学术投稿

透明质酸对人骨性关节炎软骨细胞凋亡及细胞周期的影响

李化光;刘华;孙洁;刘肃;张林西;王文;郭佳;赵琛;赵增虎

关键词:透明质酸, 骨性关节炎, 软骨细胞, 细胞凋亡, 细胞周期
摘要:目的 观察透明质酸(Hyaluronic acid,HA)对人骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)软骨细胞凋亡及细胞周期的影响,以探讨HA保护软骨细胞的作用机制.方法 分离人正常软骨细胞和OA软骨细胞,传至第2代后,分别经HA处理24h,采用MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期.结果 HA能明显降低人OA软骨细胞的凋亡率(P<0.05),提高细胞的增殖活力、S期比例和增殖指数(P<0.05),且对正常人软骨细胞的增殖活力和凋亡无明显影响.结论 HA可促进OA软骨细胞的分裂与增殖,降低细胞凋亡率,从而对软骨细胞发挥保护作用.
中国生物制品学杂志相关文献
  • 甲型肝炎病毒病毒样颗粒的制备

    目的 制备甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),为研制HAV VLPs疫苗奠定基础.方法 利用RT-PCR法从HAV HM175-clone4株中扩增P1-2A、P2和P3基因片段.将P1-2A和P3基因亚克隆至pFastBacDual载体,构建重组表达质粒pFastBacDual-P1-P3,转化大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-P1-P3,转染昆虫细胞sf-9进行重组杆状病毒的包装.重组杆状病毒vAcP1P3扩增后,感染昆虫细胞Tn-5,培养72 h后,收获表达产物,经原位免疫荧光、EIA、Western blot法及透射电镜检测HAV VLPs的表达.表达产物经超滤及蔗糖密度梯度离心纯化.结果 重组表达质粒和重组穿梭质粒分别经双酶切和PCR鉴定证明构建正确.第2、3、4代重组杆状病毒的滴度分别为1.58×105、2.13×107、3.98×107 TCID50/ml.vAcP1P3转染sf-9细胞72 h后,可见HAV蛋白的表达;vAcP1P3转染Tn-5细胞后,表达的HAV抗原主要存在于沉淀中,且含量明显高于野生型杆状病毒沉淀样品(P<0.001);Wentern blot结果表明,与野生型杆状病毒组相比,HAV VLPs样品中VP3的含量相对较少,HAV VLPs样品可见相对分子质量约30 700的VP1片段及相对分子质量约27 700的VP3片段;透射电镜观察可见大小约50 nm的VLPs颗粒,略大于天然HAV颗粒.纯化的HAV蛋白主要存在于40% ~ 50%的蔗糖梯度中,提示有VLPs形成.结论 成功制备了HAV VLPs,为甲肝新型疫苗的研制奠定了基础.

    作者:沈智俊;吴杰;解庭波;吕宏亮;王云;陈新文;严家新 刊期: 2013年第04期

  • 仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库的构建及初步筛选

    目的 构建仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,并进行初步筛选.方法 用仙台病毒Tianjin株免疫小鼠,制备脾细胞悬液,提取小鼠脾细胞总RNA,RT-PCR扩增鼠抗体轻链(κ链)和重链Fd基因,将轻链基因和噬菌粒p3MH经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后纯化回收,经T4 DNA连接酶连接,电转化E.coli XL1-Blue,构建轻链库;将重链Fd段基因和轻链库p3MH-κ经Spe Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,纯化回收并连接,电转化E.coli XL1-Blue,获得噬菌体抗体库,计算重组率和抗体库滴度.以仙台病毒Tianjin株重组蛋白HN2为抗原进行初步筛选,制备噬菌体抗体,并进行测序.结果 构建的免疫噬菌体抗体库库容为1.18×107,重组率为90%,制备的噬菌体抗体滴度为1011 pfu/ml;经初步筛选,噬菌体富集了约63.6倍,获得2株与重组蛋白HN2有结合活性的阳性克隆,经NCBIBLAST进行同源性分析,显示为鼠源性抗体,经IMGT分析,显示轻链基因与VK9亚群基因的同源性为94.87%,重链基因与VH7亚群基因的同源性为97.85%.结论 成功构建了仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,为该病毒株的诊断、疾病治疗及致病机制等研究奠定了基础.

