万一；沈卫荣；韩丽萍；王小霞；李玥；张月娟；孙晓宇；陈锐；沈俭
目的 筛选冻干乙型脑炎灭活疫苗(Veto细胞)非动物源性稳定剂,以替代传统的动物源性稳定剂.方法 取同一批乙型脑炎灭活疫苗(Veto细胞)原液,分别加入A、B、c、D稳定剂(非动物源性),制备成冻干剂型,分别检测其外观、水分、有效抗原含量和效力等,以传统稳定剂作对照,并考察其稳定性.结果 冻干前后,疫苗的有效抗原含量及效力与对照无明显差异.加入D稳定剂(不含人血白蛋白和明胶)的冻干乙型脑炎灭活疫苗于37℃放置6个月,效力降低15.1%;于2～8℃放置2年.效力仍高于参考品.其他检测指标均符合要求.结论 D稳定剂可替代传统稳定剂,用于制备冻干乙型脑炎灭活疫苗.
作者：张晋；张颖；杨阳；佟芳；董建春；白亮；郝宇；高春龙；康岚 刊期： 2009年第11期
目的 构建HIV-1 HXB2株tat(B41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Tat(B41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础.方法 在HIV-1 HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tatl-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因tat(B41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-tat(B41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3).IPTG诱导表达.融合蛋白经Ni~(2+)-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定.结果 重叠延伸PCR扩增出约500 bp的tat(B41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-tat(B41-101N)构建正确,SDS-PAGE分析显示,表达的Tat(B41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36 000,约占菌体总蛋白的7%.纯化后纯度约为60%;WeStern blot 和ELISA分析显示,Tat(B41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应.结论 已成功构建了HIV-1HXB2株tat(B41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础.
作者：廖文婷；陈璐；曹洁；陈秋莉；王锦红；唐萍；庞强；黄德胜；潘卫 刊期： 2009年第11期
目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化.方法 PCR扩增HBV P基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526 bp).分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析.用Ni~(2+)-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Western blot分析.结果 重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确.表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%.经Ni~(2+)-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性.结论 已成功构建了HBV P基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBV P蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础.
作者：任鹏程；张旭东；吕海港；祁富军；昝玉玲；刘怡；安丽君 刊期： 2009年第11期
目的 建立稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系,并观察shRNA对Caski细胞中MCPH1基因表达的影响.方法 将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSUPER Retro中,构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生重组逆转录病毒,感染宫颈癌细胞株Caski,经puromycin筛选稳定的细胞克隆.实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平.结果 重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染Caski细胞后可筛选出稳定的细胞克隆;pSUPER-shRNA-MCPH1组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组及正常对照组.结论 已成功建立了稳定表达人MCPH1基因shBNA的Caski细胞系,shRNA能明显抑制MCPH1基因的表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础.
作者：黄秀凝；袁成福；程莉；卜友泉；易发平；刘革力；汪长东；宋方洲 刊期： 2009年第11期
目的 构建人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达NIRF蛋白.方法 从HeLa细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增NIRF基因编码区全长序列,插入到pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF,转染HepG2.2.15细胞,检测细胞中NIRF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平.结果 重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-NIRF经双酶切及测序鉴定证明构建正确.转染HepG2.2.15细胞后,可检测到细胞中NIRF基因mRNA的转录及蛋白的表达.结论 已成功构建了人NIRF基因真核表达质粒,并在HepG2.2.15细胞中表达了NIRF蛋白,为下一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础.
作者：常蕾；段昌柱 刊期： 2009年第11期
目的 研究SD大鼠单次及多次皮下注射聚乙二醇干扰素α2b(PEG-IFNα2b)的药代动力学特征.方法 单次皮下注射按18、180、900 μg/kg给药;多次皮下注射按180μg/kg,1、4、7 d给药;在不同时间点采集血样.ELISA法检测血药浓度,并计算药代动力学参数.结果 SD大鼠单次给药的血药浓度.时间曲线呈剂量依赖关系,体内呈一级动力学过程,具有线性动力学特征;多次给药后,未见PEG-IFNα2b的达峰值时间延长及峰浓度升高的现象,曲线下面积(AUC)亦未见增加,末次给药后大鼠的血药浓度曲线呈一室开发模型,半衰期与单次给药半衰期无明显差异,多次皮下给药元蓄积倾向.结论 PEG-IFNα2b半衰期比IFNα2b显著延长,使用PEG-IFNα2b可以减少用药频次,并可能提高疗效.
