刘兰；史新昌；饶春明
目的 探讨肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染患儿外周血中自然杀伤(Natural killer,NK)细胞比例、亚群、表面受体及免疫效应分子的变化.方法 将EV71阳性的急性期患儿按疾病严重程度分为重症病例组和普通病例组,同时设健康对照组.提取各组患儿外周血,采用流式细胞术检测外周血中NK细胞比例、NK细胞亚群、自然细胞毒受体NKp30和NKp46、激活性受体NKG2D、抑制性受体CD94和NKG2A、脱颗粒标记CD107a及免疫效应分子(PF、GrB和GNLY)阳性细胞所占NK细胞的比例.结果 重症病例组患儿外周血NK细胞比例较健康对照组明显减少(P＜0.01),普通病例组CD16+NK细胞亚群比例较健康对照组升高(P＜0.05),重症病例组较普通病例组低,但差异无统计学意义(P＞0.05)；重症病例组和普通病例组NKG2D阳性细胞百分率均较健康对照组低(P＜0.01),而CD94和NKG2A阳性细胞百分率均较健康对照组明显升高(P＜0.01),NKp30和NKp46阳性细胞率3组之间差异无统计学意义(P＞ 0.05)；重症病例组和普通病例组CD107a、PF、GrB、GNLY的阳性细胞百分率均较健康对照组明显降低(P＜0.01或P＜0.05).结论 EV71感染可能抑制宿主NK细胞的增殖、激活及其杀伤功能.重症病例组与普通病例组比较,NK细胞比例和CD16+NK细胞亚群降低,抑制性受体CD94表达增高,胞浆内CD107a、GrB和PF表达显著降低,可能与重症病例的发生有关.
作者：王倩倩；许红梅 刊期： 2013年第04期
目的 构建胰岛素诱导基因-2(Insulin induced gene-2,Insig-2)启动子荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其转录活性.方法 从人基因组DNA中扩增Insig-2基因转录起始位点上游1 389 bp的启动子片段,插入pGL3-basic质粒中,构建重组质粒pGL3-Insig-2,将其与内参质粒pRL-TK瞬时共转染HEK293、HepG2和3T3-L1细胞,采用双荧光素酶法检测Insig-2启动子活性.结果 重组质粒pGL3-Insig-2经双酶切和DNA测序,证实构建正确；pGL3-Insig-2质粒在HEK293、HepG2和3T3-L1细胞中均具有启动子活性,分别为阴性对照组(pGL3-basic空载体)的28、40和214倍、阳性对照组(pGL3-SV40)的2.6、5.5和30倍,呈现出强启动子活性.结论 成功构建了Insig-2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒,为后续Insig-2基因的深入研究奠定了基础.
作者：杨发建；张琴；何芸；周龙洋；卜友泉；孙文娟；何百成；杨俊霞 刊期： 2013年第04期
目的 原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化.方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n.用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清.将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件.表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确.表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000; IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6h,目的蛋白的表达量高,占菌体总蛋白的30％以上；重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达.纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95％,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应.结论 在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础.
作者：孙静；傅晶晶；蔡泓志；施建东；石怀生；胡云章；胡凝珠 刊期： 2013年第04期
目的 在毕赤酵母中表达全长甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)(1-34)与人血清白蛋白(Human serum albumn,HSA)的融合蛋白PTH(1-34)-HSA,并检测其活性.方法 在质粒pPIC9K-PTH(1-34)2-HSA的基础上设计引物,引入6His标签及肠激酶酶切位点,从该质粒中扩增6His-EK-PTH(1-34)-HSA基因,插入pPIC9K载体中,构建重组表达质粒pPIC9K-6His-EK-PTH(1-34)-HSA,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达；表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白通过两步亲和层析纯化和肠激酶酶切,获得全长的PTH(1-34)-HSA融合蛋白；检测融合蛋白对UAMS-32P成骨细胞增殖活力、碱性磷酸酶活性以及RANKL和OPG基因转录水平的影响.结果 重组表达质粒经测序证实构建正确；表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白相对分子质量约70 000,可与PTH抗体和HSA抗体特异性结合,发酵 获得的融合蛋白的浓度为200 mg/L;纯化的融合蛋白可与抗PTH、HSA和6His标签抗体特异性结合,经肠激酶酶切后,该蛋白失去了与6His抗体反应的能力,保持了与PTH和HSA抗体结合的能力；酶切后的全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白保持了PTH的生物活性,能促进UAMS-32P成骨细胞的增殖活力,提高细胞的碱性磷酸酶的活性,上调细胞RANKL基因的转录水平以及抑制OPG基因的转录水平.结论 成功在毕赤酵母中表达了全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白,有望提高PTH的成药性.