    作者:李霞;李晓绵;石立莹;李梅 刊期: 2013年第04期

  • 透明质酸对人骨性关节炎软骨细胞凋亡及细胞周期的影响

    目的 观察透明质酸(Hyaluronic acid,HA)对人骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)软骨细胞凋亡及细胞周期的影响,以探讨HA保护软骨细胞的作用机制.方法 分离人正常软骨细胞和OA软骨细胞,传至第2代后,分别经HA处理24h,采用MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期.结果 HA能明显降低人OA软骨细胞的凋亡率(P<0.05),提高细胞的增殖活力、S期比例和增殖指数(P<0.05),且对正常人软骨细胞的增殖活力和凋亡无明显影响.结论 HA可促进OA软骨细胞的分裂与增殖,降低细胞凋亡率,从而对软骨细胞发挥保护作用.

    作者:李化光;刘华;孙洁;刘肃;张林西;王文;郭佳;赵琛;赵增虎 刊期: 2013年第04期

  • 改良维持液培养aG株狂犬病病毒制备病毒原液

    目的 通过改良维持液的缓冲体系,改进aG株狂犬病病毒的培养条件,制备高滴度的病毒原液.方法 在传统病毒维持液的基础上,补加缓冲盐和碳酸氢钠,在相同的条件下,分别用传统维持液和改良维持液培养病毒,收获2次病毒液,混合,经300 KD膜包超滤、Sepharose 4FF纯化后,制成病毒原液,采用ELISA法检测抗原含量,按《中国药典》三部(2010版)方法检测病毒滴度、效力、宿主DNA和宿主细胞蛋白残留量,用便携式pH计检测pH值.结果 改良维持液制备的病毒原液的抗原含量、病毒滴度及效力均高于对照维持液;两种维持液制备的病毒原液的宿主蛋白和宿主细胞DNA残留量均符合《中国药典》三部(2010版)要求;改良维持液的缓冲能力明显增强,对病毒培养过程中pH值的控制明显优于对照维持液.结论 改良维持液培养狂犬病病毒制备的病毒原液滴度较高,可改进传统aG株狂犬病病毒生产的病毒原液滴度较低的现状.

    作者:曹金良 刊期: 2013年第04期

  • 牛Ⅱ型链球菌van B2蛋白的原核表达及纯化

    目的 原核表达并纯化牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2蛋白.方法 采用PCR法从牛Ⅱ型链球菌基因组DNA中扩增van B2基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-van B2,转化大肠杆菌Rossata(DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经Ni柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果 PCR扩增获得597 bp的van B2基因片段;重组表达质粒pET-28a-van B2经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组van B2蛋白相对分子质量约为29 000,主要以可溶性形式表达;纯化的重组蛋白纯度为70%,可被小鼠抗牛链球菌血清Ⅱ型多克隆抗体特异性识别.结论 原核表达并纯化了牛Ⅱ型链球菌van B2蛋白,为van B2基因的耐药性研究奠定了物质基础.

    作者:刘燕;布日额;李艳军;白靓;锡林高娃;郭闯 刊期: 2013年第04期

  • CHO-DG44细胞瞬时转染条件的优化

    目的 优化CHO-DG44细胞瞬时转染的条件.方法 采用TubeSpin一次性生物反应器,以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)为报告基因,氯醚酰亚胺(Polyether imide,PEI)为转染试剂,将质粒pIRESneo3-eGFP瞬时转染CHO-DG44细胞,优化瞬时转染的基本条件[细胞密度、DNA浓度和DNA:PEI比例(w/w)]以及其他条件(换液、渗透压和温度),采用优化的条件转染质粒pIRESneo3-eGFP,流式细胞术检测细胞转染效率,生物发光仪检测相对荧光强度.结果 CHO-DG44细胞瞬时转染的佳条件为:采用XLG-P8培养基进行转染,细胞密度为2×106个/ml,DNA浓度为6.25μg/5 ml,DNA∶PEI(w/w)比例为1∶5;转染后4h更换新鲜培养基,添加30 mmol/L NaCl,并于31℃继续培养.在此条件下,CHO-DG44细胞的瞬时转染效率可达81.45%,相对荧光强度可达9×105 RFU/106 cells.结论 优化了CHO-DG44细胞瞬时转染的条件,为下一步药物蛋白的研发奠定了基础.

