周英；李健；吕文彬；陈雪；王乃红；杨群身
目的 构建针对Aurora-A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并探讨其对人乳腺癌细胞株MCF-7中Aurora-A基因表达的抑制作用.方法 将具有短发夹结构的2条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGCsi.U6/Neo/GFP中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行序列测定.并通过脂质体法转染至MCF-7细胞中,48 h后观察转染效率,并采用RT-PCR及Western blot法检测siRNA对MCF-7细胞Aurora-A基因mRNA及蛋白表达的影响.结果 测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已被克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,Aurora-A-siRNA质粒转染MCF-7细胞48 h后转染效率约为60%,与对照组比较,Aurora-A-siRNA质粒转染的细胞Aurora-A基因mRNA和蛋白的表达均明显下降.结论 已成功构建了Aurora-A-siRNA真核表达质粒,其能明显抑制MCF-7细胞Aurora-A基因的表达,为进一步研究Aurora-A基因的功能奠定了基础.并可能为肿瘤的生物学治疗提供新的方法.
作者：王晓霞；解军；张悦红；赵虹；闫峻 刊期： 2009年第11期
目的 构建多样性良好的抗白念珠菌人源性单链抗体库,筛选抗白念珠菌特异性的噬菌体抗体.方法 从20份人外周血淋巴细胞(包括正常成年人5份、新生儿5份和白念珠菌感染恢复期患者10份)中提取总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增人抗体重链(V_H)和轻链(V_L)可变区基因,以重叠延伸PCR法将V_H和V_L拼接成scFv基因,克隆人噬菌粒载体pCANTAB-5E中,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建人源抗白念珠菌天然噬菌体抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体.结果 构建的人源性抗白念珠菌天然噬菌体抗体库库容为2.8 ×10~9.多样性良好.共筛选出18个阳性克隆.结论 已成功构建了1个多样性良好的抗白念珠菌人源性噬菌体抗体库,为筛选有效治疗白念珠菌和耐药性白念珠菌感染的药物提供了条件.
作者：路艳；韩跃武；韩亚萍；刘玲玲；王春霞；李真真 刊期： 2009年第11期
目的 原核表达犬重组干扰素α(rCaIFNα),并检测其抗病毒活性.方法 PCR扩增CaIFNα成熟蛋白基因,并克隆至pGEX-5X-1表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导表达.表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,进行SDSPAGE及Western blot鉴定,并检测其效价及抗犬细小病毒活性.结果 PCR、双酶切及序列分析证实CalFNα成熟序列已插入pGEX-5X-1载体中.表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质世约45 000的目的蛋白条带,表达量约占菌体总蛋白的(32±2.4)%.纯化的重组蛋白纯度约为85%.且具有良好的反应原性.制备的3批rCaIFNα效价均达到1.1×10~6 IU/ml以上.并可抑制犬细小病毒对MDCK细胞的致病变作用.结论 已成功地在大肠杆菌中高效表达了rCaIFNα,表达产物具有良好的抗病毒活性.
作者：王新满；张玮；赵俊；王明丽 刊期： 2009年第11期
2009年4月16日20时,北京市朝阳区发生一起12名外地农民工被同一条流浪犬咬伤的事件,经街乡政府、公安联防、区卫生局、区疾控中心、辖区社区卫生服务中心等部门的通力协作,进行了妥善,现报道如下.
作者：时念民；罗凤基；李书明；白云骅；屈燕；艾星 刊期： 2009年第11期
目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化.方法 PCR扩增HBV P基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526 bp).分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析.用Ni~(2+)-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Western blot分析.结果 重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确.表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%.经Ni~(2+)-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性.结论 已成功构建了HBV P基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBV P蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础.
