刘晨鸣；冯德杰；赵雅静；魏然；魏至栋；高雪军；朱莉萍
目的:全面检定GX1-rmhTNFα工程菌,并建立稳定的发酵及纯化工艺.方法:对GX1-rmhTNFα工程菌进行全面检定,挑取目的蛋白表达水平高的菌种扩大培养；采用5L发酵罐,32℃培养工程菌至菌体A600值达4～6时,42℃诱导约4h后收菌,发酵过程控制pH值在7.2,溶氧在30％左右,采用梯度流加的方法补料,连续发酵3批,验证发酵工艺的稳定性；发酵产物经硫酸铵分段盐析及透析处理后,经SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF层析纯化,收集洗脱峰进行纯度、浓度、活性及Western blot分析.结果:工程菌经全面检定,证实构建正确,目的蛋白表达量不低于10％,菌种稳定性较好,呈典型的大肠杆菌特征,适合建立工程菌菌库；连续发酵3批,湿菌收量均不低于200g,目的蛋白表达水平均在10％以上；目的蛋白经柱层析纯化,终纯化产物蛋白含量为0.901mg/ml,活性为5.97x108IU/ml,纯度可达95％以上,Western blot分析显示,目的蛋白可与鼠抗人TNF单抗特异性结合.结论:初步建立了稳定可行的GX1-rmhTNFα融合蛋白的发酵及纯化工艺.
作者：肖佳佳；吴守振；薛晓静；吴开春 刊期： 2012年第05期
目的:采用HPLC法测定重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量.方法:按设置的色谱条件对检测重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的HPLC方法进行专属性验证、系统适应性验证、线性范围测定、实验内重复性验证、日间重复性验证、低检测限测定、准确性验证,并对3批重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量进行检测.结果:该测定方法具有专属性；系统适应性良好；线性范围为0.03125～2.5mg/ml,R2=0.9997,线性关系良好；实验内重复性,峰面积和浓度的RSD值分别为0.71％和0.56％；日间重复性,保留时间和峰面积的RSD值分别为0.47％和2.76％；低检测限为10mg/L;加样同收率分别为101.99％、99.96％和102.2％,RSD=1.16％；3批人干扰素α2b注射液中吐温80的相对含量分别为0.940、0.936和0.950 mg/ml,分别为标示量的94.0％、93.6％和95.0％.结论:本方法准确、快速、可靠,可用于重组人干扰素α2b注射液中吐温80含量的测定.
作者：赵辉；李增礼；周乐春；储成风；倪晓燕；王荣海；宋礼华 刊期： 2012年第05期
目的:制备马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)2个亚型的单克隆抗体,并进行鉴定.方法:将马流感病毒甲1型A/equine/布拉格/56 H7N7(简称H7N7)和马流感病毒甲2型A/equine/miami/63 H3N8(简称H3N8)分别接种SPF鸡胚,收获尿囊液,纯化后免疫BALB/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0细胞进行融合,筛选阳性杂交瘤细胞,采用细胞培养法和体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定.结果:筛选出能稳定分泌EIV H7N7单抗和H3N8单抗的杂交瘤细胞各2株,分别命名为3C2-B2、2B7-3A7和5G10-G12、5A10-2E3-2G4.3C2-B2分泌的单抗重链为IgM,轻链为k链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶512和1∶262 144;5G10-G12分泌的单抗重链为LgG2a,轻链为k链,细胞培养上清和腹水中抗体效价分别为1∶1 024和1∶1 048 576.2个亚型的单抗均具有良好的特异性.获得的杂交瘤细胞株连续培养2个月,培养上清中的抗体效价保持不变；冻存1个月复苏后,培养上清中的抗体效价接近原始值.结论:成功制备了EIV 2个亚型的单克隆抗体,为进一步研制EIV快速分型特异性诊断试剂及治疗制剂奠定了基础.
