学术投稿

一种提高PCR产物亚克隆效率的方法

彭志强;俞守义;贺竹梅

关键词:克隆效率, 蛋白酶, 纯化方法, 乙醇沉淀, 氯仿, 混合物, 重组子, 酶切, 扩增产物, 抽提, 常规方法, 柱纯化, 水溶解, 试剂盒, 内切酶, 聚合酶, 载体, 无水, 水浴, 清洗
摘要:利用PCR扩增目的基因是常用的一种克隆方法,但在实际操作中,试剂盒中Taq DNA聚合酶在经过各种纯化方法(如酚氯仿抽提,乙醇沉淀,电泳和柱纯化)后,仍附着在扩增产物的5'端,有效地阻止随后的内切酶酶切过程,导致重组的失败。作者采用一种可以显著提高PCR产物克隆的效率的方法,即将10 μl蛋白酶K混合物[蛋白酶K混合物的配制:0.1 mol/LTris-HCl (pH8.0)、5%SDS,0.5 mg/ml蛋白酶K)加入100 μl PCR反应后的产物中,37 ℃水浴1 h后,68 ℃ 15 min以灭活蛋白酶K,用酚-氯仿、氯仿各抽提1次,无水乙醇沉淀,70%乙醇清洗后晾干,并用双蒸水溶解。采用这种方法得到了PCR产物与相应酶切载体连接,可以顺利得到大量的重组子,与常规方法比较大大地提高了克隆的效率。
南方医科大学学报杂志相关文献
  • 三氯消毒剂杀菌效果试验观察

    :以0.2%康威达消毒片(主要成份为三氯异氰脲酸)的水溶液,对两种实验菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)悬液分别作用5、10、15 min,杀菌率达100%。对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性血清作用30 min,HBsAg抗原破坏率达96.88%。表明此消毒剂杀菌效果好、作用持久。

    作者:张亚莉;陈进华;李岚;汪能平;耿穗娜 刊期: 2001年第04期

  • 急性肠套叠256例的诊治体会

    总结我院256例急性肠套叠的临床资料,认为空气灌肠透视既是诊断急性肠套叠的简便方法,又是治疗的可靠措施;B超检查对诊断有很大帮助。发病<24 h而无腹胀、腹膜炎者均可应用空气灌肠复位;凡复位失败或套叠时间>48 h,而且有腹胀、发热、腹膜炎者应立即手术。

    作者:吴彩新;李泰辉;朱法清;黄虹;揭育畴 刊期: 2001年第04期

  • 轮状病毒腹泻患儿病毒血症的初步研究

    目的了解普通轮状病毒(RV)腹泻患儿病毒血症出现情况。方法应用套式-逆转录PCR方法检测60例RV腹泻患儿外周血血浆和其中14例血清酶学异常患儿外周血单个核细胞中的RV。结果 60例RV腹泻患儿中,共检出RV病毒血症阳性者4例(6.67%),其中血浆中检出1例,外周血单个核细胞中检出3例,分属4个患儿。结论在普通RV腹泻患儿也存在RV病毒血症。

    作者:李宁;姚英民;温淑娟 刊期: 2001年第04期

  • 药物止痛原理

    研究人员发现,非类固醇消炎药不仅对疼痛部位产生作用,而且可以通过中枢神经系统产生作用。中枢神经系统在疼痛感的产生中及在身体对炎症和疼痛作出反应的过程中也起着重要作用。 非类固醇药物通过阻止两种分别称为Cox-1和Cox-2的酶的作用而达到止痛目的。Cox-1存在于胃部和血液中,Cox-2存在于皮肤与关节中,并且在伤口或疼痛部位也可以产生。Cox-2还协同产生一种称为前列腺E2的化学物质,这种物质可增加患者对疼痛的敏感性。研究人员发现,Cox-2也存在于脑部附近和脊椎细胞中,它可以通过中枢神经系统释放出前列腺E2化学物质。目前,非类固醇类药物被设计用来对炎症局部发生作用,而不对中枢神经系统中的Cox-2发生作用。研究人员希望对现有的非类固醇药物进行改造,使它可以有效地抑制Cox-2。

    作者: 刊期: 2001年第04期

  • 侧窦区硬脑膜动静脉瘘的诊断与治疗

    目的探讨侧窦区硬脑膜动静脉瘘的病因、发生机制、临床症状及诊治方法。方法 19例病人中,17例病人应用微导管技术,在数字减影血管造影机(DSA)监视下,对侧窦区硬脑膜动静脉瘘行血管内栓塞治疗,2例单纯应用颈动脉压迫法治疗。结果 19例中,10例治愈;4例症状明显改善;4例好转;1例死亡。结论应用颈动脉压迫法及微导管栓塞技术是治疗侧窦区硬脑膜动静脉瘘的有效手段。

