黄腾达；周文亭；曹经瑗；毕胜利 刊期： 2018年第02期
目的 对2016年台州市本地暴发的登革热病例进行实验室检测与溯源分析.方法 采集3例患者急性期血清进行抗原、抗体和核酸检测,并用C6/36细胞分离培养登革病毒.用RT-PCR方法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统进化树.结果 从患者血清中检测到登革Ⅰ型病毒核酸、IgM抗体和NS1抗原.成功分离到3株Ⅰ型登革病毒株,这3株病毒在同一进化分支上,属于Ⅰ型登革病毒中的Genotype Ⅰ亚型,核苷酸同源性均为99.87％,氨基酸同源性为99.6％ ～ 99.8％.结论 浙江省台州市本次登革热本地暴发病例可能由广东或东南亚输入而来.
作者：王东红；裘丹红；翁坚；盛莹；林海江；林春萍；孔超；周静晓；沈伟伟 刊期： 2018年第02期
生物安全作为总体国家安全观的重要组成部分,已成为新时代中国特色社会主义坚持和发展的国家基本方略.2004年以来,我国病原微生物实验室生物安全工作取得重要进展和长足进步,在做好国内保障工作的同时,并为2014年西非埃博拉疫情防控作出积极贡献.新时代下,我国病原微生物实验室生物安全工作应“抓住核心、覆盖全面、措施到位”,在实施健康中国、“一带一路”倡议、构建人类命运共同体的战略指引下,围绕生物安全、生物安保和生物技术(3B)涉及的安全问题,持续为新发突发传染性疾病防控和公共卫生安全提供坚实基础保障.
作者：魏强；武桂珍 刊期： 2018年第02期
目的 为确定1株通过高通量测序获得的GV型野生鼠诺如病毒(MNV)变异株的基因组序列特征.方法 将在山东地区采集的210只鼠经解剖后收集的肠道内容物和肝脏进行核酸提取,质检合格后送于华大基因进行高通量测序,获得一株GV型野生鼠诺如病毒.设计特异性巢式引物利用RT-PCR方法扩增该病毒全基因组.利用DNAMAN,MEGA5.0软件进行序列比对及系统进化分析.结果 获得的GV型野生MNV变异株全基因组长度7 382 bp,与从数据库中选取的30株参考毒株全基因组序列相似度为76.8％ ～78.1％,其中VP1中的高变区P2编码的氨基酸相似度仅为60.9％ ～78.1％,表明该株MNV具有较高的变异率.结论 本研究分离出了一株野生鼠诺如病毒,丰富了国内MNV的基因库,其变异特征为了解国内MNV的分子遗传特征及进化来源提供了参考依据.
作者：刘蒙蒙；李利利；林琳；王笑峰；段招军 刊期： 2018年第02期
中华实验和临床病毒学杂志
主管:实验和临床病毒学杂志
主办：中国科学技术协会