作者：肖成蕊；王作友；宋战昀；孟庆峰；孟日增；王楠 刊期： 2012年第05期
目的:研制结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品.方法:将结核分枝杆菌标准株H37Rv、15株结核分枝杆菌临床分离株、10株非结核分枝杆菌标准株和5株非分枝杆菌参考株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜且无污染的培养物,采用比浊法制备阳性和阴性参考品用菌液；膜过滤法制备低检出量和精密性(或重复性)参考品用单细胞菌液,并进行活菌计数和显微计数；对低检出量参考品进行冻融试验、加速试验,并对4个厂家的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行评价.结果:阳性参考品由l5份结核分枝杆菌菌液组成,阴性参考品由l0份非结核分枝杆菌和5份非分枝杆菌菌液组成,低检出量参考品由103、102、101和100个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成,精密性(或重复性)参考品由10份102个/ml的结核分枝杆菌(H37Rv)单细胞菌液组成.结论:研制的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒国家参考品可用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒的质量控制.
作者：陈保文；沈小兵；苏城；王国治 刊期： 2012年第05期
目的:克隆人源抗菌肽( Antimicrobial peptide,AMP)LL-37及其改良体串联体基因,原核表达并纯化重组蛋白.方法:利用生物信息学手段,对人源抗菌肽Ll-37基因序列进行改良设计,合成人源抗菌肽LL-37及其改良体基因片段,经重叠延伸PCR获得人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-dLL-37,转化大肠杆菌BL21( DE3 )pLysS,IPTG诱导表达,Tricine SDS-PAGE分析重组蛋白的表达形式,镍金属螯合亲和层析纯化重组蛋白.结果:改良后的人源抗菌肽LL-37的等电点、稳定性及其在大肠杆菌中的半衰期均显著提高；重组表达质粒pET-28a-dLL-37经测序鉴定构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为11000,主要以包涵体形式存在；纯化的重组蛋白纯度可达95％,浓度为0.473mg/ml.结论:已成功在大肠杆菌中表达并纯化了人源抗菌肽LL-37及其改良体串联体,为其后续生物学活性的研究奠定了基础.
作者：杨浩；姚海燕；陈圆圆；阎波；郭鹏；马驰；韩跃武 刊期： 2012年第05期
目的:建立放射致小鼠骨髓细胞损伤与衰老模型.方法:取50只小鼠,随机分为对照组和4.0、6.5、8.5和10.5 Gy不同剂量照射实验组,观察小鼠30d存活率.另取20只小鼠,分别于6.5Gy照射后第1、3、7和30天检测外周血血常规及骨髓单个核细胞( Mononuclear cells,MNCs)数的变化,观察骨髓造血细胞大小及形态并计数集落数量,流式细胞仪检测骨髓MNCs凋亡情况,采用衰老相关的β-半乳糖苷酶( Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色法检测SA-β-gal活性,细胞免疫荧光法分析p16Ink4a蛋白的表达水平.结果:小鼠30d存活率对照组和4.0Gy实验组均为100％,6.5Gy实验组为80％,8.5及10.5 Gy实验组均为0.6.5Gy一次性全身照射后第1、3、7、30d,小鼠外周血白细胞、血小板、骨髓MNCs数、CFU数量均下降,以照射后第3天明显,第7天开始恢复正常；照射后骨髓MNCs凋亡率与对照组[(7.32±1.87)％]相比,均明显升高(P＜0.05),第3天高[(35.71±0.30)％],随时间的延长凋亡率逐渐下降；SA-β-gal染色和细胞免疫荧光染色结果显示,照射后阳性细胞率与对照组比较,均明显升高(P＜0.05),以第3天高,随时间延长逐渐降低.结论:以6.5Gy照射,可建立小鼠的骨髓造血细胞损伤与衰老模型,为进一步筛选抗骨髓抑制的药物奠定了基础.
作者：闫玲玲；姜蓉；李春莉；左国伟；高焕庆；陈地龙；龙轩；王建伟 刊期： 2012年第05期
目的:运用siRNA抑制肝门部胆管癌QBC939细胞系中人DNA甲基转移酶1(Human DNA methylation transferase 1,hDNMTl)基因的表达,探讨hDNMTI基因沉默后对QBC939细胞抑癌基因p16和RASSFIA去甲基化的影响、初步阐明其机制.方法:根据GenBank中登录的hDNMTl mRNA的核苷酸序列设计并合成发夹式siRNA序列,并以此为模板构建siRNA质粒,经脂质体转染QBC939细胞,通过RT-PCR检测hDNMT1、P16、RASSFIA基因mRNA转录水平；甲基特异性PCR( MSP)检测p16、RA SSFlA基因的甲基化情况；MTT法检测QBC939细胞增殖活力.结果:sihDNMTI可有效抑制QBC939细胞中hDNMT1基因mRNA转录水平,同时上调p16 、RASSFIA抑癌基因mRNA转录水平；sihDNMTi可促进P16、RASSFIA抑癌基因的去甲基化,并抑制QBC939细胞增殖,增殖抑制率在转染后72 h达到峰值.结论:hDNMT基因引起的抑癌基因启动子区异常甲基化是促进肝门部胆管癌发生发展的一个重要因素,抑制hDNMT1基因的表达可促进抑癌基因的去甲基化,为肝门部胆管癌的基因治疗提供了新的思路.