作者：李俊毅；彭林；唐存多；邬敏辰；金坚 刊期： 2013年第04期
目的 了解重庆地区5岁以内儿童腹泻病毒病原及流行病学特点.方法 收集重庆医科大学附属儿童医院2010年8～11月就诊的5岁以内腹泻患儿的粪便标本共500份,采用胶体金法检测A组轮状病毒(Rotavirus,RV),RT-PCR法检测B、C组RV、诺如病毒(Norovirus,NV)G Ⅰ和GⅡ、肠道腺病毒(Adenovirus,ADV)、札如病毒(Sapovirus,SLV)和星状病毒(Astrovirus,ASV),取NV和SLV阳性PCR产物测序,并对病毒基因进行分型.采用MEGA 5.05软件构建进化树,Kimura's two-parameter法计算遗传距离,邻接法(Neighbor-joining)boot-strap重复检验1 000次.结果 500份标本中,检测到A组RV阳性标本134份,阳性率为26.8％; NV GⅡ型阳性标本132份,阳性率为26.4％; ADV阳性标本31份,阳性率为6.2％; SLV阳性标本9份,阳性率为1.8％;ASV阳性标本1份,阳性率为0.2％；未检测到B、C组RV和NV GⅠ型.随机选择22份NV阳性标本进行测序及基因分型,其中GⅡ/4占绝对优势,其次为GⅡ/6、GⅡ/2、GⅡ/3和GⅡ/7.SLV可分为4个基因亚型,其中GⅠ/1为优势株,其次为GⅠ/2、GⅡ/1和GⅠV1.结论 重庆地区5岁以下儿童腹泻以病毒感染为主,RV是主要的病原体,其次为NV、ADV、SLV和ASV.
作者：任增志；孔元梅；王倩倩；黄爱龙；钟晓妮；许红梅 刊期： 2013年第04期
目的 探讨神经肽P物质(Substance P,SP)对高氧损伤早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell typeⅡ,AECⅡ)氧化/抗氧化状态的影响.方法 将分离培养的原代早产大鼠AECⅡ随机分为4组:空气组(将细胞置5％ CO2、21％O2的孵箱中)、高氧组(将细胞置5％ CO2、95％ O2的密闭氧仓中)、高氧SP组(细胞培养液中预先加入5×10-8 mol/L的SP,再置高氧中)和高氧SP受体拮抗剂组(细胞培养液中预先加入5×10-8 mol/L的SP和5×10-7 mol/L的L703.606,再置高氧中),各组细胞培养24 h后,镜下观察细胞形态的变化；MTT法检测细胞的增殖活力；流式细胞术检测细胞周期；JC-1探针法检测细胞凋亡早期线粒体膜电位的变化；化学比色法检测细胞丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、总抗氧化能力(Total antioxidative capacity,TAOC)及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活力.结果 与空气组比较,高氧组AECⅡ的增殖活力、S+G2期细胞比例、线粒体膜电位、SOD活力和TAOC均明显下降(P＜0.01),MDA含量明显升高(P＜0.01)；与高氧组比较,高氧SP组AECⅡ的增殖活力、S+G2期细胞比例、线粒体膜电位、SOD活力和TAOC均明显升高(P＜0.01),而MDA含量明显下降(P＜0.01),SP受体拮抗剂可阻断该效应.结论 SP可明显减轻高氧导致的早产大鼠AECⅡ的氧化损伤,增强细胞的抗氧化能力,进而起到促进细胞增殖的作用.
