王一婷；雷云；黄鹂；谢奎；杨依丽；陈宝琼；谢秋玲；洪岸；熊盛
手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是世界范围内流行的儿童传染病,曾在亚太地区出现过多次大规模的暴发和流行,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)是引起该病的两种主要病原.尽管这两种病毒在遗传学上关系很近,但其感染在临床表现和体征方面均存在一定差异,这种差异是源于病毒基因组的不同,还是由遗传表型特性所致,是值得研究的课题.本文就二者的特征及感染后宿主的细胞反应和比较蛋白质组学研究进行综述.
作者：张文慧；井申荣 刊期： 2012年第05期
目的:建立优化重组Kringle5蛋白发酵工艺.方法:应用高密度发酵法建立并优化含Kringle5表达载体的工程菌的发酵技术,采用紫外分光光度计检测菌体密度(A600),称量菌体干重,并经SDS-PAGE检测Kring]e5蛋白表达量.结果:重组Kringle5蛋白工程菌高密度发酵的优化条件为:BP-5菌种,2×YT培养基,30°C基础培养时间7h,42℃诱导培养时间6h,pH值为7.0,空气流量为lvvm,溶氧控制大于50％,搅拌转速控制为800～1 200 r/min;目的蛋白占全菌总蛋白的38.4％,菌体干重达( 14.28±0.1i)g/L.结论:已建立并优化了重组Kringle5蛋白的高密度发酵工艺,为其新药开发奠定了技术基础.
作者：陈显久；杨利军；解军；张悦红；牛勃 刊期： 2012年第05期
目的:制备马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)2个亚型的单克隆抗体,并进行鉴定.方法:将马流感病毒甲1型A/equine/布拉格/56 H7N7(简称H7N7)和马流感病毒甲2型A/equine/miami/63 H3N8(简称H3N8)分别接种SPF鸡胚,收获尿囊液,纯化后免疫BALB/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0细胞进行融合,筛选阳性杂交瘤细胞,采用细胞培养法和体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定.结果:筛选出能稳定分泌EIV H7N7单抗和H3N8单抗的杂交瘤细胞各2株,分别命名为3C2-B2、2B7-3A7和5G10-G12、5A10-2E3-2G4.3C2-B2分泌的单抗重链为IgM,轻链为k链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶512和1∶262 144;5G10-G12分泌的单抗重链为LgG2a,轻链为k链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶1 024和1∶1 048 576.2个亚型的单抗均具有良好的特异性.获得的杂交瘤细胞株连续培养2个月,培养上清中的抗体效价保持不变；冻存1个月复苏后,培养上清中的抗体效价接近原始值.结论:成功制备了EIV 2个亚型的单克隆抗体,为进一步研制EIV快速分型特异性诊断试剂及治疗制剂奠定了基础.
作者：肖成蕊；王作友；宋战昀；孟庆峰；孟日增；王楠 刊期： 2012年第05期
目的:研制结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品.方法:将结核分枝杆菌标准株H37Rv、15株结核分枝杆菌临床分离株、10株非结核分枝杆菌标准株和5株非分枝杆菌参考株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜且无污染的培养物,采用比浊法制备阳性和阴性参考品用菌液；膜过滤法制备低检出量和精密性(或重复性)参考品用单细胞菌液,并进行活菌计数和显微计数；对低检出量参考品进行冻融试验、加速试验,并对4个厂家的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行评价.结果:阳性参考品由l5份结核分枝杆菌菌液组成,阴性参考品由l0份非结核分枝杆菌和5份非分枝杆菌菌液组成,低检出量参考品由103、102、101和100个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成,精密性(或重复性)参考品由10份102个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成.结论:研制的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品可用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的质量控制.
作者：陈保文；沈小兵；苏城；王国治 刊期： 2012年第05期
目的:观察β-丙内酯对甲型肝炎病毒(HAV)的灭活效应.方法:采用1∶4000的β-丙内酯和甲醛,分别对HAV进行灭活试验.通过病毒滴度检测及病毒灭活效果验证,确定佳灭活时间；检测两种灭活剂对HAV抗原滴度和免疫原性的影响以及对小鼠和豚鼠的毒性反应.结果:β-丙内酯灭活10 h及甲醛灭活3d后,检测不出病毒；β-丙内酯作用24 h可将病毒完全灭活,比甲醛灭活12d效果更好；两种灭活剂灭活不同时间的HAV抗原滴度保持不变,均为1∶640EU/0.1ml；免疫小鼠28 d后,抗-HAV均呈阳性,阳转率达到100％,且对小鼠及豚鼠均无毒性.结论:β-丙内酯直接作用于病毒核酸基因,使HAV失去活性而保持其免疫原性.
