学术投稿

人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定

王玉梅;盛光耀

关键词:PTEN基因, 慢病毒载体, RNA干扰, 逃避RNA干扰策略结构, 脱靶效应
摘要:目的:构建人PTEN基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体.方法:利用Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的PTEN基因RNAi有效靶序列,设计并合成靶序列的oligoDNA,退火形成双链DNA,与经Xba I和XhoⅡ酶切后的pFLRu-GFP载体连接构建成pFLRu-U6-shPTEN慢病毒载体.在此基础上,引入外源设计的PTEN mRNA,与经EcoR I和BamH I酶切后的pFLRu-U6-shPTEN载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人PTEN基因shRNA及其救援cDNA同时表达的RESC慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN.2者均转入到大肠杆菌XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定.分别用pFLRu-U6-shPTEN、pFLRu-U6-rrshPTEN与pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G质粒共转染293/包装细胞,包装产生2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度.结果:氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U6前引物测序鉴定结果显示pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN均为阳性克隆,且2种慢病毒的滴度分别为6.6 × 105和5.6 × 105pfu/mL.结论:成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体.有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究PTEN基因功能提供了稳定的转染细胞载体.
郑州大学学报(医学版)杂志相关文献
  • 亲属活体肾移植171例分析

    目前肾移植供肾紧缺的问题日益突出,亲属活体供肾已成为缓解供肾来源紧张的重要途径[1-2].我国亲属活体肾移植起步较晚,但近年来增加趋势明显[3-4].2005年11月至2009年4月,郑州大学第一附属医院共进行亲属活体肾移植171例,效果良好,报道如下.

    作者:丰贵文;尚文俊;王跃;庞新路;郭文治;乔保平;刘磊 刊期: 2010年第03期

  • 准分子激光原位角膜磨镶术切削光区直径对球差的影响

    目的:探讨准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)不同直径治疗光学区术后球差的变化.方法:对157例(314眼)近视和近视散光眼分为低度、中度和高度近视,各类人群根据治疗光区直径5.0、5.5和6.0 mm再分为a、b和C亚组进行LASIK,用博士伦Zywave波前像差仪测量术前和术后3个月6 mm瞳孔直径下球差.结果:①术前低度近视组a、b和c亚组球差均方根值(RMS)分别为(0.12±0.08),(0.11±0.07)和(0.10±0.06);中度近视组各亚组球差RMS值分别为(0.11±0.07),(0.12±0.06)和(0.12±0.07);高度近视组各亚组球差RMS值分别为(0.13±0.08),(0.12±0.08)和(0.11±0.09).术前低度、中度和高度近视组各亚组球差RMS值比较差异无统计学意义(F=0.565,0.624和0.376,P均>0.05).②术后低度近视组a、b和e亚组球差RMS值分别为(0.34±0.06),(0.32±0.09)和(0.29±0.08);中度近视组各亚组球差RMS值分别为(0.41±0.09),(0.39±0.08)和(0.34±0.08);高度近视组各亚组球差RMS值分别为(0.49±0.06),(0.46±0.07)和(0.42±0.07).术后低度、中度和高度近视组各亚组球差RMS比较差异有统计学意义(F=3.342,9.468和17.948,P均<0.05).结论:LASIK术后球差随着手术切削区直径增加而减少,提示在保证角膜手术安全进行的范围内,可适当增加切削光区直径来减少球差,提高视觉质量.

    作者:王卫群;赵晓金;白燕慧;张金嵩 刊期: 2010年第03期

  • 固相萃取-超高效液相色谱-质谱/质谱法测定蔬菜、水果中多菌灵

    目的:建立一种新的蔬菜、水果中多菌灵的超高效液相色谱-质谱/质谱测定方法.方法:多菌灵通过Oasis HLB固相萃取柱分离浓缩后,采用超高效液相色谱-质谱/质谱仪的正离子模式电离和多反应离子检测模式进行测定,同时对诸如流动相的种类、色谱柱类型、锥孔电压和碰撞能量等参数进行了研究.结果:多菌灵在0.005~1.000 mg/L范围内对响应值具有良好线性关系;样品的加标回收率为87.3%~105.6%,相对标准偏差小于15%(n=6);方法检出限为1.0μg/L.结论:该方法测定特异性好、灵敏度高,定性定量准确,可用于实际样品测定.