作者：任鹏程；张旭东；吕海港；祁富军；昝玉玲；刘怡；安丽君 刊期： 2009年第11期
目的 开发一种适应于MDCK细胞生长和狂犬病病毒生产的无血清培养基MDCK-SFM,并对MDCK细胞生产狂犬病病毒的条件进行初步优化.方法 方瓶培养MDCK细胞,考察混合脂类、微量元素、氢化可的松、酵母抽提物和鱼胨水解物对MDCK细胞生长的影响.转瓶微载体批培养MDCK细胞,以获得细胞在不同培养基中的生长动力学.以不同的感染量(MOI)和感染时间(TOI)接种狂犬病病毒,确定MDCK细胞感染狂犬病病毒的佳MOI与TOI.比较含10%NCS的DMEM、VP-SFM和MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒的效果.结果 混合脂类有利于细胞贴壁,酵母抽提物和鱼胨水解物可不同程度地促进MDCK细胞生长.以MDCK-SFM培养基培养的MDCK细胞高密度可达14.3×10~5个/ml.在MOI=0.5、TOI=72 h的条件下,可得到高的病毒滴度.MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒,可获得较高的病毒滴度(5.13 lgFFU/m1).结论 MDCK-SFM培养基适于MDCK细胞生长和培养狂犬病病毒,且成本低,成分比较明确,在MDCK细胞高密度培养生产狂犬病疫苗方面具有较高的应用价值.
作者：樊庆帅；牛红星；吴书军；张旭；谭文松 刊期： 2009年第11期
目的 优化猪源罗伊乳杆菌冷冻干燥的保护剂配方,提高冻干后的菌体存活率.方法 应用SAS V8.0统计分析软件中的二次正交旋转组合设计方案.进行冷冻干燥保护剂组分配比优化的试验设计,并通过响应面法分析各因素对响应值的效应关系.应用优化的冻干保护剂配方进行3次重复冻干试验,验证预测结果的准确性.结果 经优化后,保护剂各组分佳配比为:蔗糖15%,甘油3%,山梨醇15%,脱脂乳15%.应用优化保护剂进行的3次重复冻干试验,菌体冻干存活率的平均值为71.6%.与预测值(73.6%)基本相符.结论 应用二次正交旋转组合设计结合响应面法,优化了猪源罗伊乳杆菌的冷冻干燥保护剂组分.
作者：朱战波；刘存霞；刘宇；贾永全；谭磊；崔莉；马晓静；车车；崔玉东 刊期： 2009年第11期
目的 筛选冻干乙型脑炎灭活疫苗(Veto细胞)非动物源性稳定剂,以替代传统的动物源性稳定剂.方法 取同一批乙型脑炎灭活疫苗(Veto细胞)原液,分别加入A、B、c、D稳定剂(非动物源性),制备成冻干剂型,分别检测其外观、水分、有效抗原含量和效力等,以传统稳定剂作对照,并考察其稳定性.结果 冻干前后,疫苗的有效抗原含量及效力与对照无明显差异.加入D稳定剂(不含人血白蛋白和明胶)的冻干乙型脑炎灭活疫苗于37℃放置6个月,效力降低15.1%;于2～8℃放置2年.效力仍高于参考品.其他检测指标均符合要求.结论 D稳定剂可替代传统稳定剂,用于制备冻干乙型脑炎灭活疫苗.
作者：张晋；张颖；杨阳；佟芳；董建春；白亮；郝宇；高春龙；康岚 刊期： 2009年第11期
目的 探讨乙型脑炎(简称乙脑)减毒活疫苗在小鼠中诱导细胞免疫应答的能力,评价疫苗的免疫原性.方法 以乙脑减毒活疫苗免疫BALB/c小鼠,制备小鼠脾淋巴细胞,在体外以重组蛋白NS3-1和NS3-2进行刺激,采用酶联斑点法(ELISPOT)检测分泌细胞因子的效应T细胞的频数.结果 乙脑减毒活疫苗免疫小鼠的脾淋巴细胞在体外经重组蛋白NS3-1和NS3-2刺激后,可诱导高频数的分泌IFNγ的CD4~+和CD8~+T淋巴细胞及低频数的分泌IL-4的淋巴细胞;而乙脑灭活疫苗仅诱导低频数的分泌IFNγ和IL-4的T淋巴细胞.结论 乙脑减毒活疫苗可在小鼠中有效地诱导NS3-1和NS3-2抗原特异性T淋巴细胞应答,且应答水平显著高于乙脑灭活疫苗.