    作者:黎美香;陈先金;王晓慧;王亚玉;袁凤媚;汪才坤;谢秋玲 刊期: 2013年第04期

  • 大鼠结缔组织生长因子基因miRNA表达质粒的构建及其稳定转染大鼠肝星状细胞系的建立

    目的 构建大鼠结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)基因miRNA表达质粒,并建立稳定转染大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)系.方法 根据大鼠CTGF基因mRNA序列,设计并合成3对寡聚单链DNA X191-1、X191-2和X191-3及1对阴性对照序列DNA X191-4,将4对寡聚单链DNA退火成双链后,分别与载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建CTGF基因miRNA重组表达质粒,分别转染HSC-T6细胞,荧光显微镜观察细胞的转染效率,RT-PCR检测转染细胞中CTGF基因mRNA的转录水平;取干扰效率高的重组质粒及阴性对照质粒,分别转染HSC-T6细胞,经杀稻瘟菌素持续加压筛选.结果 经测序鉴定,重组表达质粒构建正确,插入片段的碱基序列与设计相符;细胞的瞬时转染效率约为50%;3组干扰质粒转染的HSC-T6细胞中,CTGF基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组(P<0.01),其中X191-2质粒对CTGF基因转录的干扰效率高;获得了稳定转染的HSC-T6细胞.结论 成功构建了CTGF基因miRNA表达质粒,并获得了稳定转染的肝星状细胞系,为进一步研究肝纤维化的形成机制及其治疗奠定了基础.

    作者:阳宏;李孝生;向颖;邢旎旎;沈艳 刊期: 2013年第04期

  • 结核分枝杆菌TB10.4与呼吸道合胞病毒F1蛋白的融合表达

    目的 在大肠杆菌中融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)TB10.4蛋白与呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白.方法 从MTB标准菌株H37Rv全基因组中扩增TB10.4(N/X)和TB10.4(N/B)基因,分别插入原核表达载体pET-28a和pET-30a中,构建重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4(N/B)/pET-30a;从F/18T/DH5α菌株中扩增F1(B/X)基因,与TB10.4(N/B)/pET-30a质粒连接,构建重组表达质粒TB10.4-F1/pET-30a;将质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a分别转化感受态E.coliBL21 (DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组TB10.4和TB10.4-F1蛋白相对分子质量约为13 000和59 000,可与鼠抗His单抗特异性结合.结论 成功在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白TB10.4-F1,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定了基础.

    作者:王瑞博;井申荣;曾韦锟;黄芬 刊期: 2013年第04期

  • 鼠疫噬菌体对感染鼠疫小鼠的疗效

    目的 观察鼠疫噬菌体对感染鼠疫小鼠的治疗作用,以寻找治疗鼠疫感染的新方法.方法 小鼠经皮下感染141株鼠疫菌建立鼠疫感染模型后,用效价为10-11的鼠疫噬菌体对短期治疗组在感染后3、6、12和24 h给予100μl/次的注射治疗,对长期治疗组在感染后1 ~7d连续注射鼠疫噬菌体,100 μl/次,1次/d.同时,设阴性对照组(不感染,只治疗,观察噬菌体对小鼠的毒性)和阳性对照组(仅感染,不治疗).结果 阴性对照组小鼠治疗14d后全部存活,处死后剖检未检出鼠疫菌.各治疗组小鼠在治疗第5天存活率为100%,与阳性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);长期腹腔治疗组效果明显,鼠疫噬菌体在小鼠体内存活时间长,效价不降低.结论 鼠疫噬菌体对感染小鼠急性感染期的治疗有一定效果,长期腹腔注射治疗效果较好,为其进一步应用于抗感染治疗提供了实验依据.