作者：蒋建江；威凤春；胡艳灵；潘翔；陈统球 刊期： 2012年第05期
目的:采用HPLC法测定重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量.方法:按设置的色谱条件对检测重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的HPLC方法进行专属性验证、系统适应性验证、线性范围测定、实验内重复性验证、日间重复性验证、低检测限测定、准确性验证,并对3批重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量进行检测.结果:该测定方法具有专属性；系统适应性良好；线性范围为0.03125～2.5mg/ml,R2=0.9997,线性关系良好；实验内重复性,峰面积和浓度的RSD值分别为0.71％和0.56％；日间重复性,保留时间和峰面积的RSD值分别为0.47％和2.76％；低检测限为10mg/L;加样同收率分别为101.99％、99.96％和102.2％,RSD=1.16％；3批人干扰素α2b注射液中吐温80的相对含量分别为0.940、0.936和0.950 mg/ml,分别为标示量的94.0％、93.6％和95.0％.结论:本方法准确、快速、可靠,可用于重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的测定.
作者：赵辉；李增礼；周乐春；储成风；倪晓燕；王荣海；宋礼华 刊期： 2012年第05期
Torque teno病毒是一种与转氨酶升高有关的新型DNA肝炎病毒,以患者名字命名,由于可通过输血传播,也称输血传播病毒(Transfusion transmitted virus,TTV).TTV的ORF1中N22区域大约230 bp的序列(nt1939～2160)为基因分型主要依据.在亚洲、美洲和欧洲等地的一些国家,发现G1型为主要类型,在巴西和韩国等则以G2型为主要类型.正常人群和献血员中都有较高阳性率,中年人群感染率明显高于其他年龄段人群.本文对近几年人类TTV基因型别及流行率的研究进展作一综述.
作者：刘畅；井申荣 刊期： 2012年第05期
目的:观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TN FR-Fc)的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性.方法:采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积(10 ml、250 ml、1.5L),于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度；经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ElISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测.结果:重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定；纯化的融合蛋白纯度在94％以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应.结论:明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础.
作者：王一婷；雷云；黄鹂；谢奎；杨依丽；陈宝琼；谢秋玲；洪岸；熊盛 刊期： 2012年第05期
目的:紫外诱变提高地衣芽孢杆菌的产蛋白酶能力.方法:紫外线照射法诱变地衣芽孢杆菌,绘制诱变曲线,确定紫外诱变条件.采用福林酚法测定酶活力,经初筛和复筛筛选蛋白酶高产菌株,并对所选育的高产菌株进行遗传稳定性研究.结果:佳紫外线照射时间确定为120s,菌落的总致死率为65.58％;经过初筛和复筛,选育出蛋白酶高产菌株B-14,蛋白酶活力为2 922.90U/ml,比出发菌株B提高了23.81％;B-14菌株经5次传代,其蛋白酶活力在2 754.27～3 203.95U/ml之间,变化范围不超过10％.结论:该实验成功选育出遗传性能稳定的蛋白酶高产菌株B-14.
作者：王长远；罗梦晓 刊期： 2012年第05期
朊病毒是传染性海绵状脑病的感染因子,主要由错误折叠的朊蛋白( PrPsc)组成.朊病毒的复制就是在痕量Prp的催化下,正常朊蛋白( PrPc)向其错误折叠形式的转化.本文介绍的是朊病毒的新型检测方法,即蛋白质错误折叠循环扩增技术(类“PCR”高灵敏度检测方法),这种技术的概念是根据朊病毒的复制原理形成的,其方法类似于DNA通过PCR扩增的方法.本文针对朊病毒“类PCR”高灵敏度检测方法中几个具有代表性意义的技术作一综述.
作者：李莎 刊期： 2012年第05期
目的:对我国现用风疹病毒(Rubella virus,RV)疫苗生产毒株松叶株(Matsuba)进行全基因组测序,分析其在减毒过程中的遗传与变异特点,为其安全性评价及遗传学质量控制的标准化提供依据.方法:利用RT-PCR法分段扩增我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全序列,分别将产物插入到T-A克隆载体pGEM-T easy中,构建病毒cDNA文库,进行全基因组序列测定与分析.结果:我国现用Matsuba疫苗株主代种子基因组全长9762nt,含2个ORF,分别位于核苷酸41～6388位和6512～9700位,编码2116、1062个氨基酸；与GenBank中登录的Matsuba.GMK3野毒株和Matsuba疫苗株核苷酸同源性分别为97.5％和99.9％,氨基酸同源性分别为98.8％和99.9％；其在减毒的过程中共有37个氨基酸位点发生变异,其中非结构蛋白P150有18个氨基酸位点发生突变,结构:蛋白El和E2主要抗原位点氨基酸末发生变异,E1-177位糖基化位点突变丢失.结论:我国现用风疹病毒Matsuba疫苗株与同类减毒株具有较高的同源性,其主要的抗原位点在减毒保种过程中高度保守,为在分子水平上保证Matsuba株毒种及其生产疫苗的安全性提供了依据.
