徐程林；陈波；陈秀珍；刘桂芳
目的 构建人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达NIRF蛋白.方法 从HeLa细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增NIRF基因编码区全长序列,插入到pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF,转染HepG2.2.15细胞,检测细胞中NIRF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平.结果 重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF经双酶切及测序鉴定证明构建正确.转染HepG2.2.15细胞后,可检测到细胞中NIRF基因mRNA的转录及蛋白的表达.结论 已成功构建了人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达了NIRF蛋白,为下一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础.
作者：常蕾；段昌柱 刊期： 2009年第11期
目的 探索疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰的方法.方法 分别采用非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法处理21株疫苗毒种样品后.评价去除本病毒干扰的效果.结果 21株疫苗毒种中,13株可通过非敏感细胞法去除本病毒干扰;6株可通过特异性抗血清中和法去除干扰;2株可通过离心加中和法去除干扰.应用上述3种方法检测161批疫苗毒种,均能有效去除本病毒干扰.结论 非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法可针对不同毒种去除本病毒的干扰,适用于疫苗毒种的支原体检测.
作者：徐程林；陈波；陈秀珍；刘桂芳 刊期： 2009年第11期
目的 建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性.方法 取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液.采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量.并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Western blot对纯化样品进行鉴定;以PBMC IFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性.结果 纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测.其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40 000和35 000)相符;Western blot分析显示.rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×10~6 IU/mg.结论 已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化丁艺,该工艺成本低,操作简便.纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产.
作者：赵峰；罗慧娟；叶倩君；张霞；张桂铃；王兴勇；张宜俊 刊期： 2009年第11期
目的 构建针对Aurora-A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并探讨其对人乳腺癌细胞株MCF-7中Aurora-A基因表达的抑制作用.方法 将具有短发夹结构的2条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGCsi.U6/Neo/GFP中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行序列测定.并通过脂质体法转染至MCF-7细胞中,48 h后观察转染效率,并采用RT-PCR及Western blot法检测siRNA对MCF-7细胞Aurora-A基因mRNA及蛋白表达的影响.结果 测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已被克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,Aurora-A-siRNA质粒转染MCF-7细胞48 h后转染效率约为60%,与对照组比较,Aurora-A-siRNA质粒转染的细胞Aurora-A基因mRNA和蛋白的表达均明显下降.结论 已成功构建了Aurora-A-siRNA真核表达质粒,其能明显抑制MCF-7细胞Aurora-A基因的表达,为进一步研究Aurora-A基因的功能奠定了基础.并可能为肿瘤的生物学治疗提供新的方法.
作者：王晓霞；解军；张悦红；赵虹；闫峻 刊期： 2009年第11期
目的 研究SD大鼠单次及多次皮下注射聚乙二醇干扰素α2b(PEG-IFNα2b)的药代动力学特征.方法 单次皮下注射按18、180、900 μg/kg给药;多次皮下注射按180μg/kg,1、4、7 d给药;在不同时间点采集血样.ELISA法检测血药浓度,并计算药代动力学参数.结果 SD大鼠单次给药的血药浓度.时间曲线呈剂量依赖关系,体内呈一级动力学过程,具有线性动力学特征;多次给药后,未见PEG-IFNα2b的达峰值时间延长及峰浓度升高的现象,曲线下面积(AUC)亦未见增加,末次给药后大鼠的血药浓度曲线呈一室开发模型,半衰期与单次给药半衰期无明显差异,多次皮下给药元蓄积倾向.结论 PEG-IFNα2b半衰期比IFNα2b显著延长,使用PEG-IFNα2b可以减少用药频次,并可能提高疗效.