    作者:张珊瑚;祁芝珍;张青雯;赵海红;辛有全;金泳;仇杰 刊期: 2013年第04期

  • 穿心莲内酯对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤中NF-κB信号通路的影响

    目的 探讨穿心莲内酯(Andrographolide,AP)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)中NF-κB信号通路的影响.方法 将雄性C57BL/6小鼠随机分为3组:空白对照组、LPS组和AP+ LPS组.AP+ LPS组腹腔内注射10 mg/kg的AP,空白对照组腹腔内注射等体积的NS,2次/d,连续3d,第3天注射后2h,LPS组和AP+ LPS组气管内雾化吸入LPS(1 mg/kg),空白对照组气管内雾化吸入等剂量的NS,12 h后处死小鼠,开胸取肺,10%甲醛溶液固定,随后进行石蜡切片及常规HE染色,光镜下观察各组小鼠肺组织的病理学变化;免疫组化法观察肺组织中血管细胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)蛋白的表达;Western blot法检测肺组织中磷酸化抑制蛋白IκB (Phospho-inhibitor of κB,p-IκBα)和p-NF-κB (P65)蛋白的表达.结果 LPS组小鼠肺损伤明显,有明显的炎症反应;AP+ LPS组小鼠肺损伤明显减轻,炎症细胞浸润明显减少.与LPS组相比,AP+ LPS组小鼠肺组织中VCAM-1蛋白的表达明显抑制;p-IκBα和p-NF-κB(P65)蛋白的表达明显降低(P<0.05).结论 AP可通过抑制磷酸化的IκBα的降解及P65单体的磷酸化来调节NF-κB通路,从而减轻小鼠肺损伤的炎症变化.

    作者:管弦;朱涛;王导新 刊期: 2013年第04期

  • 抗人CD4嵌合抗体的稳定表达及鉴定

    目的 构建抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株,并对表达产物进行鉴定.方法 采用脂质体法将抗人CD4嵌合抗体质粒pHDC4稳定转染CHO-DHFR-细胞,经选择性培养、有限稀释法克隆和MTX加压筛选抗人CD4嵌合抗体稳定表达株,经细胞工厂扩大培养.收集培养上清,经Protein A亲和层析纯化目的抗体,激光共聚焦显微镜观察抗体基因在细胞内的表达,并分别进行质谱分析、蛋白质N-末端测序和平衡解离常数(KD)的测定.结果 构建的抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株的抗体表达水平为4.29 ~ 10.52 μg/ml;BCA测得纯化回收后的抗体表达水平为12.68 mg/L;激光共聚焦检测显示,抗CD4嵌合抗体稳定表达细胞株可稳定表达人的恒定区和鼠的可变区;质谱分析表明,其含有鼠源性和人源性成分;蛋白质N-末端氨基酸测序表明,其轻链与亲本抗体N-末端氨基酸序列完全一致;其KD为2.67×10-9M.结论 成功构建了抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株,其表达的抗人CD4嵌合抗体保留了亲本抗体的抗原结合特异性和亲和力.