    作者:苏永恒;张榕杰;冶保献 刊期: 2010年第03期

  • 干扰素α对不同基因型乙型肝炎病毒抗病毒疗效比较

    乙型肝炎病毒(HBV)根据其全基因序列的同源性可分为8种基因型[1].感染不同基因型的HBV患者的临床经过与药物疗效有一定的差异.作者应用巢式PCR技术对46例慢性乙型肝炎患者感染的HBV进行分型,比较干扰素α对不同基因型HBV感染者抗病毒的疗效.

    作者:李志勤;余祖江;武淑环;孙长宇;江河清;潘延凤 刊期: 2010年第03期

  • 胃癌组织中KISS-1和基质金属蛋白酶-9蛋白的表达

    目的:检测胃癌组织中KISS-1和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达.方法:应用免疫组织化学SP法分别检测45例胃癌组织及配对远离胃癌手术切缘的正常组织中KISS-1和MMP-9蛋白的表达.结果:胃癌组织及配对正常组织中KISS-1蛋白的阳性表达串分别为35.6%(16/45)和88.9%(40/45),2者相比,差异有统计学意义(χ2=16.531.P<0.001);MMP-9蛋白的阳性表达率分别为60.0%(27/45)和8.9%(4/45),2者相比,差异有统计学意义(χ2=17.926,P<0.001).胃癌组织中KISS-1和MMP-9蛋白的表达均与胃癌浸润深度及有无淋巴结转移有关(χ2分别为9.652、5.670和9.050、5.351,P均<0.05).胃癌组织中2者的表达有关联(rP=0.469,P<0,001).结论:KISS-1和MMP-9的表达和胃癌的发生发展及浸润转移有关,联合检测2者有望用于胃癌的早期诊断和预后判断.

    作者:张延新;刘喜民;陈奎生;杜华贞;张云汉 刊期: 2010年第03期

  • 不同性别患者顺式阿曲库铵药效学的变化

    顺式阿曲库铵是较理想的新型中时效苄异喹啉类非去极化肌松药,经Hofmann方式消除,不依赖肝、肾功能,不随年龄的增加而作用时间延长,可安全、有效地用于不同年龄的患者[1-2],反复给药后体内无蓄积,目前已广泛用于临床.临床麻醉一般以患者的体质量、体表面积及年龄等作为给药的参考指标,较少考虑性别的影响.近年来的研究[3]发现,女性对维库溴铵、泮库溴铵和罗库溴铵等肌松药较男性敏感.该研究旨在观察性别是否对顺式阿曲库铵的药效学指标存在影响.

    作者:张卫;李俊建;李治松;常琰子;薛文华 刊期: 2010年第03期

  • Hep-2细胞中bFGF及其双受体系统mRNA的表达

    目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其双受体系统串珠素(perlecan)和高亲和力酪氨酸激酶受体(FGFR)在人喉癌细胞Hep-2中的表达.方法:培养Hep-2和正常永生化表皮细胞系HaCaT细胞,应用RT-PCR方法检测bFGF、perlecan及FGFR1~4 mRNA的表达.结果:bFGF、peflecan、FGFR1、FGFR2及FGFR4 mRNA在Hep-2细胞中的相对表达量高于HaCaT细胞(t分别为17.540、19.684、13.371、12.692和12.586,P均<0.05).2种细胞中均未检测到FGFR3 mRNA.结论:bFGF、perlecan及FGFR与喉癌细胞的生长关系密切.

    作者:陈广理;龚树生;陈沛;罗凌惠 刊期: 2010年第03期

  • 人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达

    目的:克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,构建真核表达载体pEGFP-C3-hTERTp.方法:PCR方法扩增出hTERTp,依次克隆至pGEM-T Easy载体和重组载体pEGFP-C3上.经酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-C3-hTERTp转染人胚肾293A细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果:成功扩增出276 bp的hTERTp,测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致.重组载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞能观察到荧光表达.结论:成功构建了hTERT启动子调控的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-hTERTp,其能够在人胚肾293A细胞中表达.