作者：吴建国；陈晓虹；宓现强；陶群；叶丹；鞠佃文 刊期： 2009年第11期
目的 分析麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株病毒结构基因的遗传稳定性.方法 将北京天坛生物制品股份有限公司(天坛生物)用于麻疹疫苗生产的S191株25代病毒(S191-BJ25)传至29代(S191-BJ29),上海生物制品研究所保存的S191株24代病毒(S191-SH24)传至33代(S191-SH33).从S191株传代病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段N、M、F,H进行扩增及测序.将测序结果与GenBank中1994年收录的S191株麻疹病毒的相应序列进行比较分析.结果 S191-BJ25传代病毒N、M、F、H 4个基因的总突变率为0.02%,S191-SH2A传代病毒为0.15%;与1994年的S191疫苗株相比,S191-BJ25传代病毒N、M、F、H 4个基因的总突变率为0.3%,S191-SH24传代病毒为0.4%.结论 目前天坛生物使用的麻疹疫苗S191株生产用三级种子库具有可靠的遗传稳定性,从主代种子到疫苗的传代过程中,N、M、F、H结构基因表现出稳定的分子遗传特征.目前使用的S191毒株的4个结构基因较1994年以前的疫苗株发生了变化.但目前没有证据表明这些变化对免疫原性产生不利影响.
作者：赵炜炜；封多佳；董小曼 刊期： 2009年第11期
目的 构建白眉蝮蛇去整合素Adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制.方法 重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列.表达并纯化突变体蛋白.血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体内血管新生试验检测其对血管新生的抑制功能;流式细胞仪检测其对血小板膜受体去整合素αⅡbβ3与CD41结合的影响.结果 双酶切、PCR及测序证实突变体构建止确,纯化的突变体蛋白纯度在90%以上.野生型Adinbitor可识别αⅡbβ3,竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,从而发挥抑制血小板聚集的功能;在相同剂量下,突变型Adinbitor几乎不具备此功能,而保留了抑制血管新生的功能.结论 已成功构建了白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体,与野生型Adinbitor比较,突变体抑制血小板聚集的功能得到了有效抑制.抑制血管新生功能保持不变,为其今后的功能开发奠定了理论基础.
作者：胡燕荣；刘淑清；赵霆；田余祥；洪艳；于丽华；崔秀云；赵宝昌 刊期： 2009年第11期
目的 研究我国生产用卡介菌上海株在传代过程中分子遗传学特性的稳定性.方法 应用多重PCR法,对我国生产用卡介菌上海株工作种子批及其不同代次菌的各缺失区、插入序列IS6110及基因座SenX3-RenX3串联重复序列拷贝数进行检测.结果 我国生产用卡介菌上海株的工作种子批及其第6、9、12代菌均缺失RD1、RD2,未缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo;含有1个IS6110插入序列和3个SenX3-RenX3基因座串联重复序列.结论 我国生产用卡介菌上海株在传12代以内,其分子遗传学特性是稳定的.
作者：赵爱华；乔来艳；贾淑珍；寇丽杰；王国治 刊期： 2009年第11期
目的 建立口蹄疫病毒(FMDV)Asial型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法.方法 在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asial型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件.并进行特异性及相关病毒检测.结果 优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好.检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致.结论 已建立了FMDV Asial型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础.
作者：于长勇；金宁一；王春凤；鲁会军；胡博；刘昊；张丹；牟伟锋；丛艳昭；谷长维；常巧呈；刘存霞；颜雯；叶明 刊期： 2009年第11期
目的 探讨依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,诊断依R菌感染肺结核病的价值.方法 典型依R菌经SDS-PAGE、转膜后,获得Rv0341天然蛋白带.采用结核分枝杆菌抗体DIGFA诊断试剂检测血清Rv0341抗体,并考察该方法的重复性、特异性及敏感性.结果 利用Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,具有良好的批内和批间重复性;血清Rv0341抗体在耐R菌肺结核组和R敏感菌肺结核组的特异性分别为92.3%(24/26)和79.3%(23/29),在依R菌肺结核R治疗组中的敏感性为88.9%(16/18);在培养阴性结核组中,阳性率为23.8%(29/122).54份阳性结果血清进行重复实验,确认为阳性.结论 Rv0341天然蛋白可作为诊断抗原用于依R菌结核病血清学诊断试剂盒的研发,以快速辅助诊断依R菌结核病,特别对菌阴依R菌结核病更有诊断价值.
