韵雪雪；杨永长；姜伟；肖代雯；闫慧；黄文芳；罗春丽
目的 探讨霍山石斛提取物(Water extracts from Dendrobium huoshanense,WEDH)对人喉癌细胞株Hep-2增殖和凋亡的影响及其机制.方法 分别用3.75、7.50、15.00、30.00和60.00mg/ml的WEDH处理Hep-2细胞,采用MTT法检测各组细胞的增殖水平;倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化;Annexin V-FITC/PI双染色激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡;Fluo-3 AM标记激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i);分光光度法检测细胞的Caspase-3活性.结果 WEDH可明显抑制Hep-2细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性,作用24、48和72 h的IC50值分别为48.54、26.67和14.93 mg/ml;经WEDH作用48 h的细胞形态均发生显著改变,呈现典型的细胞凋亡特征,且呈浓度依赖性,细胞内[Ca2+]i浓度和Caspase-3活性均显著高于阴性对照组(P＜0.05).结论 WEDH对Hep-2细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用,其机制可能与升高细胞内[Ca2+];浓度,激活Caspase-3有关.
作者：张静；连超群；吴守伟；胡明洁；陈传好 刊期： 2011年第05期
目的 探讨肺炎链球菌146位氨基酸缺失的溶血素△A146Ply蛋白的保护作用,评价其作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的可行性.方法 将BALB/c小鼠分为2组:试验组(15μg△A146Ply蛋白与1 mg/ml CT佐剂的混合物30μl)和对照组(PBS与CT佐剂的混合物30μl),经鼻腔免疫小鼠,每周1次,连续4周.末次免疫1周后,ELISA检测免疫小鼠血清及唾液中特异性抗体水平;并进行△A146P1y对多种血清型肺炎链球菌感染的主动保护试验及其特异性抗血清的被动保护试验;Western blot分析Ply蛋白在肺炎链球菌中的保守性;间接ELISA检测免疫小鼠血清IgG抗体亚型和细胞因子IL-17A水平.结果 试验组小鼠血清中IgG效价为5.12×105,唾液中IgG及IgA效价分别为4.0×103和4.8×103;△A 146Ply黏膜免疫可有效延长小鼠的生存时间,并提高其生存率;其对肺炎链球菌NCTC7466、CMCC(B)31436、CMCC(B)31614和CMCC(B)31207的保护率分别为50.0%、41.7%、50.0%和41.7%;被动免疫保护试验试验组小鼠的存活率为70%;△A146Ply黏膜免疫诱导的抗体亚型主要为IgG1和IgG2b,IL-17A的水平高达(678.55±189)pg/ml,于刺激后48 h达峰值.Ply在4种菌株中均具有良好的保守性.结论 △A146Ply黏膜免疫可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应,能有效抵抗多株致病性肺炎链球菌的感染,提示△A146Ply是肺炎链球菌较好的疫苗候选蛋白.
作者：姚润；崔亚利；袁军；王虹；龚艺；尹一兵；张雪梅 刊期： 2011年第05期
目的 构建创伤弧菌溶血素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)基因原核表达质粒,表达并纯化重组蛋白.方法 从创伤弧菌基因组DNA中钓取VVC基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白用镍离子金属螯合柱纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒pET-32a(+)-VVC经双酶切及测序证明,VVC基因长度为1 371 bp,与GenBank中登录的VVC基因序列同源性为99%;表达的融合蛋白相对分子质量约为71 000,主要以包涵体形式表达,表达量达菌体总蛋白的50%;纯化的重组蛋白纯度大于90%,可与创伤弧菌免疫的小鼠血清特异性结合.结论 已在大肠杆菌中高效表达了VVC蛋白,并进行了纯化,为创伤弧菌诊断试剂盒的研制提供了材料,也为进一步深入研究其结构功能域、生物学活性及创伤弧菌的致病机制奠定了基础.