作者：李修红；罗放；向吉锋；王济明 刊期： 2012年第05期
目的:构建狂犬病病毒( Rabies virus,RV) SRV9株糖蛋白(Glycoprotein)基因的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),并进行鉴定.方法:将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度.结果:酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确；电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构；PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带；Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带；经测定,重组病毒的滴度为106.25 TCID50/ml.较Bartha-K61亲本株的滴度(107 TCID50/ml)下降.结论:成功构建了RV SRV9株糖蛋白基凶重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础.
作者：李业伟；杨洋；刘晔；王景龙；孙程龙；韩乃君；刘祥义；扈荣良 刊期： 2012年第05期
目的:探讨发酵糙米提取物对高血脂大鼠血脂、肝脏脂类含量及抗氧化能力的影响.方法:建立Wistar大鼠高血脂模型,通过灌胃不同剂的发酵糙米提取物[100和300mg/(kg·d)],观察对高血脂大鼠总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯( Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、动脉硬化指数( Atherosclerotic index,AI)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)等生化指标的影响.结果:发酵糙米提取物可显著降低高血脂大鼠血清及肝脏中TC、TG、LDL浓度和AI值,提高HDl浓度；增加血清和肝脏中GSH-Px和SOD的浓度,降低MDA的浓度.结论:发酵糙米提取物对高血脂大鼠血清和肝脏的血脂水平具有良好的调节作用,且可提高抗氧化效果.
作者：戴凌燕；李志江；王欣；李娟；关琛；李良玉；周世珠 刊期： 2012年第05期
目的:探讨狂犬病病毒( Rabies virus,RV )SRV9株糖蛋白(G)333位丝氨酸(S)分别突变为精氨酸(R)和谷氨酸(E)后,对其免疫原性的影响.方法:采用RT-PCR法扩增RV SRV9株G蛋白基因,经测序鉴定正确后,通过PCR将编码糖蛋白333位丝氨酸的核苷酸分别突变为编码精氨酸和谷氨酸的核苷酸,并分别构建复制缺陷型重组人5型腺病毒rAd5-SRV9-G333E、rAd5-SRV9-G333S和rAd5-SRV9-G333R,经形态学观察、RT-PCR检测及直接免疫荧光试验鉴定重组腺病毒,并免疫小鼠,检测小鼠中和抗体水平及阳转率,评价3种重组腺病毒免疫原性的差异.结果:SRV9株G蛋白基因及其突变体经测序鉴定正确；制备的重组腺病毒镜下可见典型的腺病毒外形特征,感染HEK293AD细胞后出现明显的细胞病变；RT-PCR及直接免疫荧光试验结果显示,3种重组腺病毒在HEK293AD细胞中均已成功表达；rAd5-SRV9-G333E诱导小鼠产生的中和抗体效价和阳转率均明显高于rAd5-SRV9-G333S (P＜0.05).结论:RV SRV9株糖蛋白333位丝氨酸突变为谷氨酸后,可显著增强其免疫原性.
作者：孙程龙；杨洋；王颖；宫婷；刘祥义；陈奇；王景龙；刘晔；张守峰；扈荣良 刊期： 2012年第05期
目的:构建Runx3基因shRNA重组表达质粒,并检测其干扰作用.方法:人工合成靶向Runx3基因的shRNA序列,克隆至pGenesil-1.1表达载体上,构建重组表达质粒Runx3-shRNA,转染人耐药肝癌HepG2细胞；采用半定量RT-PCR及Western blot法检测重组表达质粒对HepC2细胞中Runx3基因的转录和表达水平的影响.结果:重组表达质粒Runx3-shRNA经酶切及测序证明构建正确；其转染人耐药肝癌HepG2细胞后,细胞Runx3基因的转录和蛋白表达水平均明显降低,与空白对照组和阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:已成功构建了Runx3-shRNA表达质粒,为进一步研究Runx3基因在肿瘤耐药细胞中的作用奠定了基础.
