沈冰蕾；刘博洋；赵志辉；杨润军
目的 在缺氧环境下,探讨缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-lα,HIF-1α)与Wnt/β-catenin信号通路在胃癌细胞SGC-7901中的相互作用.方法 将质粒β-catenin-micRNA转染SGC-7091细胞,筛选稳定转染细胞株SGC-7901-β-catenin-micRNA.将SGC-7901细胞分为对照组、脂质体组和阴性对照组,对照组:常氧培养48 h;脂质体组:常氧培养24 h后,加入10μl脂质体,培养24 h;阴性对照组:常氧培养24 h后,转染阴性对照质粒,培养24 h;设稳定转染细胞株为干扰组,常氧培养48 h.采用倍增时间试验、平板克隆形成试验及流式细胞术检测各组细胞倍增时间、平板克隆集落数及细胞周期的变化.另取SGC-7901细胞,分为对照组、缺氧组、双重缺氧组;对照组:常氧培养48 h;缺氧组:常氧培养32 h,物理缺氧培养16 h;双重缺氧组:常氧培养24 h,化学缺氧培养8h后,再同时物理缺氧培养16h.同时取稳定转染细胞株,分为对照干扰组、缺氧干扰组和双重缺氧干扰组.对照干扰组:常氧培养48 h;缺氧干扰组:常氧培养32 h,物理缺氧培养16 h;双重缺氧干扰组:常氧培养24 h,化学缺氧培养8h后,再同时物理缺氧培养16h.采用RT-PCR和Western blot法检测各组细胞中HIF-1α、β-catenin的mRNA及蛋白的表达水平.结果 与对照组、脂质体组、阴性对照组比较,干扰组倍增时间延长,平板克隆集落数减少,细胞阻滞在G1期比例增加,S期减少,差异均有统计学意义(p＜0.05).缺氧组与对照组、双重缺氧组与缺氧组、缺氧干扰组与对照干扰组及双重缺氧干扰组与缺氧干扰组相比,HIF-1α、β-catenin的mRNA及蛋白表达水平均升高,差异有统计学意义(P均＜0.05).缺氧干扰组与缺氧组及双重缺氧干扰组与双重缺氧组比较,β-catenin、HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平均降低,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 HIF-1α激活可调控Wnt/β-catenin通路,但也受控于Wnt/β-catenin通路,二者之间相互影响,相互调节.
作者：刘洪兰；张俊文 刊期： 2013年第05期
目的 构建携带血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)基因的重组杆状病毒,并利用Bac-to-Bac重组杆状病毒表达系统进行表达.方法 将重组杆粒bacmid-P1-2A-4AngⅡs-3ABC (rB/HAngⅡ)转染昆虫细胞sf9,包装出重组杆状病毒rBac-P1-2A-4AngⅡs-3ABC(rBAV),通过光学显微镜和透射电镜观察细胞病变(CPE)及病毒形态,采用蚀斑试验检测病毒滴度,PCR及间接免疫荧光技术验证该病毒及感染细胞中AngⅡ和HAV蛋白的表达.结果 重组杆粒rB/HAngⅡ转染sf9细胞96 h后,出现典型的CPE;透射电镜下观察可见典型的杆状病毒颗粒;PCR可特异性的扩增出约3 000和1 000 bp的P1-2A-4AngⅡs和3ABC基因片段;P3代重组杆状病毒滴度约为4×108 pfu/ml;感染后的sf9细胞中可见特异性的绿色荧光(AngⅡ蛋白)和红色荧光(HAV结构蛋白).结论 已成功构建了携带AngⅡ基因的重组杆状病毒,并在sf9细胞中获得表达,为研制抗高血压疫苗提供了新的思路.