作者：刘晨鸣；冯德杰；赵雅静；魏然；魏至栋；高雪军；朱莉萍 刊期： 2012年第05期
目的:建立一种直接用于PCR反应的芽胞杆菌基因组DNA提取的改良方法.方法:用十六烷基三甲基溴化铵(Cetyhrimethyl ammonium bromide,CTAB)-溶菌酶-冻融裂解法提取蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、纳豆芽胞杆菌基因组DNA,用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA在230、260、280 nm波长下的A值,计算DNA浓度,并以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增.结果:采用改良CTAB法提取的基因组DNA A260/A280值均在1.8～2.0之间,A206/A230值均大于2.0,DNA浓度均大于110 μg/ml;PCR扩增产物均可见1 500 bp的清晰条带,浓度较高,未见其他特异条带.结论:CTAB-溶菌酶-冻融裂解法提取芽胞杆菌基因组DNA简单、高效,并可用于PCR反应,适用于临床分子生物学检验.
作者：胥振国；蔡玉华；袁星；刘修树；江昌俊 刊期： 2012年第05期
目的:构建组氨酸( Histidine)位点突变的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)突变体,并检测其感染性.方法:利用定点突变技术,分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸(Alanine),构建突变质粒H490A和H621A,采用T7体外转录法制备病毒RNA,通过电穿孔法导入Huh7.5.1细胞,免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性.结果:H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确；体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7.5.1细胞中表达病毒蛋白,电穿孔效率高达90％以上；野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞,H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少,H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞.结论:成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A,两种突变体病毒的感染性均显著降低.
作者：刘霜；鞠鹤鹏；戚中田；边中启；秦照玲 刊期： 2012年第05期
目的:分析2009年昆明市无菌性脑膜炎患儿脑脊液埃可病毒6型(ECHO virus 6,E6) KM57-09分离株VPI基因的遗传特征.方法:采用RD、Hep-2细胞对无菌性脑膜炎患儿脑脊液样本进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增VP1基因,并进行测序；采用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对；采用Omiga软件对所测定节段序列的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑、比对、拼接；采用Mega4.1软件分析,并与18个参考株的VP1基因序列进行比较.结果:分离株为E6,其VPI区的核苷酸长度与其他E6均为867 bp; KM57-09株与其他E6分离株核苷酸同源性在77.6％-96.0％之间,氨基酸同源性在95.2％～99.0％之间,与山东株2010D0010005核苷酸和氨基酸的同源性高,分别为96.0％和99.0％,与中国其他几种分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.7％～80.9％和95.8％～97.2％；基因进化树分析显示,KM57-09株与山东株2010D0010005株属于同一个进化分枝,与中国其他几种分离株属不同分枝.结论:KM57-09分离株为埃可病毒6型,为中国3个分离株分枝中的一枝.
作者：陈俊英；王湘宜；潘玥；叶君；张名；孙强明；马绍辉 刊期： 2012年第05期
目的:探讨重组促性腺激素释放激素-绿脓杆菌外毒素A(Luteinizing hormone releasing hormone-pseudomonmexotoxin A,LHRH-PE40)与肿瘤细胞和正常细胞膜表面受体特异性结合的差异.方法:常规培养Hep-2、A549及LO2细胞,通过细胞毒性试验观察LHRH-PE4.0对3种细胞的形态学影响及生长抑制作用；通过LHRH-Pe40与LHRH受体的结合试验及LHRH对LHRH-PE40竞争性抑制试验,测定LHRH-PE40在不同J细胞中膜表面受体结合的差异.结果:LHRH-PE40对Hep-2、A549细胞具有明显的杀伤作用,细胞收缩变圆,色暗,折光性差,裂解死亡,杀伤作用随LHRH-PE40浓度的增大而增强,IC50值分别为0.45和0.19 μmol/L,而对LO2细胞毒性作用较弱；LHRH-PE40可与Hep-2和A549细胞受体结合密切,A490值较高,与两种细胞的结合力随着时间的延长而增加,与LO2细胞结合较弱；LHRH可以竞争性拮抗抑制LHRH-PE40与Hep-2、A549细胞的结合,结合力随着LHRH浓度的增高而递减,对LHRH-PE40和LO2细胞结合影响较小.结论:LHRH-PE40可特异性结合癌细胞表面LHRH受体,从而发挥对肿瘤细胞的靶向杀伤作用.