作者：张在文；郭建巍；魏杰；马骢；钱扬会；张云 刊期： 2011年第05期
目的 构建犬MC4R基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白.方法 以重组质粒pcDNA3.1-myc-his/A-cMC4R 为模板,PCR扩增MC4R基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-MC4R,转化入E.coli Transetta(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒pET-30a(+)-MC4R经双酶切鉴定证明构建正确,DNA测序证实插入序列与GenBank中登录序列的同源性为99%,只有编码区777位碱基T变成了C;表达的重组蛋白相对分子质量约为37 000,诱导4 h表达量高,占菌体总蛋白的8%;重组蛋白可与抗His单抗特异性结合.结论 已成功构建犬MC4R基因原核表达质粒,并表达了重组蛋白,为犬MC4R蛋白多克隆及单克隆抗体的制备提供了抗原.
作者：贺宝军；巴彩凤；王光川；赵薇；宋慧娟；吕金钢 刊期： 2011年第05期
目的 研究脂质体介导的产朊假丝酵母尿酸酶(Uricase,UC)的酶学性质及其免疫原性.方法 采用逆向蒸发法制备UC脂质体,测定UC脂质体和UC的适反应温度、适pH值、酸碱稳定性以及部分金属离子和有机化合物对酶活力的影响;并以其为抗原免疫SD大鼠,制备抗血清,通过间接ELISA法检测血清抗体效价.结果 UC脂质体和UC的适反应温度均为40℃;适反应pH值分别为8.0和8.5;UC脂质体的稳定性明显高于UC;UC脂质体和UC的血清抗体效价分别为1:500和1:8 000.结论 产朊假丝酵母UC脂质体的酶学性质明显优于UC,免疫原性明显低于UC,为该酶的临床应用提供了实验依据.
作者：王娜；谭群友；徐美玲；李艺；赵春景；张景勍 刊期： 2011年第05期
目的 原核表达并纯化大鼠1,25(OH)2D3膜相关快速反应类固醇结合(1,25D3-Membrane associated rapid response steroid binding,1,25D3-MARRS)蛋白.方法 经RT-PCR扩增大鼠1,25D3-MARRS基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,M-NTA亲和层析纯化目的 蛋白,并进行Western blot鉴定.结果 重组原核表达质粒pET-32a-1,25D3-MARRS经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为77 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性.结论 已成功表达并纯化了重组1,25D3-MARRS蛋白,为进一步研究其性质、功能及分布特点奠定了基础.
作者：徐静；张振书；王灿；刘富强；白岚 刊期： 2011年第05期
目的 从广东舟山眼镜蛇毒中分离纯化磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)组分,并分析其理化性质、酶活性质以及影响其酶活力的因素.方法 采用化学沉淀、Sephadex G-50凝胶过滤及UND Sphere S阳离子交换层析法对PLA2进行分离纯化;采用BCA法测定其蛋白浓度,HPLC法测定其纯度,SDS-PAGE测定其相对分子质量,PLA2测定方法测定其活力;并考察反应温度、反应pH值及金属离子对酶活性的影响及其热稳定性.结果 从广东舟山眼镜蛇毒中分离的PLA2蛋白浓度为0.6mg/ml,回收率为9.5%,HPLC纯度为99%,相对分子质量为14 300,比活力为133 μmol/(mg·min);适反应温度及pH值分别约为60℃C和8.5;Ca2+和Mg2+可增强酶活力,K+、Ni2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和Cr2+对酶活力均有抑制作用;该酶具有较高的热稳定性.结论 从广东舟山眼镜蛇毒中分离纯化出一种高纯度的PLA2,该酶具有较高的适反应温度和热稳定性.
作者：郝彩；韩丽萍；蒋琳兰 刊期： 2011年第05期
目的 原核表达、纯化人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)结构蛋白(VP2)和非结构蛋白(NS1和NP1),并制备多克隆抗体.方法 采用PCR法扩增HBoV VP2、NS1和NP1基因,克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经离子交换和Ni2+金属螯合层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价.结果 重组原核表达质粒pET-30a-VP2、pET-30a-NS1和pET-30a-NP1经双酶切和测序证实构建正确;重组VP2蛋白以包涵体形式表达为主,重组NP1蛋白以可溶性表达为主,重组NSl蛋白为包涵体形式表达,表达量分别为菌体总蛋白的20%、40%和30%;纯化的重组蛋白纯度分别可达85%、95%以上和80%o,免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体效价分别为VP2和NP1高于1:16 000,NS1为1:8 000.结论 已成功表达了HBoV VP2、NS1和NP1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为进一步研究HBoV的致病机制及开展流行病学调查等提供了材料.