作者：吴建国；陈晓虹；宓现强；陶群；叶丹；鞠佃文 刊期： 2009年第11期
目的 建立口蹄疫病毒(FMDV)Asial型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法.方法 在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asial型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件.并进行特异性及相关病毒检测.结果 优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好.检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致.结论 已建立了FMDV Asial型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础.
作者：于长勇；金宁一；王春凤；鲁会军；胡博；刘昊；张丹；牟伟锋；丛艳昭；谷长维；常巧呈；刘存霞；颜雯；叶明 刊期： 2009年第11期
目的 分析麻疹减毒活疫苗S191生产用毒株病毒结构基因的遗传稳定性.方法 将北京天坛生物制品股份有限公司(天坛生物)用于麻疹疫苗生产的S191株25代病毒(S191-BJ25)传至29代(S191-BJ29),上海生物制品研究所保存的S191株24代病毒(S191-SH24)传至33代(S191-SH33).从S191株传代病毒中提取RNA,对病毒结构基因片段N、M、F,H进行扩增及测序.将测序结果与GenBank中1994年收录的S191株麻疹病毒的相应序列进行比较分析.结果 S191-BJ25传代病毒N、M、F、H 4个基因的总突变率为0.02%,S191-SH2A传代病毒为0.15%;与1994年的S191疫苗株相比,S191-BJ25传代病毒N、M、F、H 4个基因的总突变率为0.3%,S191-SH24传代病毒为0.4%.结论 目前天坛生物使用的麻疹疫苗S191株生产用三级种子库具有可靠的遗传稳定性,从主代种子到疫苗的传代过程中,N、M、F、H结构基因表现出稳定的分子遗传特征.目前使用的S191毒株的4个结构基因较1994年以前的疫苗株发生了变化.但目前没有证据表明这些变化对免疫原性产生不利影响.
作者：赵炜炜；封多佳；董小曼 刊期： 2009年第11期
目的 优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺.方法 对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等.纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度.结果 在诱导温度为37℃,诱导时间为4 h,IPTG浓度为0.5 mmol/L时,目的蛋白的表达量高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66 g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上.结论 优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺.为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础.
作者：赵宏鑫；邵明龙；杨苹；张耀方；万晓姗；孔祥鑫；王会岩；李校堃 刊期： 2009年第11期
目的 开发一种适应于MDCK细胞生长和狂犬病病毒生产的无血清培养基MDCK-SFM,并对MDCK细胞生产狂犬病病毒的条件进行初步优化.方法 方瓶培养MDCK细胞,考察混合脂类、微量元素、氢化可的松、酵母抽提物和鱼胨水解物对MDCK细胞生长的影响.转瓶微载体批培养MDCK细胞,以获得细胞在不同培养基中的生长动力学.以不同的感染量(MOI)和感染时间(TOI)接种狂犬病病毒,确定MDCK细胞感染狂犬病病毒的佳MOI与TOI.比较含10%NCS的DMEM、VP-SFM和MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒的效果.结果 混合脂类有利于细胞贴壁,酵母抽提物和鱼胨水解物可不同程度地促进MDCK细胞生长.以MDCK-SFM培养基培养的MDCK细胞高密度可达14.3×10~5个/ml.在MOI=0.5、TOI=72 h的条件下,可得到高的病毒滴度.MDCK-SFM培养基培养MDCK细胞生产狂犬病病毒,可获得较高的病毒滴度(5.13 lgFFU/m1).结论 MDCK-SFM培养基适于MDCK细胞生长和培养狂犬病病毒,且成本低,成分比较明确,在MDCK细胞高密度培养生产狂犬病疫苗方面具有较高的应用价值.