作者：欧霞；Yuri Kusov；郭莉莉；米锴；吴晋元；尹娜；张光明；李鸿钧；孙茂盛 刊期： 2013年第05期
目的 探讨蛋白酶激活受体-2(Protease activated receptor-2,PAR-2)在胃间质瘤组织中的表达及其与胃间质瘤临床病理特征之间的相关性.方法 采用RT-PCR、Western blot及免疫组化法检测PAR-2在72例胃间质瘤患者的瘤中心组织、瘤旁组织及正常胃组织中的表达,并分析其与胃间质瘤临床病理特征之间的相关性.结果 瘤旁组织和瘤中心组织中PAR-2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显高于正常组织(P＜0.05或P＜0.01),瘤中心组织中的表达水平明显高于瘤旁组织(P＜0.01).瘤中心组织中PAR-2基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均随着NIH分级的升高而上调(P＜0.05或P＜0.01),且与黏膜受侵情况密切相关(P＜0.05).结论 胃间质瘤组织中PAR-2的表达水平明显高于瘤旁组织和正常胃组织,PAR-2的高表达可能与间质瘤的侵袭与转移相关.
作者：王贵军；邓蓓蓓；王玉彬；李迪诺 刊期： 2013年第05期
目的 构建犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白重组人5型腺病毒.方法 将从CPV中PCR扩增的VP2基因克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA中,经酶切及测序鉴定,将构建正确的重组穿梭质粒pacAd5-cVP2与骨架质粒pacAd5 9.2-100经Pac Ⅰ酶切线性化,共转染293AD细胞,进行同源重组,包装出重组腺病毒rAd5v-cVP2,按Karber法计算重组腺病毒的病毒滴度(TCID50).电镜下观察重组腺病毒的形态;RT-PCR及Western blot法检测CPV VP2基因mRNA的转录及蛋白的表达水平.结果 重组穿梭质粒pacAd5-cVP2经酶切及测序证明构建正确;包装出的重组腺病毒rAd5v-cVP2的病毒滴度可稳定在108.25 TCID50/ml;电镜下观察可见典型的腺病毒外型特征;重组腺病毒感染的293AD细胞可检测到VP2基因的转录和表达.结论 已成功构建了CPV VP2蛋白重组人5型腺病毒.
作者：杨洋；宫婷；米立娟；赵敬慧；陈奇；钱方；刘晔；张守峰；扈荣良 刊期： 2013年第05期
目的 探讨尿苷二磷酸(Uridine diphosphate,UDP)与尿苷三磷酸(Uridine triphosphate,UTP)两种佐剂对HAV抗原和HBsAg诱导小鼠体液免疫应答的影响.方法 分别在HBsAg(1 μg)和HAV抗原(18 EU)中加入不同浓度的UDP和UTP(HBsAg组:UDP和UTP均500μg及1、2、5、10 mg,HAV抗原组:UDP和UTP均500 μg及1、2mg),均经腹部皮下多点注射免疫ICR小鼠(HBsAg组:2针,间隔2周,0.1ml/只;HAV抗原组:单针免疫,0.2ml/只),并设空白对照组(生理盐水100μl)、抗原组对照组(HBsAg 1 μg;HAV抗原18 EU)、铝佐剂组对照组(铝佐剂300μg)、UDP+铝佐剂复合组(HBsAg 1μg+铝佐剂300 μg+UDP 2 mg;HAV 18 EU+铝佐剂300 μg+UDP 2 mg)和UTP+铝佐剂复合组(HBsAg 1 μg+铝佐剂300 μg+ UTP 2 mg;HAV 18 EU+铝佐剂300 μg+ UTP 2 mg),分别于末次免疫后(HBsAg组:第4、8、12和16周;HAV抗原组:第4、8、12周)采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中抗-HBsAg IgG和抗-HAV IgG水平.免疫18周后,分别取HBsAg组中UDP和UTP佳浓度组及空白对照组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏及肺组织进行病理观察.结果 除空白对照组小鼠血清检测不到抗-HBsAg IgG外,其余各组小鼠血清抗-HBsAg IgG及抗-HAV IgG水平均在第8周达到峰值,以后逐渐下降.末次免疫后,UDP及UTP各组抗-HBsAg IgG及抗-HAV IgG水平均高于抗原对照组,差异均有统计学意义(P均＜0.05).HBsAg组UDP+铝佐剂复合组产生的IgG水平明显高于抗原对照组、铝佐剂对照组及UDP和UTP各浓度组(P＜0.05);HAV抗原组UTP+铝佐剂复合组产生的IgG水平明显高于抗原对照组、铝佐剂对照组及UDP和UTP各浓度组(P＜0.05).在两种抗原中,UDP和UTP的佳浓度均为2 mg/只.在设置的浓度范围内,UDP和UTP佐剂均未观察到毒性反应.结论 UDP和UTP均能明显增强HBsAg及HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答.