作者：王易伟；吴园；胡频频；钟明；彭建军；杨晓梅；姚永秀；钟敏；毛旭虎 刊期： 2009年第11期
目的 构建HIV-1 HXB2株tat(B41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Tat(B41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础.方法 在HIV-1 HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tatl-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因tat(B41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-tat(B41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3).IPTG诱导表达.融合蛋白经Ni~(2+)-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定.结果 重叠延伸PCR扩增出约500 bp的tat(B41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-tat(B41-101N)构建正确,SDS-PAGE分析显示,表达的Tat(B41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36 000,约占菌体总蛋白的7%.纯化后纯度约为60%;WeStern blot 和ELISA分析显示,Tat(B41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应.结论 已成功构建了HIV-1HXB2株tat(B41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础.
作者：廖文婷；陈璐；曹洁；陈秋莉；王锦红；唐萍；庞强；黄德胜；潘卫 刊期： 2009年第11期
目的 建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT),并对其适用性进行初步验证.方法 采用纯化的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)包被酶标板,以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体,建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的间接ELISA法,并对该方法进行初步验证.在此基础上建立PSPT法,并与MICA法进行相关性分析.结果 建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA,标准曲线线性范围内R≥0.99;经验证,两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.750 0和59.062 5 mEU/ml.检测限量分别为100和70 mEU/ml.将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定,两者呈正相关,两种方法检测结果差异无统计学意义.且PSPT法比MICA法重复性更好.结论 抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA灵敏度高.准确性及精密性均较好,在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法,用于检测无细胞百日咳疫苗的效价.
作者：李世慧；肖詹蓉；刘保奎 刊期： 2009年第11期
目的 筛选冻干乙型脑炎灭活疫苗(Veto细胞)非动物源性稳定剂,以替代传统的动物源性稳定剂.方法 取同一批乙型脑炎灭活疫苗(Veto细胞)原液,分别加入A、B、c、D稳定剂(非动物源性),制备成冻干剂型,分别检测其外观、水分、有效抗原含量和效力等,以传统稳定剂作对照,并考察其稳定性.结果 冻干前后,疫苗的有效抗原含量及效力与对照无明显差异.加入D稳定剂(不含人血白蛋白和明胶)的冻干乙型脑炎灭活疫苗于37℃放置6个月,效力降低15.1%;于2～8℃放置2年.效力仍高于参考品.其他检测指标均符合要求.结论 D稳定剂可替代传统稳定剂,用于制备冻干乙型脑炎灭活疫苗.
作者：张晋；张颖；杨阳；佟芳；董建春；白亮；郝宇；高春龙；康岚 刊期： 2009年第11期
目的 建立抗狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验(RFFTT),验证其与小鼠脑内中和法(MNT)的相关性,并用于马抗狂犬病病毒血清(ERIG)和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)及狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体效价的测定.方法 待测血清或免疫球蛋白在96孔板中作3倍系列稀释,与能感染80%～95%细胞量的攻击病毒混合后,37℃体外中和1h,接种BSR细胞,培养24 h后荧光染色,荧光显微镜下读取结果.用建立的RFFTT法与MNT法同时标定狂犬病免疫球蛋白国家标准品,并检测ERIG和HRIG以及疫苗免疫后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,以比较两种方法的精密度和相关性.结果 采用MNT法和RFFTT法检测我国抗狂犬病免疫球蛋白国家标准品的GMT分别为21.4和23.8 IU/ml,两种方法的变异系数分别为62.3%和13.3%;两个实验室用RFFIT法测定我国国家标准品的结果分别为21.71和23.81 IU/ml.两种方法测定ERIG和HRIG及疫苗免疫后血清中和抗体效价的结果差异无统计学意义,相关系数为0.976.两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性.结论 RFFIT法可替代MNT法检测抗狂犬病病毒中和抗体效价.
作者：吴小红；李加；唐建蓉；Hervé Bourhy；刘景华；曲效民；曹守春；董关木 刊期： 2009年第11期
目的 原核表达犬重组干扰素α(rCaIFNα),并检测其抗病毒活性.方法 PCR扩增CaIFNα成熟蛋白基因,并克隆至pGEX-5X-1表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导表达.表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,进行SDSPAGE及Western blot鉴定,并检测其效价及抗犬细小病毒活性.结果 PCR、双酶切及序列分析证实CalFNα成熟序列已插入pGEX-5X-1载体中.表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质世约45 000的目的蛋白条带,表达量约占菌体总蛋白的(32±2.4)%.纯化的重组蛋白纯度约为85%.且具有良好的反应原性.制备的3批rCaIFNα效价均达到1.1×10~6 IU/ml以上.并可抑制犬细小病毒对MDCK细胞的致病变作用.结论 已成功地在大肠杆菌中高效表达了rCaIFNα,表达产物具有良好的抗病毒活性.