    作者:李铁林;段传志;韩志安;汪求精;赵刚;苏正;徐如祥 刊期: 2001年第04期

  • NO-cGMP通路对下丘脑钙激活钾通道的调控研究

    目的研究一氧化氮(NO)对SD乳鼠下丘脑神经元钙激活钾(KCa)通道的作用及其机制。方法采用内面向外式及细胞贴附式膜片钳技术比较浴槽液中加入100 μmol/L硝普钠( SNP)前后动物下丘及神经元KCa通道动力学的改变。结果细胞贴附式时浴槽液中加入100 μmol/L SNP,通道开放概率由(7.3±1.5)%升高至(40.2±6.5)%,开放时间由(7.12±1.41) ms增大至(15.34±3.45) ms,开放频率由(11.3±3.5) Hz升高为(26.6±4.2) Hz (n=10, P<0.05)。结论 NO-cGMP通路可显著提高通道的开放概率,这种增强作用是通过延长通道开放时间及增加开放频率实现的,它的病理或生理作用还有待于进一步研究。

    作者:王帅;邹飞;郭洪波;蔡春青;罗炳德 刊期: 2001年第04期

  • 烟碱对白细胞介素-1β诱导的培养牛脑微血管内皮细胞表达αvβ3整合素的增强作用

    目的观察烟碱对牛脑微血管内皮细胞(Bovine cerebral microvascular endothelial cells, BCMEC)表达αvβ3整合素的影响。方法离体培养新生牛脑微血管内皮细胞;血细胞计数仪测定BCMEC粘附大鼠血单核细胞(MN)的数目;应用ELISA法检测BCMEC对αvβ3整合素的表达量。结果高浓度烟碱(10-5mol/L)单独作用于BCMEC 2 h 后,使BCMEC对MN的粘附率从(12.9+0.4)% 增至(15.7+0.6)%, 且BCMEC也可表达少量的αvβ3整合素; 而当烟碱与BCMEC作用2 h后,再经白细胞介素-1β (IL-1β) 诱导4 h,烟碱可浓度依赖性(10-7~10-5 mol/L)地增强IL-1β的诱导作用,增加BCMEC对MN的粘附率以及E-选择素的表达量; 抗αvβ3整合素抗体(αβAIAb)能显著阻断IL-1β诱导BCMEC后对MN的粘附率。结论烟碱具有增强IL-1β诱导的脑微血管内皮细胞表达αvβ3整合素的作用。

    作者:徐江平;杨雪梅 刊期: 2001年第04期

  • HBV 基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

    目的研究HBV T1862变异的生物学意义。方法采用分子生物学方法,构建HBV前C/C基因EB病毒真核表达载体,利用体外定点突变技术诱导前C/C基因T1862变异,经PCR-RFLP初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后,以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Cos7细胞, 以ELISA 检测HBeAg的表达量。结果未突变的重组质粒可稳定表达HBeAg,突变后的重组质粒未能检测到HBeAg表达。结论 HBV前C/C基因1862点突变的真核表达载体的构建,为体外研究该点突变引起HBV的一系列生物学改变奠定基础。

    作者:林裕龙;侯金林;王战会;阎丽;周福元;骆抗先 刊期: 2001年第04期

  • 人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2基因的克隆与鉴定

    目的获得人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)编码区基因。方法采用RT-巢式PCR技术从人胎肝组织总RNA扩增目的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体,酶切图谱分析和测序鉴定。结果获得了编码含信号顺序的MASP-2肽链全长cDNA,将其与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌TG1,建立了MASP-2的重组克隆。酶切图谱与微机分析结果无异;序列分析表明,与报道的人MASP-2 cDNA序列一致。结论成功克隆了人MASP-2基因,为深入研究补体凝集素途径的激活机制和甘露聚糖结合凝集素基因突变引起免疫缺损的发病机制奠定了基础。

    作者:陈政良;张丽芸;卢晓;乔贵林 刊期: 2001年第04期

  • 鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体的构建

    目的构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体。方法应用重组DNA技术,将人工合成的尿激酶原信号肽基因与鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因连接,并保证在同一阅读框架,然后分别插入到pcDNA3和PMJK3两种真核表达载体中。结果构建成可以在真核细胞中分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的重组质粒pcDNA3-D1和pMJK3-D1。结论为建立稳定分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的细胞工程株奠定了基础。