作者：王越；王丽萍；王海漩；胡凝珠；胡云章 刊期： 2013年第05期
近年来国内外以干细胞为主的细胞治疗研究发展迅速,在治疗退行性疾病、缺血性心脑血管疾病、肝硬化及糖尿病等领域已开展了多项临床试验研究,但作为新型治疗性产品,干细胞产品在治疗的安全性和有效性方面还存在若干风险因素.本文对常见的干细胞种类、特性以及与临床应用相关的内在和外在风险因素进行了综述,旨在以现有的理论和技术条件,探讨治疗性干细胞产品基本的质量控制要求和策略.
作者：袁宝珠 刊期： 2013年第05期
目的 建立人干扰素诱导跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,IFITM)1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法.方法 根据GenBank中登录的人IFITM1、2、3及β-actin基因序列,分别设计4对特异性引物,以质粒pVAX 1-IFITM 1、2、3和pMD 18-T-β-actin为模板,分别进行PCR及实时荧光定量PCR扩增,优化实时荧光定量PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线及扩增曲线,建立实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的重复性、灵敏度及特异性.结果 各质粒的PCR及实时荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见大小与理论值相符的特异性条带.IFITM1、2、3和β-actin的佳荧光定量PCR引物浓度分别为0.2、0.5、0.4和0.5μl,佳退火温度为55℃.各质粒标准曲线的循环数与起始模板拷贝数的相关性均较好(R2分别为0.998、0.990、0.990和0.995),扩增效率分别为106.284％、101.030％、104.929％和101.962％.IFITM1、2、3基因不同拷贝数的试验内CV为0.14％～0.72％,试验间CV为0.77％ ～ 1.58％;灵敏度分别为2.52×100、1.3×100和3.7×101 copies;该方法未扩增出鸡肝脏及禽流感病毒H3N2 cDNA,可特异性扩增B型流感病毒cDNA,各标准质粒的溶解曲线约在同一温度出现1个单峰.结论 已成功建立了IFITM1、2、3基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法具有较高的重复性、灵敏度及特异性,为进一步研究IFITM1、2、3的功能及其基因表达与肿瘤发生发展的相关性奠定了基础.
作者：袁森；田明尧；崔鹤馨；靖杰；刘昊；刘存霞；任静强；姜庆利；薛斐 刊期： 2013年第05期
目的 调查输注单采血小板发生输血不良反应相关因素,为制定预防措施提供依据.方法 收集广东省东莞市某医院2012年5～6月间,输注单采血小板后引发输血不良反应临床病例13例作为研究组,同时随机选择同期输注单采血小板未发生输血不良反应的临床病例16例作为对照组,根据受血者和献血者的基本信息设计调查方案.受血者基本信息包括:性别、年龄、输血史、药物史及外周血细胞变化(包括输血前后白细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞、单核细胞的绝对值之差以及血小板回收率和输血后血浆球蛋白含量);献血者基本信息包括:性别、年龄、献血次数、血小板输注前保存时间、血小板采集机型、循环量、献血前白细胞计数、献血过程中有无献血不良反应.对收集数据进行统计学分析.结果 研究组输注单采血小板发生输血不良反应的受血者的年龄、性别、输血史、药物史、血小板回收率、输血前后白细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞、单核细胞的绝对值之差、输血后血浆球蛋白含量与对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);研究组血小板输注前保存时间、献血者性别、年龄、献血次数、血小板采集机型、循环量、献血前白细胞计数与对照组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 输注单采血小板发生输血不良反应与受血者和献血者自身因素、受血者外周血细胞数量变化及血浆球蛋白含量无关.推测导致输注单采血小板而发生输血不良反应的主要因素为异源血浆蛋白的输入,推荐临床对已发生输血不良反应需再次输注血小板的患者应选择洗涤血小板.