作者：李星；田园；张国利；吴广谋；朱平；岳玉环 刊期： 2012年第05期
目的:探讨发酵糙米提取物对高血脂大鼠血脂、肝脏脂类含量及抗氧化能力的影响.方法:建立Wistar大鼠高血脂模型,通过灌胃不同剂的发酵糙米提取物[100和300mg/(kg·d)],观察对高血脂大鼠总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯( Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、动脉硬化指数( Atherosclerotic index,AI)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)等生化指标的影响.结果:发酵糙米提取物可显著降低高血脂大鼠血清及肝脏中TC、TG、LDL浓度和AI值,提高HDl浓度；增加血清和肝脏中GSH-Px和SOD的浓度,降低MDA的浓度.结论:发酵糙米提取物对高血脂大鼠血清和肝脏的血脂水平具有良好的调节作用,且可提高抗氧化效果.
作者：戴凌燕；李志江；王欣；李娟；关琛；李良玉；周世珠 刊期： 2012年第05期
目的:建立放射致小鼠骨髓细胞损伤与衰老模型.方法:取50只小鼠,随机分为对照组和4.0、6.5、8.5和10.5 Gy不同剂量照射实验组,观察小鼠30d存活率.另取20只小鼠,分别于6.5Gy照射后第1、3、7和30天检测外周血血常规及骨髓单个核细胞( Mononuclear cells,MNCs)数的变化,观察骨髓造血细胞大小及形态并计数集落数量,流式细胞仪检测骨髓MNCs凋亡情况,采用衰老相关的β-半乳糖苷酶( Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色法检测SA-β-gal活性,细胞免疫荧光法分析p16Ink4a蛋白的表达水平.结果:小鼠30d存活率对照组和4.0Gy实验组均为100％,6.5Gy实验组为80％,8.5及10.5 Gy实验组均为0.6.5Gy一次性全身照射后第1、3、7、30d,小鼠外周血白细胞、血小板、骨髓MNCs数、CFU数量均下降,以照射后第3天明显,第7天开始恢复正常；照射后骨髓MNCs凋亡率与对照组[(7.32±1.87)％]相比,均明显升高(P＜0.05),第3天高[(35.71±0.30)％],随时间的延长凋亡率逐渐下降；SA-β-gal染色和细胞免疫荧光染色结果显示,照射后阳性细胞率与对照组比较,均明显升高(P＜0.05),以第3天高,随时间延长逐渐降低.结论:以6.5Gy照射,可建立小鼠的骨髓造血细胞损伤与衰老模型,为进一步筛选抗骨髓抑制的药物奠定了基础.
作者：闫玲玲；姜蓉；李春莉；左国伟；高焕庆；陈地龙；龙轩；王建伟 刊期： 2012年第05期
目的:构建Runx3基因shRNA重组表达质粒,并检测其干扰作用.方法:人工合成靶向Runx3基因的shRNA序列,克隆至pGenesil-1.1表达载体上,构建重组表达质粒Runx3-shRNA,转染人耐药肝癌HepG2细胞；采用半定量RT-PCR及Western blot法检测重组表达质粒对HepC2细胞中Runx3基因的转录和表达水平的影响.结果:重组表达质粒Runx3-shRNA经酶切及测序证明构建正确；其转染人耐药肝癌HepG2细胞后,细胞Runx3基因的转录和蛋白表达水平均明显降低,与空白对照组和阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:已成功构建了Runx3-shRNA表达质粒,为进一步研究Runx3基因在肿瘤耐药细胞中的作用奠定了基础.
作者：郭元红；陈伟庆；房殿亮 刊期： 2012年第05期
目的:构建乙型肝炎病毒HBx基因shRNA真核表达质粒,并筛选能有效抑制HBx表达的干扰序列.方法:设计并构建针对HBx基因的3个siRNA表达质粒,经酶切和DNA测序鉴定,转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜观察细胞转染效率,RT-PCR检测HepG2.2.15细胞中HBx基因mRNA的转录水平,Western blot检测HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达水平.结果:酶切和测序鉴定质粒构建正确,插入片段的碱基序列符合实验设计；质粒转染HepG2.2.15细胞后,HBx基因的转录水平、相对表达量及HBx蛋白的表达水平均明显降低(P均＜0.01),3个重组质粒均能抑制HBx蛋白的表达,且质粒shRNA-HBx3抑制能力强.结论:已成功构建了靶向HBx基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出具有高效沉默HBx基因的shRNA质粒,为进一步研究HBx感染合并肝细胞脂肪变性的发生发展奠定了基础.
作者：张琴；彭俊；沈薇 刊期： 2012年第05期
目的:构建狂犬病病毒( Rabies virus,RV) SRV9株糖蛋白(Glycoprotein)基因的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),并进行鉴定.方法:将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度.结果:酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确；电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构；PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带；Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带；经测定,重组病毒的滴度为106.25 TCID50/ml.较Bartha-K61亲本株的滴度(107 TCID50/ml)下降.结论:成功构建了RV SRV9株糖蛋白基凶重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础.
作者：李业伟；杨洋；刘晔；王景龙；孙程龙；韩乃君；刘祥义；扈荣良 刊期： 2012年第05期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