    作者:董翠;阴志刚;王纯耀;张旭东 刊期: 2010年第03期

  • 河南农村成年人高血压患病率及影响因素

    目的:了解河南省农村地区成年人高血压的患病率及其影响因素.方法:2007年7月至2008年7月,采用随机整群抽样的方法调查河南省新安县35~74岁常住居民高血压的患病率,并采用logistic回归分析其影响因素.结果:共调查16 953人,高血压的粗患病率为33.2%.用2000年全国人口数据标化后,高血压患病率为29.8%,女性高于男性(χ2=81.979,P=0.001).高血压患病串随年龄增加而升高(χ2=1 321.850,P<0.001).在男性中,肥胖(OR=2.952,95%CI=2.443~3.567)、高血压家族史(OR=2.281,95%CI:1.994~2.610)和糖尿病(OR=1.500,95%CI:1.202~1.870)是高血压的独立危险因素,体力活动(OR=0.825,95%CI=0.763~0.891)是其独立保护因素;在女性中,肥胖(OR=2.732,95%CI=2.428~3.075)、高血压家族史(OR=2.573,95%CI:2.320~2.853)和糖尿病(OR=1.334,95%CI:1.131~1.573)是高血压的独立危险因素,体力活动(OR=0.890,95%CI:0.839~0.944)是其独立保护因素.结论:河南农村成年人具有很高的高血压患病率,应控制肥胖、糖尿病和血脂异常,从而防治高血压.

    作者:潘静静;王重建;杨黎明;申明慧;陈小良;梁森;孙亮;胡东生 刊期: 2010年第03期

  • 胃癌组织中Beclin 1和PTEN蛋白的表达

    目的:检测胃癌组织中自噬相关基因Beclin 1和P7EN蛋白的表达情况.方法:采用免疫组化SP法检测62例胃癌组织和36例正常胃组织中Beclin 1和PTEN蛋白的表达.结果:胃癌组织中Beclin 1和PTEN蛋白的阳性表达率分别为40.0%(25/62)和45.2%(28/62,均低于正常对照组的94.4%(34/36)和94.4%(34/36)(χ2分别为27.845、23.800,P均<0.001);胃癌组织分化程度越低,Beclin 1蛋白的阳性表达率越低(χ2=26.230,P<0.001);组织浸润深度越深、分化程度越低、伴淋巴结转移的胃癌组织PTEN阳性表达率越低(χ2=10.020、23.296和11.610,P均<0.001).胃癌组织中Beclin 1和PTEN的表达呈正关联(rP=0.578,P<0.001).结论:自噬活性的改变可能与胃癌的发生发展有关.

    作者:郭长青;邵经浩;卢瑞利;曹新广 刊期: 2010年第03期

  • 胃癌组织中MTA1蛋白及微血管密度检测

    目的:研究正常胃黏膜及胃癌组织中MTA1蛋白和微血管密度(MVD)的表达情况及相互关系.方法:采用免疫组织化学法分别检测12例正常胃黏膜及63例胃癌组织中MTA1蛋白及MVD的表达情况.结果:正常胃黏膜及胃癌组织中MTA1蛋白阳性表达率分别为33.3%(4/12)和80.9%(51/63,差异有统计学意义(χ2=9.380,P=0.002);MVD值分别为(18.25±8.35)和(45.38±8.69),差异有统计学意义(t=9.974,P<0.001);胃癌组织中MTA1蛋白的表达与胃癌的浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关(χ2分别为8.129、12.770和6.254,P均<0.05);MTA1蛋白表达者MVD值(47.49±7.69)高于MTA1蛋白未表达者(36.77±5.71)(t=5.265,P<0.001).结论:MTA1蛋白过表达可能是胃癌浸润、转移和微血管生成的一个促进因素.

    作者:林存侠;温洪涛;张蕾;张云汉 刊期: 2010年第03期

  • 顺铂联合葛根素纯品和葛根粗提物对H446细胞增殖及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

    目的:观察顺铂(DDP)单独及联合葛根素纯品(sP)和(或)葛根粗提物(CP)对小细胞肺癌H446细胞增殖及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响.方法:取对数生长期的H446细胞,随机分为16组,运用噻唑蓝法测定不同质量浓度DDP(1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L)单独及联合80 mg/L SP和(或)CP对H446细胞的增殖抑制率,运用免疫细胞化学染色法测定16组细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达,运用析因设计方差分析法分析检测结果.结果:析因设计方差分析结果显示:不同质量浓度DDP(F=3 973.386,P<0.001)、SP(F=468.017.P<0.001)和CP(F=789.757,P<0.001)对H446细胞的增殖抑制不同,随着DDP质量浓度的增高,联合80 mg/L SP和80 mg/L CP对H446细胞的抑制越明显;DDP联合SP(F=70.686,P<0.001)、DDP联合CP(F=87.191,P<0.001)及DDP联合SP和CP(F=28.471,P<0.001)对H446细胞增殖抑制作用增强.DDP、SP和CP上调Bax蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达.结论:联合应用SP、CP能增强DDP对H446细胞的增殖抑制作用,该作用可能与上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达有关.