作者：郭元红；陈伟庆；房殿亮 刊期： 2012年第05期
目的:观察β-丙内酯对甲型肝炎病毒(HAV)的灭活效应.方法:采用1∶4000的β-丙内酯和甲醛,分别对HAV进行灭活试验.通过病毒滴度检测及病毒灭活效果验证,确定佳灭活时间；检测两种灭活剂对HAV抗原滴度和免疫原性的影响以及对小鼠和豚鼠的毒性反应.结果:β-丙内酯灭活10 h及甲醛灭活3d后,检测不出病毒；β-丙内酯作用24 h可将病毒完全灭活,比甲醛灭活12d效果更好；两种灭活剂灭活不同时间的HAV抗原滴度保持不变,均为1∶640EU/0.1ml；免疫小鼠28 d后,抗-HAV均呈阳性,阳转率达到100％,且对小鼠及豚鼠均无毒性.结论:β-丙内酯直接作用于病毒核酸基因,使HAV失去活性而保持其免疫原性.
作者：蒋建江；威凤春；胡艳灵；潘翔；陈统球 刊期： 2012年第05期
Torque teno病毒是一种与转氨酶升高有关的新型DNA肝炎病毒,以患者名字命名,由于可通过输血传播,也称输血传播病毒(Transfusion transmitted virus,TTV).TTV的ORF1中N22区域大约230 bp的序列(nt1939～2160)为基因分型主要依据.在亚洲、美洲和欧洲等地的一些国家,发现G1型为主要类型,在巴西和韩国等则以G2型为主要类型.正常人群和献血员中都有较高阳性率,中年人群感染率明显高于其他年龄段人群.本文对近几年人类TTV基因型别及流行率的研究进展作一综述.
作者：刘畅；井申荣 刊期： 2012年第05期
手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是世界范围内流行的儿童传染病,曾在亚太地区出现过多次大规模的暴发和流行,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)是引起该病的两种主要病原.尽管这两种病毒在遗传学上关系很近,但其感染在临床表现和体征方面均存在一定差异,这种差异是源于病毒基因组的不同,还是由遗传表型特性所致,是值得研究的课题.本文就二者的特征及感染后宿主的细胞反应和比较蛋白质组学研究进行综述.
作者：张文慧；井申荣 刊期： 2012年第05期
目的:观察肺表面活性物质蛋白B(Surfactant protein B,SP-B)及成纤维细胞特异性蛋白1(Fibroblast-specific protein 1,FSPl)在支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型小鼠中的表达情况,探讨肺内上皮-间质转化(Ep-ithelial-mesenchymal transformation,EMT)在BPD中的作用及机制.方法:建立BPD小鼠模型；免疫组化法观察各组小鼠肺组织病理学改变；Masson染色法观察各组小鼠肺组织胶原含量；免疫荧光双标法对EMT进行动态监测；荧光定量PCR法检测SP-B和FSP1基因mRNA的表达水平；体积描述法检测小鼠肺功能改变.结果:与对照组比较,BPD组中浓度氧暴露后,小鼠肺组织逐渐出现肺泡化发育障碍、间隔增厚、胶原沉积明显；给氧14、21d时,BPD组小鼠肺组织出现SP-B和FSP1共表达,而对照组未见共表达；与对照组比较,给氧21d时SP-B基因mRNA表达水平明显下降,FSP1明显升高(P均＜0.05)；与对照组比较,BPD组呼吸频率(F)及潮气量(Tv)均明显降低(P＜0.05).结论:通过EMT机制生成的成纤维细胞是BPD中肺纤维化的重要来源.