作者：樊庆帅；牛红星；吴书军；张旭；谭文松 刊期： 2009年第11期
2009年4月16日20时,北京市朝阳区发生一起12名外地农民工被同一条流浪犬咬伤的事件,经街乡政府、公安联防、区卫生局、区疾控中心、辖区社区卫生服务中心等部门的通力协作,进行了妥善,现报道如下.
作者：时念民；罗凤基；李书明；白云骅；屈燕；艾星 刊期： 2009年第11期
目的 建立抗狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验(RFFTT),验证其与小鼠脑内中和法(MNT)的相关性,并用于马抗狂犬病病毒血清(ERIG)和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)及狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体效价的测定.方法 待测血清或免疫球蛋白在96孔板中作3倍系列稀释,与能感染80%～95%细胞量的攻击病毒混合后,37℃体外中和1h,接种BSR细胞,培养24 h后荧光染色,荧光显微镜下读取结果.用建立的RFFTT法与MNT法同时标定狂犬病免疫球蛋白国家标准品,并检测ERIG和HRIG以及疫苗免疫后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,以比较两种方法的精密度和相关性.结果 采用MNT法和RFFTT法检测我国抗狂犬病免疫球蛋白国家标准品的GMT分别为21.4和23.8 IU/ml,两种方法的变异系数分别为62.3%和13.3%;两个实验室用RFFIT法测定我国国家标准品的结果分别为21.71和23.81 IU/ml.两种方法测定ERIG和HRIG及疫苗免疫后血清中和抗体效价的结果差异无统计学意义,相关系数为0.976.两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性.结论 RFFIT法可替代MNT法检测抗狂犬病病毒中和抗体效价.
作者：吴小红；李加；唐建蓉；Hervé Bourhy；刘景华；曲效民；曹守春；董关木 刊期： 2009年第11期
目的 探索疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰的方法.方法 分别采用非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法处理21株疫苗毒种样品后.评价去除本病毒干扰的效果.结果 21株疫苗毒种中,13株可通过非敏感细胞法去除本病毒干扰;6株可通过特异性抗血清中和法去除干扰;2株可通过离心加中和法去除干扰.应用上述3种方法检测161批疫苗毒种,均能有效去除本病毒干扰.结论 非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法可针对不同毒种去除本病毒的干扰,适用于疫苗毒种的支原体检测.
作者：徐程林；陈波；陈秀珍；刘桂芳 刊期： 2009年第11期
目的 分析Bel亚型的血型血清学特征及其遗传背景.方法 采用红细胞凝集试验检测先证者及其家庭成员红细胞上的A、B、H抗原和血清中的抗-A、抗-B抗体;凝集抑制试验检测唾液中的A、B、H血型物质;吸收放散试验检测红细胞表面是否存在B抗原.用序列特异性引物多聚酶链式反应技术(PCR-SSP)进行ABO血型基因分型.结果 先证者与其父确定为Bel亚型;先证者的两个妹妹分别为Abel亚型和A型;先证者的母亲、配偶、女儿、儿子分别为A、AB、A和B型.结论 Bel亚型有家族遗传性.
作者：周英；李健；吕文彬；陈雪；王乃红；杨群身 刊期： 2009年第11期
目的 探讨依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,诊断依R菌感染肺结核病的价值.方法 典型依R菌经SDS-PAGE、转膜后,获得Rv0341天然蛋白带.采用结核分枝杆菌抗体DIGFA诊断试剂检测血清Rv0341抗体,并考察该方法的重复性、特异性及敏感性.结果 利用Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,具有良好的批内和批间重复性;血清Rv0341抗体在耐R菌肺结核组和R敏感菌肺结核组的特异性分别为92.3%(24/26)和79.3%(23/29),在依R菌肺结核R治疗组中的敏感性为88.9%(16/18);在培养阴性结核组中,阳性率为23.8%(29/122).54份阳性结果血清进行重复实验,确认为阳性.结论 Rv0341天然蛋白可作为诊断抗原用于依R菌结核病血清学诊断试剂盒的研发,以快速辅助诊断依R菌结核病,特别对菌阴依R菌结核病更有诊断价值.