    作者:韩萍;赵妍娟;裴兰英;朱明君;王旗;时宝庆 刊期: 2010年第03期

  • 河南汉族缺血性脑血管病患者胱硫醚β-合成酶基因T27796C多态性检测

    目的:探讨胱硫醚β-合成酶(CBS)基因T27796C多态性与河南汉族人群缺血性脑血管病的关系.方法:运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对92例缺血性脑血管病患者(包括血栓性脑梗死、腔隙性脑梗死和短暂性脑缺血发作)及52例对照进行CBS基因T27796C多态性检测.结果:病例组CBS基因T27796C T/T、C/T和C/C基因型频率分别力29.3%、57.6%和13.0%,T和C等位基因频率分别为58.2%和41.8%,对照组T/T、C/T和C/C基因型频率分别为13.5%、61.5%和25.0%,T和C等位基因频率分别为44.2%和55.8%.2组CBS基因T27796C C/C基因型频率相比,差异有统计学意义(χ2=6.344,P=0.012);C等位基因频率相比,差异也有统计学意义(χ2=5.171,P=0.023).结论:CBS基因T27796C突变可能与缺血性脑血管病有关.

    作者:路燕;滕军放 刊期: 2010年第03期

  • 上皮性卵巢癌组织中泛素与细胞周期蛋白B1的表达

    目的:检测上皮性卵巢癌组织中泛素(Ub)与细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)的表达情况.方法:应用免疫组织化学SP法检测20例正常卵巢组织、20例卵巢良性肿瘤组织及50例上皮性卵巢癌组织中Ub和Cyclin B1蛋白的表达.结果:上皮性卵巢癌组织中Ub和Cyclin B1蛋白的阳性表达率分别为34.0%(17/50)和42.0%(21/50),与正常卵巢组织的5.0%(1/20)、5.0%(1/20)和卵巢良性肿瘤组织的10.0%(2/20)、15.0%(3/20)相比,差异有统计学意义(P=0.014;χ2=11.841,P=0.003).上皮性卵巢癌组织中Ub和Cyclin B1蛋白的表达与FIGO分期(χ2=4.529,P=0.033;χ2=5.520,P=0.019)、分化程度(χ2=5.451,P=0.020;χ2=5.889,P=0.015)和淋巴结转移(χ2=6.269,P=0.012;χ2=6.226,P=0.013)有关.上皮性卵巢癌组织中Ub和Cyclin B1蛋白的表达有关联(χ2=5.451,rP=0.314,P=0.020).结论:Ub和Cyclin B1可能协同参与上皮性卵巢癌的恶性进展和转移,可用于评估上皮性卵巢癌的恶性程度及预后.

    作者:史惠蓉;卫玲;张瑞涛 刊期: 2010年第03期

  • 林县食管鳞状细胞癌患者膳食中维生素和矿物质分挝

    食管癌是一种严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤,河南省林县是其高发区之一.研究[1]显示随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,食管癌的危险因素也发生了变化.据统计[2]在食管癌引起的死亡中约有35%的患者膳食结构不合理,主要为少食新鲜蔬菜、水果,喜食腌制及烟熏食物等.为研究林县食管癌与膳食营养素的关系,由经过统一培训的人员于2007至2009年在林县对当地居民进行了膳食频率问卷调查.