    作者:舒东;徐兵;俞炜源;罗深秋 刊期: 2001年第04期

  • 同一输卵管双胎妊娠并继发腹腔妊娠1例报告

    1 临床资料 患者,女,26岁,人工流产2次,末次月经1998年11月23日。停经46 d后,外院诊断为早孕,服用米非司酮25 mg/次,2次/d,共3 d,第3天加用米索前列醇600 g。服药3 d后,阴道流血如月经量,未见明显组织物排出,流血24 d后自止。B超检查提示未见异常,宫腔内无残留物。1999年1月26日出现上腹痛,收入本院消化内科,诊为“胃、十二指肠溃疡”,治疗12 d,症状无好转。因患者腹痛加剧,漫延全腹,以“宫外孕破裂内出血”收入本科。查体:体温36.8 ℃,脉搏90次/min,血压13/9 kPa,呼吸20次/min,心肺无异常,全腹膨隆,肝脾未扪及,全腹压痛,反跳痛,肌紧张,移浊阳性。腹部穿刺抽出不凝血6 ml。妇检:外阴、阴道正常,宫颈光滑,未见流血,宫颈举痛,后穹窿饱满,子宫附件压痛拒按,触诊不清。尿妊娠试验阳性。即在硬膜外麻醉下行剖腹探查术,术中见腹腔内积血约200 ml,血块约800 g。吸除大部分积血及血块后,见盆腔左侧附件上方漂浮着1个长约4 cm死胎儿,头颅、五官、躯干、四肢清晰可辨,组织易破碎。大网膜与左附件粘连,并附着大量血块。清除血块后,见大网膜与左输卵管中部近系膜处以胎盘样组织相连,旁有一小破口。将大网膜与输卵管分离后,见左输卵管整条增粗变形,粗处直径为4 cm。将输卵管与周围粘连组织分离后切除。术后检查切下输卵管发现,在伞端处有1个卷曲胎儿,将输卵管纵形切开,在伞端内面有另1个胎盘组织附着,右附件外观无异常。

    作者:张萍;陈磊 刊期: 2001年第04期

  • 酵母中心体复制的调控

    我们都知道两个中心体对于有丝分裂中形成双极纺锤体是必需的,如果中心体过多则会导致基因组的不稳定,所以中心体在每个细胞周期中,只被复制一次是很重要的。那么此过程是如何调节的呢? 一月份《Nature》杂志中,Steven Reed 和同事们提出了酵母中中心体的等价物SPB(spindle pole body)复制的模型,基于DNA复制与细胞周期进行相吻合的观点,认为cyclin/CDK可能也与SPB的复制激活及抑制其再复制有关。 研究者还发现,芽殖酵母中的3个G1 cyclin(clns1, 2, 3)与调控SPB的复制有关。在后来的成熟中,SPB复制前,由两个S期B类cyclin clb5,clb6和一个有丝分裂期B类cyclin调控,后由4个有丝分裂B类cyclin阻止SPB的复制。

    作者: 刊期: 2001年第04期

  • 网络环境下医学文献检索课教学内容的新变化

    探讨网络环境下医学文献检索课教学内容的新变化,并指出网络信息检索、网络信息资源的筛选与甄别、多种搜索引擎的比较研究和搜索引擎的选择及联合使用、印刷本检索工具、光盘检索和网络版检索工具的使用转换应当成为文献检索课教学的新内容。

    作者:夏旭;李健康 刊期: 2001年第04期

  • DNA芯片技术:新一代基因诊断技术

    介绍了 DNA芯片技术作为新一代基因诊断技术的优势及其在基因诊断中的应用。

    作者:李凌;马文丽 刊期: 2001年第04期

  • 脑灰质异位症6例报告

    脑灰质异位(Heterotopic gray matter, HGM)是神经元移行异常的一种。本文报告我院1990~2000年经MRI确诊的6例HGM。 1 临床资料1.1 一般资料 本组男女各3例,年龄18~30岁。门诊2例,住院4例,其中手术1例。6例均有难控制癫痫,发病年龄14~28岁。癫痫发作类型包括强直-阵挛发作4例、失神发作1例、单纯部分(情感)性发作1例。2例智能发育迟滞、3例智能发育正常、1例无记载。2例有局灶运动功能损害、3例正常、1例无记载。3例EEG异常、1例正常、2例无资料。1.2 MRI检查 本组MRI显示异位板型2例、结节型加板型2例、结节型加带型1例、带型1例。T1和T2呈现稍长信号,与脑皮质类似。向脑室内生长者,呈现类似脑回的起伏,脑室变形。无占位效应,增强扫描病灶无强化。伴发胼胝体发育不良2例、脑裂畸形2例、巨脑回畸形1例。