作者：董欣鑫；姚兰；方芳；许峰 刊期： 2013年第04期
目的 观察柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,Serpin)基因核酸疫苗对E.tenella感染雏鸡的免疫保护效果.方法 取14日龄雏鸡,随机分为7组:pVAX 1-Serpin高剂量组(100 μg/只)、pVAX1-Serpin中剂量组(50 μg/只)、pVAX1-Serpin低剂量组(25μg/只)、pVAX1组(50μg/只)、E.tenella卵囊组(15日龄时,口服5 000个卵囊/只,不加强免疫)、未免疫攻虫对照组(0.1 ml PBS)和未免疫未攻虫对照组(0.1 ml PBS),除E.tenella卵囊组外,均经胸肌注射免疫,21日龄时加强免疫1次,28日龄时,除未免疫未攻虫对照组外,均经口感染1×104个E.tenella孢子化卵囊.攻虫后第8天剖杀,计算各组的存活率、平均增重、相对增重率、盲肠病变减少率、卵囊减少率及抗球虫指数(Anticoccidial index,ACI).结果 未免疫攻虫对照组和pVAX1组的存活率分别为75％和70％,其余各组的存活率均为100％.pVAX1-Serpin高、中剂量组、E.tenella卵囊组和未免疫未攻虫对照组的平均增重2均较未免疫攻虫对照组显著增加(P＜0.05),其中pVAX1-Serpin高剂量组相对增重率2达95.26％;E.tenella卵囊组、pVAX1-Serpin高、中剂量组的盲肠病变记分明显低于pVAX1组和未免疫攻虫对照组(P＜0.05),前两组病变减少率较高；各免疫组卵囊产量均较未免疫攻虫对照组显著下降(P＜0.05),pVAX1-Serpin高剂量组卵囊减少率达67.04％;各免疫攻虫组ACI值均高于未免疫攻虫对照组,其中E.tenella卵囊组高(181.23),pVAX1-Serpin高剂量组次之(166.26),而pVAX1-Serpin中、低剂量组和pVAX1组均小于160.结论 高剂量pVAX1-Serpin对鸡E.tenella感染具有一定的免疫保护作用.
作者：李文超；顾有方；杜玲；宫鹏涛；李建华；张西臣 刊期： 2013年第04期
目的 优化CHO-DG44细胞瞬时转染的条件.方法 采用TubeSpin一次性生物反应器,以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)为报告基因,氯醚酰亚胺(Polyether imide,PEI)为转染试剂,将质粒pIRESneo3-eGFP瞬时转染CHO-DG44细胞,优化瞬时转染的基本条件[细胞密度、DNA浓度和DNA:PEI比例(w/w)]以及其他条件(换液、渗透压和温度),采用优化的条件转染质粒pIRESneo3-eGFP,流式细胞术检测细胞转染效率,生物发光仪检测相对荧光强度.结果 CHO-DG44细胞瞬时转染的佳条件为:采用XLG-P8培养基进行转染,细胞密度为2×106个/ml,DNA浓度为6.25μg/5 ml,DNA∶PEI(w/w)比例为1∶5；转染后4h更换新鲜培养基,添加30 mmol/L NaCl,并于31℃继续培养.在此条件下,CHO-DG44细胞的瞬时转染效率可达81.45％,相对荧光强度可达9×105 RFU/106 cells.结论 优化了CHO-DG44细胞瞬时转染的条件,为下一步药物蛋白的研发奠定了基础.
作者：黎美香；陈先金；王晓慧；王亚玉；袁凤媚；汪才坤；谢秋玲 刊期： 2013年第04期
近年来,随着人们对环境和能源问题的关注,以酶为催化剂的绿色生物催化技术越来越受到重视,而酶的催化能力是影响酶能否进行工业化应用的重要因素,同时,因催化不同反应的需要,新酶开发显得十分迫切.杂合酶技术是基于已有酶资源来进行新酶的设计和开发的技术,其具有独特的优点,尤其是目前酶的表达克隆、分子筛选、人工进化、DNA序列改组和体外突变等技术已成为常规技术,为杂合酶的开发及生产奠定了基础.本文对杂合酶的构建策略、构建方法及发展前景作一综述,为其应用和开发提供参考.