    作者:崔艳玲;陈萍萍;韩洁;刘艳华;张静;吕全军 刊期: 2010年第03期

  • 食管鳞状细胞癌组织中Survivin与Caspase-3蛋白的表达

    目的:检测人食管鳞状细胞癌组织中Survivin与Caspase-3蛋白的表达情况.方法:采用免疫组织化学SP法检测60例食管鳞状细胞癌及60例正常食管黏膜组织中Survivin及Caspase-3蛋白的表达情况,分析其与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系及2者表达的关联性.结果:食管鳞状细胞癌组织中Survivin蛋白的阳性表达率为51.7%(31/60),高于正常食管黏膜组织的8.3%(5/60)(χ2=26.825,P<0.001);且食管鳞状细胞癌组织中Survivin蛋白的阳性表达率与浸润深度(χ2=8.721,P=0.003)和淋巴结转移情况(χ2=13.158,P<0.001)有关.食管鳞状细胞癌组织中Caspase-3蛋白的阳性表达率为40.0%(24/60),低于正常食管黏膜组织的81.7%(49/60)(χ2=21.860,P<0.001);且食管鳞状细胞癌组织中Caspase-3蛋白的阳性表达率与浸润深度(χ2=6.123,P=0.013)和淋巴结转移情况(χ2=5.884,P=0.015)有关.食管鳞状细胞癌组织中Survivin与Caspase-3蛋白的表达有关联(χ2=5.384,rP=0.300,P=0.020).结论:Survivin蛋白高表达、Caspase-3蛋白低表达可能参与食管鳞状细胞癌的发生发展.

    作者:王涛;侯桂琴 刊期: 2010年第03期

  • 重度脑水肿蝶骨嵴脑膜瘤显微手术治疗17例

    蝶骨嵴脑膜瘤毗邻颅底的重要神经血管结构,与颈内动脉及其分支、下丘脑及视神经等关系密切,临床治疗较为棘手,合并重度脑水肿时,手术风险更高,难度更大.2006年9月至2008年12月作者采用显微手术治疗重度脑水肿蝶骨嵴脑膜瘤17例,效果满意,报道如下.

    作者:庞长河;龙江;孙剑瑞;魏新亭;宋来君 刊期: 2010年第03期

  • 人型支原体对人绒毛蜕膜组织TNF-α、IL-10及PGE2的影响

    目的:观察人型支原体(Mh)对人绒毛蜕膜组织的致炎作用.方法:分别用PPLO培养基(阴性对照组)、终浓度为102、104、106CCU/mL的Mh浓缩悬浮液(Mh低、中及高浓度组)及5 g/L脂多糖(阳性对照组)刺激人绒毛蜕膜组织0、6、24、36和48 h后,ELISA法检测TNF-α、IL-10及前列腺素2(PGE2)的产生情况.结果:刺激6~48 h,5组同一时间点及同一组不同时间点人绒毛蜕膜组织TNF-α、IL-10及PGE2生成量差异均有统计学意义(P均<0.001,Mh高浓度组能明显诱导上述3种介质的产生,但PGE2的产生晚于TNF-α和IL-10,与脂多糖效应基本一致.结论:蜕膜组织抗炎效应是非特异性的,低剂量Mh并不能诱导人绒毛蜕膜组织明显的炎症反应.

    作者:张群锋;黄余良;刘珏;李梅清;周建斌 刊期: 2010年第03期

  • 人脂肪间充质干细胞体外分化为视网膜细胞观察

    目的:研究成人脂肪间充质干细胞(hAD-MSC)体外诱导分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)、光感受器细胞和血管内皮细胞的情况.方法:分离、培养和鉴定hAD-MSC,用血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子诱导hAD-MSC向血管内皮细胞分化,并检测血管内皮细胞标志物血管内皮细胞Ⅷ因子(vWF)的表达情况.制备hAD-MSC体外诱导液,用诱导剂和诱导液共同诱导hAD-MSC向视网膜细胞分化,采用免疫荧光法检测hAD-MSC经诱导后表达光感受器细胞标志物视紫红质(Rhodopsin)和RPE细胞标志细胞角蛋白(Pan-CK)的表达情况.结果:免疫荧光法证实,分离培养的hAD-MSC经体外诱导后可表达RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞的标志Pan-CK、Rhodopsin和vWF.结论:hAD-MSC经过体外诱导可以向视网膜RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞分化.

    作者:晁炜静;李康华;戴荣平;韩钦;闫曦;赵潺;于伟泓;董方田;赵春华 刊期: 2010年第03期

  • 以问题为基础的学习教学法在临床护理教学中的应用

    以问题为基础的学习PBL(problem based learning,PBL)教学法是一种新的教学模式.与传统教学方法不同的是,PBL教学法强调以问题为基础,围绕问题查阅资料,进行思维、推理并讨论,能够充分调动学生的学习积极性,形成学生自主学习的能力[1].因此,PBL教学法在培养学生独立解决实际问题的能力和开发创造性思维等方面具有明显的优势[2].2009年7月到2009年12月,作者在实习护生临床护理教学中引入PBL教学法,效果较好,报道如下.

    作者:张利霞;郑蔚;杨展;李红哲 刊期: 2010年第03期

郑州大学学报(医学版)杂志

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主办:郑州大学