作者：王雅英；郭丽；吴超；王健伟；洪涛 刊期： 2011年第05期
基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段,日益受到人们的关注.而作为一种新型药物,基因治疗类产品的安全性已成为基因治疗评价的首要内容.本文仅从载体和基因表达产物两方面对基因治疗类产品的安全性及其评价的研究进展作一综述.
作者：周晓冰；李波 刊期： 2011年第05期
目的 构建含有肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)P1和3CD基因的嵌合型重组杆状病毒质粒,探讨3CD蛋白酶对P1蛋白的切割作用及形成类病毒颗粒(Virus-like particles,VLPs)的可能性.方法 将EV71的P1和3CD基因克隆至同一pFastBac Dual质粒上,转化感受态大肠杆菌DH10,构建重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD,转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot及电镜对目的 基因表达产物进行分析.结果 重组杆状病毒质粒Bac-P1-3CD经PCR鉴定证明构建正确.重组杆状病毒感染的Sf9细胞经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约39 000、32 000和26 000的特异条带,大小与EV71的VP1、VP0、VP3蛋白相符;Western blot分析可见与EV71 VP1蛋白大小相近的特异条带;电镜观察可见EV71类病毒颗粒.结论 EV71的P1和3CD嵌合基因可以通过重组杆状病毒在昆虫细胞中表达,3CD蛋白酶可以切割P1蛋白得到VP1抗原,并能形成类病毒颗粒.
作者：徐婧雯；李鸿钧；谢天宏；张光明；尹娜；孙茂盛 刊期： 2011年第05期
目的 构建血管内皮生长因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)-次级淋巴组织趋化因子(Secondary lymphoid-fissue chemokine,SLC)融合基因(VEGF-SLC)的原核表达质粒,表达并纯化重组VEGF-SLC融合蛋白.方法 利用Gene SOEing法扩增VEGF-SLC基因,将融合基因插入载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-VEGF-SLC,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化.结果 重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约28 000,诱导5 h表达量高,约占菌体总蛋白的19%,主要以包涵体形式存在,可与鼠抗人VEGF单抗特异性结合;纯化的重组融合蛋白纯度可达90%以上.结论 已成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组VEGF-SLC融合蛋白,为进一步研究其生物学活性及其靶向抗肿瘤效应以及开发肺癌等肿瘤的靶向生物制剂奠定了基础.
作者：蒋攀；陈全；郑毅；刘革力；张璐瑜 刊期： 2011年第05期
目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HA标签的SH2基因重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP及其突变体Ad5-hSH2mt-EGFP,并观察其对K562细胞增殖的影响.方法 设计并化学合成引物,采用RT-PCR法扩增hSH2基因,重叠PCR法扩增hSH2mt基因,分别克隆至pAdTrack-CMV,构建穿梭质粒,经Pme I酶切,转化感受态pAdEasy-BJ5183,在细菌内同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGPF和pAd5-hSH2mt-EGPF.Pac Ⅰ酶切后转染AD293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,扩增病毒,测定滴度并经PCR和Western blot鉴定.重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测病毒对K562细胞增殖活性的影响.结果 重组腺病毒质粒pAd5-hSH2-EGFP和pAd5-hSH2mt-EGFP经酶切鉴定构建正确;重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP的滴度均可达1.6×1012;PCR结果表明,2种重组腺病毒包装和扩增成功,Western blot结果表明,重组腺病毒携带的目的 基因能够在AD293细胞中表达;MTT检测证实,Ad5-hSH2-EGFP 对K562细胞的增殖具有明显的抑制作用.结论 已成功构建重组腺病毒Ad5-hSH2-EGFP和Ad5-hSH2mt-EGFP,Ad5-hSH2-EGFP能在体外明显抑制K562细胞的增殖,为进一步探讨SH2基因对慢性粒细胞白血病的治疗作用及其机制奠定了基础.