作者：刘赴平；何子毅；祁妙华；刘仁强；韩忠朝 刊期： 2013年第05期
目的 探讨氢氧化锌与硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)复合佐剂对狂犬病疫苗诱导的小鼠体液免疫应答的影响.方法 取64只ICR小鼠随机分为8组,每组8只,分别为复合佐剂(0.27 mg氢氧化锌,100 μg HS,0.125 IU狂犬病疫苗)1、2、3次免疫组,狂犬病疫苗1、2、3次免疫组,狂犬病疫苗常规5次免疫组,生理盐水对照组.均经小鼠胫骨前肌免疫,除狂犬病疫苗常规5次免疫组于0、3、7、14、28 d进行免疫外,其他各组均为隔周免疫.分别于初免疫后1、2、3、4、8、12、16周经尾静脉采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中抗-狂犬病毒(Rabies virus,RABV)IgG水平.结果 初免后1周,除生理盐水对照组小鼠血清未检测到抗-RABV IgG外,各实验组均产生抗-RABV特异性IgG;所有复合佐剂组在初免后3周均可产生高水平的IgG,初免后12周反弹性升高达到峰值,第16周仍维持较高水平.初免后1、2、3、4、8、12、16周,复合佐剂1、2、3次免疫组IgG水平均高于狂犬病疫苗相同次数免疫组,差异均有统计学意义(P均＜0.05),且IgG水平持续时间较长.初免后2周,复合佐剂2、3次免疫组的IgG水平均高于狂犬病疫苗常规5次免疫组(3次免疫后);初免后3周,复合佐剂3次免疫组的IgG水平高于狂犬病疫苗常规5次免疫组(4次免疫后)(P均＜0.05).结论 氢氧化锌和HS复合佐剂能增强狂犬病疫苗诱导的小鼠体液免疫应答.
作者：蔡泓志；孙静；王海漩；胡凝珠；胡云章 刊期： 2013年第05期
目的 分析钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)基因多态性与西门塔尔杂交牛胴体和肉质性状的相关性.方法 选取95头西门塔尔杂交牛,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(Restriction fragment length polymor-phism-polymerase chain reaction,RFLP-PCR)对CAST基因外显子1(Exon1)和外显子5(Exon5)区域的片段的多态性进行检测,并对突变位点与西门塔尔肉牛胴体和肉质性状的相关性进行分析.结果 在所分析的片段中,仅引物4扩增的片段(Exon1)存在一个G→C碱基的置换突变(E1 256 g＞c),为同义突变;该突变位点为Ras Ⅰ酶的自然酶切位点,酶切后存在GG、GC和CC 3种基因型,CC基因型与西门塔尔牛的净肉率性状显著相关(P＜0.05),而对其他胴体和肉质性状无显著影响.结论 CAST基因Exon1处存在的突变位点与西门塔尔肉牛的净肉率显著相关,因此该位点将有助于筛选与牛肉质相关的辅助选择标记,该基因将为鉴定与肉质相关的功能基因提供参考.