    作者:胡迪超;张爱华;杨晓明 刊期: 2013年第04期

  • 慢病毒介导的人乳头瘤病毒16型E6基因shRNA对荷瘤裸鼠宫颈癌生长的抑制作用

    目的 探讨慢病毒介导的人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16型E6基因shRNA在体内对荷瘤裸鼠宫颈癌生长的抑制作用.方法 将BALB/c-nu裸鼠随机分为空白对照组、干扰组和无义干扰组,经皮下接种宫颈癌Caski细胞(2×106个),移植瘤直径达0.5 cm时,空白对照组于瘤体局部注射PBS,干扰组和无义干扰组分别于瘤体局部注射靶向HPV16型E6基因的shRNA-PLL3.7干扰慢病毒和无义干扰慢病毒(3×108 TU/ml),2周后检测瘤体大小和重量的变化,采用免疫组化法检测肿瘤组织中HPV16型E6、P53和P21蛋白的表达.结果 与无义干扰组和空白对照组比较,干扰组裸鼠体内肿瘤明显缩小,瘤体重量明显降低(P<0.000 1),无义干扰组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);干扰组肿瘤组织中HPV16型E6蛋白的表达被抑制,P53和P21蛋白的表达水平明显升高.结论 慢病毒介导的HPV16型E6基因shRNA能有效抑制动物体内宫颈癌的生长,具有潜在的开发应用前景.

    作者:白垚;郭建新;崔舫;郑秀惠 刊期: 2013年第04期

  • 柔嫩艾美耳球虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因核酸疫苗的免疫保护效果

    目的 观察柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor,Serpin)基因核酸疫苗对E.tenella感染雏鸡的免疫保护效果.方法 取14日龄雏鸡,随机分为7组:pVAX 1-Serpin高剂量组(100 μg/只)、pVAX1-Serpin中剂量组(50 μg/只)、pVAX1-Serpin低剂量组(25μg/只)、pVAX1组(50μg/只)、E.tenella卵囊组(15日龄时,口服5 000个卵囊/只,不加强免疫)、未免疫攻虫对照组(0.1 ml PBS)和未免疫未攻虫对照组(0.1 ml PBS),除E.tenella卵囊组外,均经胸肌注射免疫,21日龄时加强免疫1次,28日龄时,除未免疫未攻虫对照组外,均经口感染1×104个E.tenella孢子化卵囊.攻虫后第8天剖杀,计算各组的存活率、平均增重、相对增重率、盲肠病变减少率、卵囊减少率及抗球虫指数(Anticoccidial index,ACI).结果 未免疫攻虫对照组和pVAX1组的存活率分别为75%和70%,其余各组的存活率均为100%.pVAX1-Serpin高、中剂量组、E.tenella卵囊组和未免疫未攻虫对照组的平均增重2均较未免疫攻虫对照组显著增加(P<0.05),其中pVAX1-Serpin高剂量组相对增重率2达95.26%;E.tenella卵囊组、pVAX1-Serpin高、中剂量组的盲肠病变记分明显低于pVAX1组和未免疫攻虫对照组(P<0.05),前两组病变减少率较高;各免疫组卵囊产量均较未免疫攻虫对照组显著下降(P<0.05),pVAX1-Serpin高剂量组卵囊减少率达67.04%;各免疫攻虫组ACI值均高于未免疫攻虫对照组,其中E.tenella卵囊组高(181.23),pVAX1-Serpin高剂量组次之(166.26),而pVAX1-Serpin中、低剂量组和pVAX1组均小于160.结论 高剂量pVAX1-Serpin对鸡E.tenella感染具有一定的免疫保护作用.

    作者:李文超;顾有方;杜玲;宫鹏涛;李建华;张西臣 刊期: 2013年第04期

  • 酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎和乙型肝炎抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用

    目的 探讨酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎(简称甲肝)和乙型肝炎(简称乙肝)抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用,并对皮下和鼻腔接种的免疫效果进行比较.方法 将酵母多糖与角鲨烯按一定比例混合,制成复合佐剂,将不同剂量的复合佐剂与HBsAg混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8、16周,采用ELISA法检测小鼠血清中抗HBsAg IgG抗体水平,筛选复合佐剂的佳免疫剂量.以复合佐剂的佳免疫剂量与甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、甲肝抗原对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8周检测小鼠血清中抗甲肝抗原IgG抗体水平.以复合佐剂佳免疫剂量分别与HBsAg和甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组和甲肝抗原对照组,经鼻腔免疫ICR小鼠,共免疫3次,间隔2周,分别于末次免疫后4、8周检测小鼠血清中抗HBsAg和甲肝抗原IgG抗体水平.在试验期间,对小鼠的健康状况进行观察,并对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行病理分析.结果 酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对HBsAg的佳免疫剂量为2 mg酵母多糖+8μl角鲨烯,该组抗体水平明显高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组(P<0.05);复合佐剂对甲肝抗原也有较好的体液免疫增强作用,抗体水平显著高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组(P<0.05);复合佐剂通过鼻腔免疫,对HBsAg和甲肝抗原的体液免疫应答也有增强作用,但效果不如皮下免疫,甲肝抗原鼻腔免疫效果优于HBsAg(P<0.05).在试验期内,小鼠均未出现异常反应,各器官均未发生病变.结论 酵母多糖-角鲨烯复合佐剂能显著增强甲肝和HBsAg抗原对小鼠的体液免疫应答,免疫效果优于铝佐剂;皮下免疫效果优于鼻腔免疫;在免疫剂量范围内,复合佐剂安全性良好.