作者：史静；彭智；罗红伟；曹唯希；陶崑；李亚娟；王海霞；冯文莉 刊期： 2011年第05期
目的 克隆Vero细胞基因组DNA的长串联重复序列(Long tandem repeats,LTR),并建立vero细胞DNA定量PCR检测方法.方法 提取Vero细胞基因组DNA,经HindⅢ酶切后,克隆至pET-30a(+)载体上,酶切及测序鉴定,并与GenBank中登录的序列进行同源性比较.以172 bp序列为靶基因设计定量PCR引物和Taq探针,建立Vero细胞DNA定量PCR检测方法,并进行特异性验证.结果 经酶切及测序鉴定,共获得8个阳性克隆质粒pET-30a-172,与GenBank中登录的基因序列同源性在98.3%～99.4%之间;建立的Vero细胞DNA定量PCR检测方法的灵敏度可达1×10-6ng/μl,线性范围为1 ng/μl～1 × 10-6ng/μl;以建立的方法检测鸡胚细胞、CHO细胞和地鼠肾细胞DNA,均未见扩增曲线,仅人二倍体细胞(MRC-5)DNA有明显的扩增曲线,表明该法特异性良好.结论 已成功建立了以172 bp LTR为靶基因的Vero细胞DNA定量PCR检测方法,可用于疫苗中Vero细胞DNA残留量的检测.
作者：曹守春；董关木；李加；唐建蓉；吴小红；刘景华；石磊泰 刊期： 2011年第05期
目的 比较体外培养的乳腺癌细胞与正常乳腺细胞线粒体蛋白指纹图谱,筛选差异蛋白,为乳腺癌亚细胞蛋白标志物的研究奠定基础.方法 提取乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7及正常乳腺细胞株HBL-100线粒体蛋白,表面增强激光解析蛋白飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测蛋白表达,Biomarker Wizard Software分析软件统计结果,筛选差异蛋白,并探讨溶剂及长期冻存对结果分析的影响.结果 在相对分子质量2 000～100 000范围内检测到近200个蛋白峰,HBL-100与MDA-MB-231和MCF-7细胞相比,差异蛋白峰分别为45个和36个(P＜0.05),其中相对分子质量9 200、13 800、14 000和22 500的蛋白在2株癌细胞中表达均下降,相对分子质量10 000和11 600的蛋白在2株癌细胞中表达均升高.4‰的TritonX-114及冻存3～6个月对结果分析无影响.结论 SELDI-TOF-MS能够快速、灵敏地检测分析乳腺癌线粒体差异表达蛋白,为亚细胞水平乳腺癌标志物的研究提供了新的思路.
作者：韵雪雪；杨永长；姜伟；肖代雯；闫慧；黄文芳；罗春丽 刊期： 2011年第05期
目的 应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗.方法 以人用狂犬病疫苗株aGV为毒种,Vero细胞为培养基质,利用14 L生物反应器(500g片状载体置于载体篮内)灌流式培养,连续收获的病毒液经超滤浓缩、灭活、柱层析纯化后,加入冻干保护剂,制备冻干人用狂犬病疫苗,检测冻干前后及37℃放置28 d后的疫苗效价.结果 细胞密度高可达1.0×107个/ml;病毒收获液毒力为7.5×106～3.4×108FFU/ml;纯化后总蛋白质含量小于80μg/0.5ml,Vero细胞蛋白质残留量≤3.5μg/0.5 ml,Vero细胞DNA残留量小于100 pg/0.5ml,疫苗效价大于5.0IU/0.5 ml.结论 应用篮式生物反应器可制备高质量的人用狂犬病疫苗.
作者：杨屹；汝东宇；郭秀侠；崔文广；苗丽；刘岩；王亚军；蔡月红；苑志刚 刊期： 2011年第05期
目的 构建人P115基因重组真核表达质粒,并探讨其过表达对人肝癌细胞HepG2增殖活性的影响.方法 采用RT-PCR从HepG2细胞中扩增人P115基因,插入pEGFP-N1 Vector(+)载体,构建重组真核表达质粒pEGFP-N1 Vector(+)-USO1,将重组质粒转染至HepG2细胞,免疫荧光及流式细胞术检测转染效率;RT-PCR及Western blot检测转染细胞中P115基因及蛋白的表达;MTT法检测转染细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞周期变化.结果 重组真核表达质粒pEGFP-N1 Vector(+)-USO1经酶切鉴定及测序证明构建正确;重组质粒转染HepG2细胞的转染效率达84.83%;重组质粒转染的HepG2细胞中P115基因和蛋白的表达水平及细胞增殖活性均明显高于空载体转染和未转染的细胞;重组质粒转染的细胞G1/G2期比例明显减少,S期比例明显增加.结论 已成功构建了人P115基因重组真核表达质粒,其在肝癌细胞中过表达P115可促进肝癌细胞增殖.