作者：沈冰蕾；刘博洋；赵志辉；杨润军 刊期： 2013年第05期
目的 优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量.方法 采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性.结果 确定适自诱导培养条件为装瓶量20ml/250ml、接种量2％,28℃诱导25 h;适自诱导培养基组分为:蛋白胨2％、酵母浸粉0.5％、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05％、甘露醇1％、乳糖0.6％、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L.此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87％提高至98％.结论 优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考.
作者：丛楠；卢士英；任洪林；李岩松；翟新新；柳增善 刊期： 2013年第05期
目的 构建表达肝细胞黏附分子(Hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因的重组腺病毒质粒,并进行鉴定.方法 以质粒pEGFP-N2-hepaCAM为模板,PCR扩增hepaCAM基因,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-hepaCAM经Pme Ⅰ线性化,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中进行同源重组.重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM经Pme Ⅰ线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒AdI-hepaCAM,经大量扩增后,检测病毒滴度.RT-qPCR及Westernblot检测感染的BIU-87细胞内hepaCAM的表达.结果 酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM构建正确,重组腺病毒AdI-hepaCAM滴度可达1.6×1012pfu/ml,与空载体腺病毒组比较,经重组腺病毒感染的BIU-87细胞中hepaCAM mRNA及蛋白的表达均明显升高(P＜0.05).结论 已成功构建携带hepaCAM的重组腺病毒载体AdI-hepaCAM,为研究hepaCAM基因对膀胱癌细胞增殖的调控提供依据.
作者：陶佳；王秋菊；范砚茹；杜红飞；宋学东；罗春丽；吴小侯 刊期： 2013年第05期
目的 建立负载Ag+ D72树脂色谱柱分离纯化花生四烯酸(Arachidonic acid,AA或ARA)的工艺.方法 采用负载Ag+ D72树脂色谱柱对微生物油脂中的ARA进行分离纯化,确定佳分离纯化参数,利用气相色谱法检测ARA的含量.结果 负载Ag+ D72树脂的大饱和吸附量约为9 mg/g干树脂,在吸附温度0℃、不饱和脂肪酸甲酯上样质量浓度5 mg/ml,5％丙酮正己烷溶液(体积比)洗脱、解吸温度30℃、洗脱流速2ml/min的条件下,ARA的纯度达89.4％,收率达79.3％.结论 负载Ag+ D72树脂色谱柱可有效分离纯化微生物油脂中的ARA,为进一步生产高纯度的ARA,进而规模化生产ARA产品提供了参考.
作者：齐佳；于长青 刊期： 2013年第05期
目的 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小鼠可溶性IL-5α受体(Soluble IL-5 receptor α,sIL-5Rα)蛋白,并对其抗原性进行鉴定.方法 应用Vector NTI AdvanceⅡ软件优化小鼠IL-5Rα基因胞外区密码子后合成序列,将sIL-5Rα克隆至pFastbacI中,构建重组穿梭质粒pFastbacI-sIL-5Rα,转化感受态大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆粒Bacmid-sIL-5Rα,转染sf9细胞,通过异源基因重组获得杆状病毒,采用Reed-Muench法检测扩增后病毒滴度;将P3、P4代病毒以0.05 MOI感染sf9细胞,SDS-PAGE鉴定sIL-5Rα蛋白的表达,表达产物应用阳离子交换层析法进行纯化,并对纯化的sIL-5Rα蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果 重组杆粒Bacmid-sIL-5Rα经PCR鉴定,证明构建正确;P3代重组杆状病毒的病毒滴度为1.7× 107pfu/ml;表达及纯化的sIL-5Rα蛋白在相对分子质量约43 000处可见特异蛋白条带,感染的sf9细胞裂解上清可与兔抗小鼠IL-5Rα多克隆抗体发生特异性反应.结论 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了小鼠可溶性IL-5Rα受体蛋白,为进一步研究其生物学功能及在哮喘模型动物中的治疗作用奠定了实验基础.