作者：韩镇；解桂秋；高仁钧 刊期： 2013年第04期
目的 制备甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),为研制HAV VLPs疫苗奠定基础.方法 利用RT-PCR法从HAV HM175-clone4株中扩增P1-2A、P2和P3基因片段.将P1-2A和P3基因亚克隆至pFastBacDual载体,构建重组表达质粒pFastBacDual-P1-P3,转化大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-P1-P3,转染昆虫细胞sf-9进行重组杆状病毒的包装.重组杆状病毒vAcP1P3扩增后,感染昆虫细胞Tn-5,培养72 h后,收获表达产物,经原位免疫荧光、EIA、Western blot法及透射电镜检测HAV VLPs的表达.表达产物经超滤及蔗糖密度梯度离心纯化.结果 重组表达质粒和重组穿梭质粒分别经双酶切和PCR鉴定证明构建正确.第2、3、4代重组杆状病毒的滴度分别为1.58×105、2.13×107、3.98×107 TCID50/ml.vAcP1P3转染sf-9细胞72 h后,可见HAV蛋白的表达；vAcP1P3转染Tn-5细胞后,表达的HAV抗原主要存在于沉淀中,且含量明显高于野生型杆状病毒沉淀样品(P＜0.001)；Wentern blot结果表明,与野生型杆状病毒组相比,HAV VLPs样品中VP3的含量相对较少,HAV VLPs样品可见相对分子质量约30 700的VP1片段及相对分子质量约27 700的VP3片段；透射电镜观察可见大小约50 nm的VLPs颗粒,略大于天然HAV颗粒.纯化的HAV蛋白主要存在于40％ ～ 50％的蔗糖梯度中,提示有VLPs形成.结论 成功制备了HAV VLPs,为甲肝新型疫苗的研制奠定了基础.
作者：沈智俊；吴杰；解庭波；吕宏亮；王云；陈新文；严家新 刊期： 2013年第04期
目的 探讨酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎(简称甲肝)和乙型肝炎(简称乙肝)抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用,并对皮下和鼻腔接种的免疫效果进行比较.方法 将酵母多糖与角鲨烯按一定比例混合,制成复合佐剂,将不同剂量的复合佐剂与HBsAg混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8、16周,采用ELISA法检测小鼠血清中抗HBsAg IgG抗体水平,筛选复合佐剂的佳免疫剂量.以复合佐剂的佳免疫剂量与甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、甲肝抗原对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8周检测小鼠血清中抗甲肝抗原IgG抗体水平.以复合佐剂佳免疫剂量分别与HBsAg和甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组和甲肝抗原对照组,经鼻腔免疫ICR小鼠,共免疫3次,间隔2周,分别于末次免疫后4、8周检测小鼠血清中抗HBsAg和甲肝抗原IgG抗体水平.在试验期间,对小鼠的健康状况进行观察,并对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行病理分析.结果 酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对HBsAg的佳免疫剂量为2 mg酵母多糖+8μl角鲨烯,该组抗体水平明显高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组(P＜0.05)；复合佐剂对甲肝抗原也有较好的体液免疫增强作用,抗体水平显著高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组(P＜0.05)；复合佐剂通过鼻腔免疫,对HBsAg和甲肝抗原的体液免疫应答也有增强作用,但效果不如皮下免疫,甲肝抗原鼻腔免疫效果优于HBsAg(P＜0.05).在试验期内,小鼠均未出现异常反应,各器官均未发生病变.结论 酵母多糖-角鲨烯复合佐剂能显著增强甲肝和HBsAg抗原对小鼠的体液免疫应答,免疫效果优于铝佐剂；皮下免疫效果优于鼻腔免疫；在免疫剂量范围内,复合佐剂安全性良好.
作者：王丽萍；王越；王海漩；胡云章；胡凝珠 刊期： 2013年第04期
目前流感疫苗血凝素含量常用的检测方法是单向免疫扩散法(Single-radial immunodiffusion,SRID).为了解决大流行流感发生初期无法获得参考品的情况,提高流感血凝素检测方法的灵敏度、重复性、准确性,人们从物理化学和免疫化学两个方面对SRID的替代方法进行了探索性研究.本文对近1 0年来对流感疫苗血凝素含量测定方法的研究进展作一简要综述.