作者：王易伟；吴园；胡频频；钟明；彭建军；杨晓梅；姚永秀；钟敏；毛旭虎 刊期： 2009年第11期
核酶是一类具有催化功能的核酸分子.能够与双链DNA或RNA分子结合,从而抑制其转录或翻译.由于核酶能够在相应位点切割核酸序列,具有酶的活性,使其在病毒的基因治疗中具有广阔的应用前景.随着有效的转运和表达方法的建立及核酸化学的进步,核酶有望成为基因治疗中有效的工具之一.本文就核酶在病毒基因治疗中的研究进展作一综述.
作者：卜范峰；王明旭；陈建春 刊期： 2009年第11期
目的 构建白眉蝮蛇去整合素Adinbitor的RIARGD→RPTRGD突变体,研究其主要功能及其作用的分子机制.方法 重叠延伸PCR法获得Adinbior定点突变cDNA序列.表达并纯化突变体蛋白.血小板聚集试验检测其对血小板聚集的影响;鸡绒毛尿囊膜模型体内血管新生试验检测其对血管新生的抑制功能;流式细胞仪检测其对血小板膜受体去整合素αⅡbβ3与CD41结合的影响.结果 双酶切、PCR及测序证实突变体构建止确,纯化的突变体蛋白纯度在90%以上.野生型Adinbitor可识别αⅡbβ3,竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合,从而发挥抑制血小板聚集的功能;在相同剂量下,突变型Adinbitor几乎不具备此功能,而保留了抑制血管新生的功能.结论 已成功构建了白眉蝮蛇去整合素Adinbitor定点突变体,与野生型Adinbitor比较,突变体抑制血小板聚集的功能得到了有效抑制.抑制血管新生功能保持不变,为其今后的功能开发奠定了理论基础.
作者：胡燕荣；刘淑清；赵霆；田余祥；洪艳；于丽华；崔秀云；赵宝昌 刊期： 2009年第11期
目的 原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵.方法 全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因.克隆人pET22b(+)-X表达载体中.构建重组质粒pET22b-Cecropin B-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后.进行SDS-PAGE及Western blot分析.镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,后在5 L发酵罐中进行发酵.结果 酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Western blot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c 3T3细胞生长的活性,在5 L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60 g.结论 已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础.
作者：万一；沈卫荣；韩丽萍；王小霞；李玥；张月娟；孙晓宇；陈锐；沈俭 刊期： 2009年第11期
乙型肝炎疫苗和抗病毒药物在全球的广泛应用有效地防止了乙肝病毒(HBV)的感染.但随之而来的问题是在疫苗免疫后的人群、进行抗病毒治疗的患者以及慢性HBV感染的人群中,出现了HBV表面抗原的变异,而大量文献报道了免疫诊断试剂对变异表面抗原的漏检.本文对乙肝病毒表面抗原变异对免疫诊断试剂检测结果的影响作一综述.
作者：姚昕；周诚；祁自柏 刊期： 2009年第11期
目的 建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT),并对其适用性进行初步验证.方法 采用纯化的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)包被酶标板,以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体,建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的间接ELISA法,并对该方法进行初步验证.在此基础上建立PSPT法,并与MICA法进行相关性分析.结果 建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA,标准曲线线性范围内R≥0.99;经验证,两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.750 0和59.062 5 mEU/ml.检测限量分别为100和70 mEU/ml.将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定,两者呈正相关,两种方法检测结果差异无统计学意义.且PSPT法比MICA法重复性更好.结论 抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA灵敏度高.准确性及精密性均较好,在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法,用于检测无细胞百日咳疫苗的效价.
作者：李世慧；肖詹蓉；刘保奎 刊期： 2009年第11期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