作者：张悦鸣；段跃强；罗德炎；姚惠娟；王希良；李志奎 刊期： 2013年第05期
目的 探讨JY佐剂对人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV) 18型L1蛋白病毒样颗粒(Virus-likeparticle,VLP)黏膜免疫效果的影响,并观察鼻腔反复免疫后与HPV58、11和6型的免疫交叉反应.方法 用含或不含JY佐剂的HPV18 L1 VLP分别经肌肉和鼻腔免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组,于第0、3、6周各免疫1次,免疫后第2、5、8周采血,ELISA法检测血清IgG抗体滴度;于第8周分离脾淋巴细胞并收集呼吸道灌洗液,采用IFNγELISPOT试剂盒检测细胞免疫效果,ELISA法检测黏膜免疫效果;鼻腔免疫各组取5只小鼠,继续免疫10次,每次间隔3周,收集第14、20、26、32和38周的血清,ELISA法检测HPV18 L1蛋白与HPV58、11和6型的免疫交叉反应.结果 免疫3次后,不含或含有佐剂的HPV18 L1蛋白经肌肉免疫后的血清IgG抗体滴度(均为104.6)高于经鼻腔免疫后的血清IgG抗体滴度(分别为101.9和102.8).含有佐剂的HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫后呼吸道灌洗液中sIgA抗体浓度(30.06 μg/ml)明显高于不含佐剂的HPV18 L1蛋白鼻腔免疫组(23.47 μg/ml)(P＜0.01),但肌肉免疫组未检测到sIgA抗体.含有佐剂的HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫诱导的细胞斑点数明显高于不含佐剂的HPV18 L1蛋白鼻腔免疫组(P＜0.01),不含佐剂与含佐剂的HPV18 L1蛋白肌肉免疫组诱导的细胞斑点数差异无统计学意义(P＞0.05).HPV18 L1免疫小鼠后的血清与HPV58、11和6型之间均有交叉反应,在第32周血清特异性IgG抗体滴度高.结论 HPV18 L1 VLP经肌肉免疫后,其血清抗体水平高于鼻腔免疫组,但该蛋白鼻腔免疫后细胞免疫反应和黏膜sIgA抗体水平均高于肌肉免疫组;JY佐剂能增强HPV18 L1蛋白经鼻腔免疫后的小鼠细胞反应及黏膜sIgA抗体应答,但肌肉免疫组佐剂作用不明显;HPV18 L1蛋白反复鼻腔免疫后,可拓宽抗原保护谱.
作者：麻粉莲；袁武梅；张骞；郑文芝；赵智慧；郑丽舒 刊期： 2013年第05期
目的 通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因.方法 根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD 19-T连接后,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序.结果 重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变.结论 重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础.
作者：叶程；邵坤彦；王亚南；覃桂；代风娇；何冬兰 刊期： 2013年第05期
目的 探讨人骨形态发生蛋白9(Human bone morphogenetie protein 9,hBMP9)对人骨肉瘤细胞MG63和U2OS的抑制作用及其机制.方法 用重组腺病毒AdBMP9分别感染MG63和U2OS细胞,并设空白对照组(不加任何处理因素)和AdGFP感染对照组,免疫细胞化学法(Immunocytochemistry,ICC)和Western blot法检测感染后两种细胞中hBMP9的表达水平;MTT和台盼蓝拒染活细胞计数法检测细胞的增殖活力;Hoechst/PI荧光双染法检测细胞的凋亡情况;划痕愈合试验检测细胞的迁移能力;ICC法检测Wnt/ β-catenin信号途径中β-catenin的表达.结果 AdBMP9感染的两种细胞中hBMP9的表达水平均明显高于空白对照组和AdGFP感染组(P＜0.05);hBMP9表达的上调可抑制MG63和U2OS细胞的增殖,且呈时间依赖性(P＜0.01),并使两种细胞的凋亡率明显增加(P＜0.01),迁移能力明显下降(P＜0.01),β-catenin的表达量明显减少(P＜0.01).结论 hBMP9可能通过下调Wnt/β-catenin信号途径活性,抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移,并促进其凋亡.