作者：刘芳君；邓春；郭春宝；符州 刊期： 2012年第05期
目的:建立优化重组Kringle5蛋白发酵工艺.方法:应用高密度发酵法建立并优化含Kringle5表达载体的工程菌的发酵技术,采用紫外分光光度计检测菌体密度(A600),称量菌体干重,并经SDS-PAGE检测Kring]e5蛋白表达量.结果:重组Kringle5蛋白工程菌高密度发酵的优化条件为:BP-5菌种,2×YT培养基,30°C基础培养时间7h,42℃诱导培养时间6h,pH值为7.0,空气流量为lvvm,溶氧控制大于50％,搅拌转速控制为800～1 200 r/min;目的蛋白占全菌总蛋白的38.4％,菌体干重达( 14.28±0.1i)g/L.结论:已建立并优化了重组Kringle5蛋白的高密度发酵工艺,为其新药开发奠定了技术基础.
作者：陈显久；杨利军；解军；张悦红；牛勃 刊期： 2012年第05期
目的:探讨触珠蛋白(Haptoglobin,Hp)在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者血清中的表达情况,为该疾病的诊断与治疗提供新思路.方法:收集30例确诊的AMI患者和30例体检证实为健康人群组的血清,去除血清高丰度蛋白后,采用双向电泳(2-DE)分离血清蛋白,获得的电泳图谱经ImageMaster5.00软件分析,差异明显的蛋白点经胶内酶解后,行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析,检测Hp的表达.结果:AMI患者与健康人群组血清的电泳图谱相似；MALDI-TOF-MS分析显示,AMI患者血清中Hp表达量明显高于健康人群组(P＜0.05).结论:Hp在AMI患者血清中表达量升高,其有望成为AMI患者的特异性诊断标记物.
作者：范晓卿；周义文；秦晓林；何咏婷；刘银河；王毅；涂植光 刊期： 2012年第05期
目的:表表达并纯化重组双链RNA依赖的Caspase募集蛋白,并鉴定其生物学活性.方法:将重组质粒pRSETdsCARE转化大肠杆菌BL21(DE3),分别于37、28℃表达目的蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE、Western blot、HPLC鉴定目的蛋白,MTT法检测dsCARE对转染poly(I∶C)细胞的增殖抑制作用.结果:dsCARE重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中呈组成性稳定表达,平均每升培养基可收获湿菌体约10g；纯化产物的SDS-PAGE纯度达95.8％；纯化的目的蛋白能与抗-His多抗发生特异性反应；HPLC纯度达95.1％；每10g湿菌体可纯化dsCARE重组蛋白约7.5mg,浓度约220μg/ml;纯化的dsCARE重组蛋白与转染poly(I∶C)的HeLa细胞共同孵育,可剂量依赖性抑制HeLa细胞的增殖活性.结论:成功建立了重组dsCARE蛋白的表达、纯化工艺及活性鉴定方法,为其应用和后续研究奠定了基础.
作者：王伟；王伟华；崔杰；杨静华；颜真 刊期： 2012年第05期
目的:观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TN FR-Fc)的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性.方法:采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积(10 ml、250 ml、1.5L),于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度；经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ElISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测.结果:重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定；纯化的融合蛋白纯度在94％以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应.结论:明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础.
作者：王一婷；雷云；黄鹂；谢奎；杨依丽；陈宝琼；谢秋玲；洪岸；熊盛 刊期： 2012年第05期
目的:分别采用简化法与传统方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色,通过流式细胞术检测比较两种方法的染色效果.方法:取健康志愿者外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),分别经佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)、离子霉素( Ionomycint,Ion)和莫能霉素(Monensin)刺激4h,分别以传统法(细胞刺激后进行表面染色,再固定,破膜,行细胞内染色)和简化法(细胞刺激后直接固定、破膜,在不同时间段进行膜上膜内同时染色)进行细胞内染色.样本经抗体标记后,采用流式细胞术检测淋巴细胞的百分率.结果:简化法染色检测Th1细胞的百分比与传统染色方法相比,差异无统计学意义(P＞0.05)；而简化法染色检测Th17细胞的百分比明显高于传统方法(P＜0.05).与传统法比较,应用简化法,细胞于破膜后固定0、48、96 h染色,检测Th2细胞的百分比差异无统计学意义(P＞0.05).结论:简化法简化了操作流程,有利于流式细胞术的质控,可替代传统染色方法进行淋巴细胞胞内细胞因子染色.
作者：刘良忠；胡建娥；常世川；熊德明；朱川；刘必宽；陈睿；谭建军；李刚 刊期： 2012年第05期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