    作者:王丽萍;王越;王海漩;胡云章;胡凝珠 刊期: 2013年第04期

  • 重组人粒细胞集落刺激因子的生物学活性分析

    目的 评价近年重组人粒细胞集落刺激因子(Recombinant human grenulocyte colony-stimulatiny factor,rhG-CSF)的生物学活性及其检测方法的应用情况.方法 采用mNFS-60细胞/MTT比色法对41批不同来源的rhG-CSF进行生物学活性检测,对中国食品药品检定研究院与各生产企业的检测结果进行比较,评价中国食品药品检定研究院检测rhG-CSF生物学活性结果的可信性.结果 37批国产rhG-CSF的生物学活性检测结果均符合《中国药典》三部(2010版)质量要求,4批进口rhG-CSF的生物学活性均符合进口拟定质量标准(JS20070016)要求.中国食品药品检定研究院与各企业的rhG-CSF生物学活性检测结果差异均无统计学意义(P>0.05).结论 近年上市的rhG-CSF生物学活性达到《中国药典》三部(2010版)质量要求;该制品的生物学活性检测方法在全国范围内应用情况良好.

    作者:刘兰;史新昌;饶春明 刊期: 2013年第04期

  • 重庆地区5岁以内儿童腹泻病毒病原及流行病学特点

    目的 了解重庆地区5岁以内儿童腹泻病毒病原及流行病学特点.方法 收集重庆医科大学附属儿童医院2010年8~11月就诊的5岁以内腹泻患儿的粪便标本共500份,采用胶体金法检测A组轮状病毒(Rotavirus,RV),RT-PCR法检测B、C组RV、诺如病毒(Norovirus,NV)G Ⅰ和GⅡ、肠道腺病毒(Adenovirus,ADV)、札如病毒(Sapovirus,SLV)和星状病毒(Astrovirus,ASV),取NV和SLV阳性PCR产物测序,并对病毒基因进行分型.采用MEGA 5.05软件构建进化树,Kimura's two-parameter法计算遗传距离,邻接法(Neighbor-joining)boot-strap重复检验1 000次.结果 500份标本中,检测到A组RV阳性标本134份,阳性率为26.8%; NV GⅡ型阳性标本132份,阳性率为26.4%; ADV阳性标本31份,阳性率为6.2%; SLV阳性标本9份,阳性率为1.8%;ASV阳性标本1份,阳性率为0.2%;未检测到B、C组RV和NV GⅠ型.随机选择22份NV阳性标本进行测序及基因分型,其中GⅡ/4占绝对优势,其次为GⅡ/6、GⅡ/2、GⅡ/3和GⅡ/7.SLV可分为4个基因亚型,其中GⅠ/1为优势株,其次为GⅠ/2、GⅡ/1和GⅠV1.结论 重庆地区5岁以下儿童腹泻以病毒感染为主,RV是主要的病原体,其次为NV、ADV、SLV和ASV.

    作者:任增志;孔元梅;王倩倩;黄爱龙;钟晓妮;许红梅 刊期: 2013年第04期

  • 重组EB病毒Zta蛋白的原核表达及纯化

    目的 原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化.方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n.用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清.将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件.表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确.表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000; IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6h,目的蛋白的表达量高,占菌体总蛋白的30%以上;重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达.纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95%,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应.结论 在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础.