作者：王新满；张玮；赵俊；王明丽 刊期： 2009年第11期
目的 分析Bel亚型的血型血清学特征及其遗传背景.方法 采用红细胞凝集试验检测先证者及其家庭成员红细胞上的A、B、H抗原和血清中的抗-A、抗-B抗体;凝集抑制试验检测唾液中的A、B、H血型物质;吸收放散试验检测红细胞表面是否存在B抗原.用序列特异性引物多聚酶链式反应技术(PCR-SSP)进行ABO血型基因分型.结果 先证者与其父确定为Bel亚型;先证者的两个妹妹分别为Abel亚型和A型;先证者的母亲、配偶、女儿、儿子分别为A、AB、A和B型.结论 Bel亚型有家族遗传性.
作者：周英；李健；吕文彬；陈雪；王乃红；杨群身 刊期： 2009年第11期
目的 探讨乙型脑炎(简称乙脑)减毒活疫苗在小鼠中诱导细胞免疫应答的能力,评价疫苗的免疫原性.方法 以乙脑减毒活疫苗免疫BALB/c小鼠,制备小鼠脾淋巴细胞,在体外以重组蛋白NS3-1和NS3-2进行刺激,采用酶联斑点法(ELISPOT)检测分泌细胞因子的效应T细胞的频数.结果 乙脑减毒活疫苗免疫小鼠的脾淋巴细胞在体外经重组蛋白NS3-1和NS3-2刺激后,可诱导高频数的分泌IFNγ的CD4~+和CD8~+T淋巴细胞及低频数的分泌IL-4的淋巴细胞;而乙脑灭活疫苗仅诱导低频数的分泌IFNγ和IL-4的T淋巴细胞.结论 乙脑减毒活疫苗可在小鼠中有效地诱导NS3-1和NS3-2抗原特异性T淋巴细胞应答,且应答水平显著高于乙脑灭活疫苗.
作者：叶琳；张鹏艳；郑庆纹；姚亚夫 刊期： 2009年第11期
目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化.方法 PCR扩增HBV P基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526 bp).分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析.用Ni~(2+)-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Western blot分析.结果 重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确.表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%.经Ni~(2+)-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性.结论 已成功构建了HBV P基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBV P蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础.
作者：任鹏程；张旭东；吕海港；祁富军；昝玉玲；刘怡；安丽君 刊期： 2009年第11期
目的 构建多样性良好的抗白念珠菌人源性单链抗体库,筛选抗白念珠菌特异性的噬菌体抗体.方法 从20份人外周血淋巴细胞(包括正常成年人5份、新生儿5份和白念珠菌感染恢复期患者10份)中提取总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增人抗体重链(V_H)和轻链(V_L)可变区基因,以重叠延伸PCR法将V_H和V_L拼接成scFv基因,克隆人噬菌粒载体pCANTAB-5E中,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建人源抗白念珠菌天然噬菌体抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体.结果 构建的人源性抗白念珠菌天然噬菌体抗体库库容为2.8 ×10~9.多样性良好.共筛选出18个阳性克隆.结论 已成功构建了1个多样性良好的抗白念珠菌人源性噬菌体抗体库,为筛选有效治疗白念珠菌和耐药性白念珠菌感染的药物提供了条件.
作者：路艳；韩跃武；韩亚萍；刘玲玲；王春霞；李真真 刊期： 2009年第11期
2009年4月16日20时,北京市朝阳区发生一起12名外地农民工被同一条流浪犬咬伤的事件,经街乡政府、公安联防、区卫生局、区疾控中心、辖区社区卫生服务中心等部门的通力协作,进行了妥善,现报道如下.
作者：时念民；罗凤基；李书明；白云骅；屈燕；艾星 刊期： 2009年第11期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