作者：吴丽美；叶立伟；武睿；段亮；张昀源；陈娴；王海燕；周兰 刊期： 2013年第05期
目的 构建抗菌肽PR-39(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39)重组腺病毒表达质粒.方法 从含抗菌肽PR-39核心编码区的质粒中扩增PR-39基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组穿梭质粒,经PmeⅠ酶切线性化后,转化感受态AdEasier细胞,构建重组腺病毒质粒,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度检测.将重组腺病毒感染鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2,通过荧光显微镜观察红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的表达,RT-PCR法检测PR-39基因的转录水平.结果 重组腺病毒穿梭质粒pAd-Trace-TO4-PR-39经Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组腺病毒质粒pAdPR-39经Pac Ⅰ酶切鉴定,证明目的基因已整合到腺病毒基因组中;第4代重组腺病毒AdPR-39的病毒滴度为1010 IU/ml;感染重组腺病毒AdPR-39的C3H10T1/2细胞可表达RFP; PR-39基因在C3H10T1/2细胞内成功转录.结论 已成功构建携带RFP的PR-39重组腺病毒表达质粒,在鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中可高效表达.
作者：刘涛；姚海；刘铭；李平；左国伟；王信；张健 刊期： 2013年第05期
目的 对总三碘甲状腺原氨酸(Total triiodothyroxine,TT3)定量标记免疫分析试剂盒质量标准进行验证.方法 对具有代表性的6个厂家的TT3定量标记免疫分析试剂盒进行外观和物理检查后,进行线性、低检出限、准确性、精密度、质控品测定值、特异性和稳定性验证.结果 6个厂家的TT3定量标记免疫分析试剂盒外观和物理检查均达到要求;低检出限高为0.3 ng/ml;质控数据均呈3个梯度;准确性、精密度、特异性及稳定性良好.该类试剂盒基本满足此行业标准规定的要求,也基本符合此类试剂盒的现阶段的技术要点.结论 TT3定量标记免疫分析试剂盒质量标准的制定,对此类试剂盒的实验方法及质量标准进行了规范,进而促进产品质量的不断提高,也为该产品的检验检测、临床使用评价及监管提供了技术依据.
作者：沈舒；黄颖；刘艳；高尚先；张春涛 刊期： 2013年第05期
目的 在大肠杆菌中表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的融合蛋白TB10.4-F1,检测其免疫原性.方法 将重组工程菌TB10.4/pET28a/BL21和TB 10.4-F1/pET30a/BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;表达的融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1经His TrapTM HP层析柱进行亲和层析一步纯化后,免疫BALB/c小鼠.小鼠分为TB10.4(30 μg/只)、TB10.4-F1(30 μg/只)及PBS(200μl)组,分别于0、2、4周免疫小鼠,于每次免疫前1d经尾部取血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性的IgG水平;于末次免疫2周后摘眼球取血,分离血清,ELISA法检测特异性IgG水平及中和抗体滴度.结果 表达的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1的相对分子质量分别约13 300和59 600,均以包涵体形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的53.9％和12％;纯化后的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1纯度分别可达95％和80％;与TB10.4组相比,TB10.4-F1组IgG水平明显升高,IgG1/IgG2a值明显降低,但仍大于1;TB10.4-F1组小鼠血清中RSV特异性中和抗体滴度可达log102.699.结论 融合蛋白TB10.4-F1免疫原性强,能激发出较为平衡的Th1/Th2反应,并产生抗HRSV的中和抗体.融合蛋白TB10.4-F1有望成为预防HRSV感染的候选疫苗.
作者：王瑞博；井申荣；曾韦锟；黄芬 刊期： 2013年第05期
中国生物制品学杂志
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