作者：叶琳；张鹏艳；郑庆纹；姚亚夫 刊期： 2009年第11期
目的 构建HIV-1 HXB2株tat(B41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Tat(B41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础.方法 在HIV-1 HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tatl-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因tat(B41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-tat(B41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3).IPTG诱导表达.融合蛋白经Ni~(2+)-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定.结果 重叠延伸PCR扩增出约500 bp的tat(B41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-tat(B41-101N)构建正确,SDS-PAGE分析显示,表达的Tat(B41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36 000,约占菌体总蛋白的7%.纯化后纯度约为60%;WeStern blot 和ELISA分析显示,Tat(B41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应.结论 已成功构建了HIV-1HXB2株tat(B41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础.
作者：廖文婷；陈璐；曹洁；陈秋莉；王锦红；唐萍；庞强；黄德胜；潘卫 刊期： 2009年第11期
目的 构建白眉蝮蛇去整合素Adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制.方法 重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列.表达并纯化突变体蛋白.血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体内血管新生试验检测其对血管新生的抑制功能;流式细胞仪检测其对血小板膜受体去整合素αⅡbβ3与CD41结合的影响.结果 双酶切、PCR及测序证实突变体构建止确,纯化的突变体蛋白纯度在90%以上.野生型Adinbitor可识别αⅡbβ3,竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,从而发挥抑制血小板聚集的功能;在相同剂量下,突变型Adinbitor几乎不具备此功能,而保留了抑制血管新生的功能.结论 已成功构建了白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体,与野生型Adinbitor比较,突变体抑制血小板聚集的功能得到了有效抑制.抑制血管新生功能保持不变,为其今后的功能开发奠定了理论基础.
作者：胡燕荣；刘淑清；赵霆；田余祥；洪艳；于丽华；崔秀云；赵宝昌 刊期： 2009年第11期
目的 探讨依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,诊断依R菌感染肺结核病的价值.方法 典型依R菌经SDS-PAGE、转膜后,获得Rv0341天然蛋白带.采用结核分枝杆菌抗体DIGFA诊断试剂检测血清Rv0341抗体,并考察该方法的重复性、特异性及敏感性.结果 利用Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,具有良好的批内和批间重复性;血清Rv0341抗体在耐R菌肺结核组和R敏感菌肺结核组的特异性分别为92.3%(24/26)和79.3%(23/29),在依R菌肺结核R治疗组中的敏感性为88.9%(16/18);在培养阴性结核组中,阳性率为23.8%(29/122).54份阳性结果血清进行重复实验,确认为阳性.结论 Rv0341天然蛋白可作为诊断抗原用于依R菌结核病血清学诊断试剂盒的研发,以快速辅助诊断依R菌结核病,特别对菌阴依R菌结核病更有诊断价值.
作者：王易伟；吴园；胡频频；钟明；彭建军；杨晓梅；姚永秀；钟敏；毛旭虎 刊期： 2009年第11期
目的 原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵.方法 全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因.克隆人pET22b(+)-X表达载体中.构建重组质粒pET22b-Cecropin B-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后.进行SDS-PAGE及Western blot分析.镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,后在5 L发酵罐中进行发酵.结果 酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Western blot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c 3T3细胞生长的活性,在5 L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60 g.结论 已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础.
作者：万一；沈卫荣；韩丽萍；王小霞；李玥；张月娟；孙晓宇；陈锐；沈俭 刊期： 2009年第11期
目的 探索疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰的方法.方法 分别采用非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法处理21株疫苗毒种样品后.评价去除本病毒干扰的效果.结果 21株疫苗毒种中,13株可通过非敏感细胞法去除本病毒干扰;6株可通过特异性抗血清中和法去除干扰;2株可通过离心加中和法去除干扰.应用上述3种方法检测161批疫苗毒种,均能有效去除本病毒干扰.结论 非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法可针对不同毒种去除本病毒的干扰,适用于疫苗毒种的支原体检测.
作者：徐程林；陈波；陈秀珍；刘桂芳 刊期： 2009年第11期
目的 优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺.方法 对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等.纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度.结果 在诱导温度为37℃,诱导时间为4 h,IPTG浓度为0.5 mmol/L时,目的蛋白的表达量高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66 g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上.结论 优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺.为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础.