    作者:孙静;傅晶晶;蔡泓志;施建东;石怀生;胡云章;胡凝珠 刊期: 2013年第04期

  • 全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性

    目的 在毕赤酵母中表达全长甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)(1-34)与人血清白蛋白(Human serum albumn,HSA)的融合蛋白PTH(1-34)-HSA,并检测其活性.方法 在质粒pPIC9K-PTH(1-34)2-HSA的基础上设计引物,引入6His标签及肠激酶酶切位点,从该质粒中扩增6His-EK-PTH(1-34)-HSA基因,插入pPIC9K载体中,构建重组表达质粒pPIC9K-6His-EK-PTH(1-34)-HSA,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达;表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白通过两步亲和层析纯化和肠激酶酶切,获得全长的PTH(1-34)-HSA融合蛋白;检测融合蛋白对UAMS-32P成骨细胞增殖活力、碱性磷酸酶活性以及RANKL和OPG基因转录水平的影响.结果 重组表达质粒经测序证实构建正确;表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白相对分子质量约70 000,可与PTH抗体和HSA抗体特异性结合,发酵 获得的融合蛋白的浓度为200 mg/L;纯化的融合蛋白可与抗PTH、HSA和6His标签抗体特异性结合,经肠激酶酶切后,该蛋白失去了与6His抗体反应的能力,保持了与PTH和HSA抗体结合的能力;酶切后的全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白保持了PTH的生物活性,能促进UAMS-32P成骨细胞的增殖活力,提高细胞的碱性磷酸酶的活性,上调细胞RANKL基因的转录水平以及抑制OPG基因的转录水平.结论 成功在毕赤酵母中表达了全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白,有望提高PTH的成药性.

    作者:李俊毅;彭林;唐存多;邬敏辰;金坚 刊期: 2013年第04期

  • 流感疫苗血凝素含量检测方法的研究进展

    目前流感疫苗血凝素含量常用的检测方法是单向免疫扩散法(Single-radial immunodiffusion,SRID).为了解决大流行流感发生初期无法获得参考品的情况,提高流感血凝素检测方法的灵敏度、重复性、准确性,人们从物理化学和免疫化学两个方面对SRID的替代方法进行了探索性研究.本文对近1 0年来对流感疫苗血凝素含量测定方法的研究进展作一简要综述.

    作者:刘朝阳;孟佳帆;程鹏飞 刊期: 2013年第04期

  • 高效阴离子交换色谱-脉冲安培法测定W135群和Y群脑膜炎球菌多糖中半乳糖和葡萄糖含量

    目的 采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培法(High-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection,HPAEC-PAD)测定W135群和Y群脑膜炎球菌荚膜多糖中半乳糖和葡萄糖的含量,并对该方法进行验证及初步应用.方法 多糖蛋白结合物原液的混合液经HC1水解处理后,进样CarboPac PA10柱,以氢氧化钠-醋酸钠梯度流洗,脉冲积分安培检测器检测.筛选样品的水解条件;对HPAEC-PAD法进行专属性、精密性及准确性验证,并进行初步应用.结果 确定的样品水解条件为以2 mol/L HCl于85℃处理1h.载体蛋白破伤风类毒素对检测结果无干扰;重复性、日内精密性和不同操作者之间精密性试验结果的RSD均小于5%;准确性试验中葡萄糖和半乳糖的回收率在90% ~ 110%之间.HPAEC-PAD法测定多糖蛋白结合物原液的多糖含量与传统间苯二酚比色法测定结果相当;成品疫苗中的W135群和Y群多糖含量测定结果符合《A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗制造及检定规程草案》的规定(均≥4 μg/剂).结论 HPAEC-PAD法专属性、精密性和准确性良好,可用于A、C、W135、Y群脑膜炎球菌结合疫苗中W135群和Y群多糖含量的测定.

    作者:李冶珊;刘梅影;陈敬;林海涛;王平 刊期: 2013年第04期

中国生物制品学杂志

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