作者：刘朝阳；孟佳帆；程鹏飞 刊期： 2013年第04期
目的 探讨普洱茶发酵过程中咖啡因的存在形式及游离咖啡因含量的变化,为监测茶叶发酵程度,控制茶品质量提供依据.方法 应用低pH沉淀结合高效液相色谱法(HPLC)检测普洱茶发酵全程中6个主要发酵阶段[一翻、二翻、三翻、四翻、五翻样品和出堆样品(熟茶)]样品的游离咖啡因和结合咖啡因含量.结果 普洱茶发酵过程中,游离咖啡因含量逐渐降低,从一翻样品的(2.555±0.104)％降至出堆样品的(1.878±0.049)％,超过1/4的咖啡因与茶中的其他组分相结合,形成结合咖啡因.结合咖啡因的含量不断增加,四～五翻期间增幅大,从0.084％增至0.647％;出堆样品中结合咖啡因的含量高,为0.703％.结论 发酵过程中,普洱茶中的游离咖啡因含量逐渐降低.本实验为监测茶叶发酵程度,控制茶品质量提供了依据.
作者：王腾飞；王宣军；黄业伟；方崇业；朱强强；杨军；盛军；郝淑美 刊期： 2013年第04期
目的 观察鼠疫噬菌体对感染鼠疫小鼠的治疗作用,以寻找治疗鼠疫感染的新方法.方法 小鼠经皮下感染141株鼠疫菌建立鼠疫感染模型后,用效价为10-11的鼠疫噬菌体对短期治疗组在感染后3、6、12和24 h给予100μl/次的注射治疗,对长期治疗组在感染后1 ～7d连续注射鼠疫噬菌体,100 μl/次,1次/d.同时,设阴性对照组(不感染,只治疗,观察噬菌体对小鼠的毒性)和阳性对照组(仅感染,不治疗).结果 阴性对照组小鼠治疗14d后全部存活,处死后剖检未检出鼠疫菌.各治疗组小鼠在治疗第5天存活率为100％,与阳性对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)；长期腹腔治疗组效果明显,鼠疫噬菌体在小鼠体内存活时间长,效价不降低.结论 鼠疫噬菌体对感染小鼠急性感染期的治疗有一定效果,长期腹腔注射治疗效果较好,为其进一步应用于抗感染治疗提供了实验依据.
作者：张珊瑚；祁芝珍；张青雯；赵海红；辛有全；金泳；仇杰 刊期： 2013年第04期
目的 观察吸附无细胞百白破、灭活脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗(Diphtheria-tetanusacellular pertussis-inactivated poliovirus-Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine containing a polyribosyl-ribitolphosphate-tetanus toxoid conjugate,DTacP-IPV//PRP ～T)的不良反应发生情况,以评价其安全性.方法 采用知情自愿原则,在虹口区4个街道选择100名出生60 ～ 74 d符合检测要求的婴儿,分别于2、3、4月龄接种五联疫苗,并进行4次现场和3次电话访视,记录不良反应的发生情况.结果 接种五联疫苗后,不良反应发生率前3位为轻度异常哭闹(25.8％)、轻度触痛(23.8％)和轻度食欲下降(23.2％),随着接种剂次增加,局部发红、肿胀的严重程度升高,而呕吐、嗜睡、食欲下降、易激惹的严重程度下降.结论 五联疫苗具有良好的安全性,严重不良反应的发生率较低.受主观影响较大的不良反应报告偏多,在日后的接种工作中需注意后续剂次接种后局部不良反应的发生情况,以减轻局部症状.
作者：杨彦基；钱晓华；王春艳；施雪华；区志莲；鲁依力 刊期： 2013年第04期
目的 原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1 (Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清.方法 利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达.表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价.结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致；重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确；表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85％,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000.结论 成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础.
作者：朱攀；井申荣；曾韦锟；黄芬 刊期： 2013年第04期
《中国药典》三部是对生物制品质量标准和检定方法的技术规范,是生物制品生产、供应、使用和监管共同遵守的法定依据.《中国药典》三部的前身是《中国生物制品规程》,自第一部生物制品国家标准《生物制品法规》(1952年版)颁布以来,历经《生物制品制造及检定规程》(1959年版),《生物制品规程》(1979年版),《中国生物制品规程》(1990年版、1995年版、2000年版),2002年10月,第八届药典委员会成立后,《中国生物制品规程》并入药典,设为药典三部.