作者：屈玉玲；易永芬；邓玮；文雪；闫田静 刊期： 2011年第05期
目的 探讨人参皂甙Rh2(G-Rh2)提高人源肝癌细胞HepG2对桦木酸(Bet A)敏感性的作用机制.方法 将对数生长期的HepG2细胞分为4组:G-Rh2组(加入7.5 μg/ml G-Rh2)、Bet A组(加入10 μg/ml Bet A)、G-Rh2+Bet A组(加入7.5μg/ml G-Rh2和10 μg/ml Bet A)及以不加药的细胞作为对照,荧光显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术分析细胞凋亡,并检测细胞Caspase-3活性,Western blot检测细胞Caspase-3底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]断裂和Caspase-9激活情况.结果 与G-Rh2和Bet A组相比,G-Rh2+Bet A组超过75%的细胞可见凋亡特征,且处于subG1期细胞的比例增加,Caspase-3活性增强,PARP和Caspase-9断裂明显.结论 G-Rh2提高HepG2细胞对Bet A的敏感性是通过细胞凋亡实现的,且涉及线粒体途径.
作者：李清；王晓宇；李杨；金英花 刊期： 2011年第05期
目的 评价表面改性聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate,PET)纤维的生物安全性.方法 参照相关国家标准对表面改性PET纤维进行细胞毒性试验,比较改性前后PET纤维的细胞毒性;对该表面改性PET纤维材料的浸提液进行急性毒性试验、溶血试验、热原试验和致敏试验,评价其生物安全性.结果 与阴性对照组相比,改性前PET纤维的细胞毒性为Ⅲ～Ⅳ级(P＜0.05),表面改性PET纤维无细胞毒性(P＞0.05);表面改性PET纤维无全身急性毒性反应,溶血率为0.07%,＜5%(P＜0.05),热原反应符合规定,对豚鼠皮肤无致敏反应.结论 表面改性PET纤维无毒性,生物相容性合格,达到了国家规定的生物安全性标准,为进一步进行人工韧带组织工程的研究提供了依据.
作者：黄兆松；毕龙；张振宇；张东宪；孙鹏霄；韩一生 刊期： 2011年第05期
目的 探讨甜菜碱与蛋氨酸螯合铬对三江白猪血清生化指标及皮下旨肪组织脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)基因mRNA表达的影响.方法 选取81头平均体重约52 kg的三江白猪,采用3×3(蛋氨酸鳌合铬×甜菜碱)二因子三水平有重复试验设计,将其分成9组,每组3个重复,每个重复3头猪.在玉米-豆粕型日粮基础上,添加不同水平的蛋氨酸螯合铬(以铬计,0、200、400μg/kg)和甜菜碱(0、1 000、1 250 mg/kg),研究二者对肥育猪血清生化指标及皮下脂肪组织FAS基因mRNA表达的影响.结果 甜菜碱与蛋氨酸螯合铬均可降低肥育猪血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)和胰岛素(INS)含量及FAS基因mRNA的表达水平,提高生长激素(GH)水平,复合添加9组血清TG浓度与对照组相比,差异显著(P＜0.05),并存在交互作用.复合添加6组血清CHO、GH和INS浓度与对照组相比,差异显著(P＜0.05),并存在交互作用,复合添加8组FAS基因mRNA的丰度与对照组相比,差异显著(P＜0.05),并存在交互作用.结论 甜菜碱与蛋氨酸螯合铬均能减少脂肪沉积,且以复合添加效果较好,并存在一定的交互效应.
作者：崔波；耿忠诚；潘兴玲；孙海涛；刘胜军 刊期： 2011年第05期
我国目前上市的疫苗中,大多数是采用传统工艺,直接利用病原体或病原体的某些组分制备.随着现代科学技术的发展,现代生物技术已开始应用于疫苗的研发,但所占比例仍较小.
作者：高恩明 刊期： 2011年第05期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