作者：赵宏鑫；邵明龙；杨苹；张耀方；万晓姗；孔祥鑫；王会岩；李校堃 刊期： 2009年第11期
目的 建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性.方法 取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液.采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量.并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Western blot对纯化样品进行鉴定;以PBMC IFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性.结果 纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测.其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40 000和35 000)相符;Western blot分析显示.rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×10~6 IU/mg.结论 已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化丁艺,该工艺成本低,操作简便.纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产.
作者：赵峰；罗慧娟；叶倩君；张霞；张桂铃；王兴勇；张宜俊 刊期： 2009年第11期
目的 建立口蹄疫病毒(FMDV)Asial型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法.方法 在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asial型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件.并进行特异性及相关病毒检测.结果 优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好.检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致.结论 已建立了FMDV Asial型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础.
作者：于长勇；金宁一；王春凤；鲁会军；胡博；刘昊；张丹；牟伟锋；丛艳昭；谷长维；常巧呈；刘存霞；颜雯；叶明 刊期： 2009年第11期
目的 建立抗狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验(RFFTT),验证其与小鼠脑内中和法(MNT)的相关性,并用于马抗狂犬病病毒血清(ERIG)和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)及狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体效价的测定.方法 待测血清或免疫球蛋白在96孔板中作3倍系列稀释,与能感染80%～95%细胞量的攻击病毒混合后,37℃体外中和1h,接种BSR细胞,培养24 h后荧光染色,荧光显微镜下读取结果.用建立的RFFTT法与MNT法同时标定狂犬病免疫球蛋白国家标准品,并检测ERIG和HRIG以及疫苗免疫后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,以比较两种方法的精密度和相关性.结果 采用MNT法和RFFTT法检测我国抗狂犬病免疫球蛋白国家标准品的GMT分别为21.4和23.8 IU/ml,两种方法的变异系数分别为62.3%和13.3%;两个实验室用RFFIT法测定我国国家标准品的结果分别为21.71和23.81 IU/ml.两种方法测定ERIG和HRIG及疫苗免疫后血清中和抗体效价的结果差异无统计学意义,相关系数为0.976.两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性.结论 RFFIT法可替代MNT法检测抗狂犬病病毒中和抗体效价.
作者：吴小红；李加；唐建蓉；Hervé Bourhy；刘景华；曲效民；曹守春；董关木 刊期： 2009年第11期
目的 分析麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株病毒结构基因的遗传稳定性.方法 将北京天坛生物制品股份有限公司(天坛生物)用于麻疹疫苗生产的S191株25代病毒(S191-BJ25)传至29代(S191-BJ29),上海生物制品研究所保存的S191株24代病毒(S191-SH24)传至33代(S191-SH33).从S191株传代病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段N、M、F,H进行扩增及测序.将测序结果与GenBank中1994年收录的S191株麻疹病毒的相应序列进行比较分析.结果 S191-BJ25传代病毒N、M、F、H 4个基因的总突变率为0.02%,S191-SH2A传代病毒为0.15%;与1994年的S191疫苗株相比,S191-BJ25传代病毒N、M、F、H 4个基因的总突变率为0.3%,S191-SH24传代病毒为0.4%.结论 目前天坛生物使用的麻疹疫苗S191株生产用三级种子库具有可靠的遗传稳定性,从主代种子到疫苗的传代过程中,N、M、F、H结构基因表现出稳定的分子遗传特征.目前使用的S191毒株的4个结构基因较1994年以前的疫苗株发生了变化.但目前没有证据表明这些变化对免疫原性产生不利影响.
作者：赵炜炜；封多佳；董小曼 刊期： 2009年第11期
目的 建立稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系,并观察shRNA对Caski细胞中MCPH1基因表达的影响.方法 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSUPER Retro中,构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生重组逆转录病毒,感染宫颈癌细胞株Caski,经puromycin筛选稳定的细胞克隆.实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平.结果 重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染Caski细胞后可筛选出稳定的细胞克隆;pSUPER-shRNA-MCPH1组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组及正常对照组.结论 已成功建立了稳定表达人MCPH1基因shBNA的Caski细胞系,shRNA能明显抑制MCPH1基因的表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础.
作者：黄秀凝；袁成福；程莉；卜友泉；易发平；刘革力；汪长东；宋方洲 刊期： 2009年第11期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