作者：王晓娟；曹琰；郭中平 刊期： 2013年第04期
目的 构建WT1 (Wilms' tumor gene 1)蛋白CTL表位肽基因载体,并检测其在293T细胞中的转录.方法 设计分别含WT1-126肽、WT1-235肽以及这两种肽的基因载体,并加入Th通用表位Pan-DR-Th(PADRE),应用蛋白酶体切割软件PAProC和NetChop优化各表位和间隔序列,DNA疫苗在线预测工具DyNAVacS优化真核密码子后,人工合成核苷酸序列,分别插入pUC57载体,构建pUC57-WT1质粒,测序鉴定后,酶切回收各目的片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒,转染293T细胞,RT-PCR检测各目的基因在293T细胞中的转录.采用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取各重组质粒,采用紫外分光光度计测定质粒的纯度和浓度.结果 各重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证实构建正确；重组质粒携带的目的基因可在293T细胞中成功转录；各重组质粒DNA的纯度均合格,浓度在864.6 ～ 883.9 μg/ml之间.结论 成功构建了WT1蛋白CTL表位肽基因载体,并能在真核细胞中正常转录,为下一步在小鼠体内探讨特异性不同的CTLs群发挥抗肿瘤作用的机制奠定了基础.
作者：彭霞；樊卫平；张凯；苑晓娟；刘玲玲；王亮 刊期： 2013年第04期
目的 构建大鼠结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)基因miRNA表达质粒,并建立稳定转染大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)系.方法 根据大鼠CTGF基因mRNA序列,设计并合成3对寡聚单链DNA X191-1、X191-2和X191-3及1对阴性对照序列DNA X191-4,将4对寡聚单链DNA退火成双链后,分别与载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建CTGF基因miRNA重组表达质粒,分别转染HSC-T6细胞,荧光显微镜观察细胞的转染效率,RT-PCR检测转染细胞中CTGF基因mRNA的转录水平；取干扰效率高的重组质粒及阴性对照质粒,分别转染HSC-T6细胞,经杀稻瘟菌素持续加压筛选.结果 经测序鉴定,重组表达质粒构建正确,插入片段的碱基序列与设计相符；细胞的瞬时转染效率约为50％；3组干扰质粒转染的HSC-T6细胞中,CTGF基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组(P＜0.01),其中X191-2质粒对CTGF基因转录的干扰效率高；获得了稳定转染的HSC-T6细胞.结论 成功构建了CTGF基因miRNA表达质粒,并获得了稳定转染的肝星状细胞系,为进一步研究肝纤维化的形成机制及其治疗奠定了基础.
作者：阳宏；李孝生；向颖；邢旎旎；沈艳 刊期： 2013年第04期
目的 探讨慢病毒介导的人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16型E6基因shRNA在体内对荷瘤裸鼠宫颈癌生长的抑制作用.方法 将BALB/c-nu裸鼠随机分为空白对照组、干扰组和无义干扰组,经皮下接种宫颈癌Caski细胞(2×106个),移植瘤直径达0.5 cm时,空白对照组于瘤体局部注射PBS,干扰组和无义干扰组分别于瘤体局部注射靶向HPV16型E6基因的shRNA-PLL3.7干扰慢病毒和无义干扰慢病毒(3×108 TU/ml),2周后检测瘤体大小和重量的变化,采用免疫组化法检测肿瘤组织中HPV16型E6、P53和P21蛋白的表达.结果 与无义干扰组和空白对照组比较,干扰组裸鼠体内肿瘤明显缩小,瘤体重量明显降低(P＜0.000 1),无义干扰组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；干扰组肿瘤组织中HPV16型E6蛋白的表达被抑制,P53和P21蛋白的表达水平明显升高.结论 慢病毒介导的HPV16型E6基因shRNA能有效抑制动物体内宫颈癌的生长,具有潜在的开发应用前景.
作者：白垚；郭建新；崔舫；郑秀惠 刊期： 2013年第04期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