    作者:徐忠平;谢惠芳;刘振华 刊期: 2001年第04期

  • 人源性大肠癌自然致敏噬菌体抗体Fab呈现库的构建与筛选

    目的构建大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库,初步筛选相关抗大肠癌抗体。方法取大肠癌病人转移淋巴结,提取淋巴结总RNA,逆转录PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA。依次将PCR产物插入载体pComb3的相应部位,构建人源性大肠癌噬菌体Fab基因库,并应用噬菌体表面呈现技术对该抗体库进行淘选及鉴定。结果所选2种Ig亚类的重链Fd片段、2种κ轻链cDNA得到扩增。Fd片段和κ轻链均插入pComb3的重组率为40%,Fab噬菌体表达库容达1.48×106。经3轮淘选,抗体库得到约120倍的富集。3轮抗体库的点印记免疫染色均显示有Fab表达;酶联免疫吸附实验显示其与大肠癌抗原有结合活性。结论成功构建了大肠癌病人自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库,利用噬菌体抗体库技术,可筛选相关抗大肠癌抗体。

    作者:吴保平;张亚历;肖冰;张振书;赖卓胜;王亚东;高春芳;周殿元 刊期: 2001年第04期

  • 酷似胰腺囊性占位病变的腹膜后神经鞘瘤1例报告

    1 临床资料 患者,男,58岁,因外伤受压后3月扪及上腹部包块入院。既往无任何不适,体检:一般情况好,腹平软,左中上腹可触及一质地中等、表面尚光滑的包块,活动度不大。实验室检查:三大常规正常,肝、肾功能正常,血胆红素及血淀粉酶正常。CT诊断:胰尾部囊性占位性病变,性质多考虑囊腺癌。

    作者:蒋慧蓉;崔忠林;杨燕 刊期: 2001年第04期

  • mRNA差异显示法筛选大肠癌相关基因

    目的分离并克隆大肠癌相关基因。方法分别提取大肠癌与正常大肠粘膜的组织总RNA,用mRNA差异显示法(Differential display polymerase chain reaction,DD-PCR)筛选大肠癌特异性表达产物的cDNA片段,对其进行克隆、测序、序列分析以及斑点杂交初步鉴定。结果获得了2个在大肠癌高表达而在正常大肠粘膜组织低表达的新基因片段。结论这2条差异显示新基因片段很可能是与大肠癌相关的致癌基因。

    作者:南清振;高蕾;杨希山;肖冰;周京旭;张亚历;施理 刊期: 2001年第04期

  • 咀嚼压力增强对大鼠牙槽骨白细胞介素-1β表达的影响

    目的检测大鼠牙槽骨成骨细胞中IL-1β在正常及增强咀嚼压力状态下的动态表达,探讨IL-1β在牙槽骨改建中的分子机制。方法采用HE染色和免疫组化的方法,观察牙周形态变化以及牙槽骨成骨细胞中IL-1β蛋白表达。结果生理限度内咀嚼压力增强时,形态学显示大鼠牙周膜增宽、牙槽骨新骨形成;免疫组化观察到成骨细胞中IL-1β表达较正常咀嚼压力时明显增强。结论咀嚼压力增强促使牙周组织产生IL-1β明显增多,诱发了破骨功能,同时,还激活了成骨功能。提示IL-1β在咀嚼压力影响牙槽骨改建的过程中起着重要的调节作用。

    作者:袁林;周伟东;赵云凤 刊期: 2001年第04期

  • 脑血栓形成患者急性期和恢复期血小板α颗粒膜蛋白-140的变化

    目的研究血小板α颗粒膜蛋白-140 (GMP-140)在脑血栓形成患者急性期和恢复期的变化。方法测定50例(其中30例急性期患者,20例恢复期患者)脑血栓形成患者血浆GMP-140的含量,并分别与26名健康人作比较。结果脑血栓形成患者急性期GMP-140浓度明显高于恢复期和正常对照组(P<0.01),恢复期与正常对照组间比较差异无显著性(P>0.05)。结论脑血栓形成患者急性期血浆GMP-140含量处于较高水平。

    作者:赵东红;周玥;王运良;王芹 刊期: 2001年第04期

南方医科大学学报杂志

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主管:广东省教育厅

主办:南方医科大学