杨笑萍；刘寿荣
目的 评估两种等温扩增方法在二代测序(Next generation sequencing,NGS)病毒鉴定中的应用,为利用二代测序进行病毒鉴定提供参考.方法 选取了两份病原已知的重症肺炎病人咽拭子,分别采用单引物等温扩增(Single primer isothermal amplification,SPIA)和多重置换等温扩增(Multiple displacement amplification,MDA)的方法进行反转录扩增.扩增产物进行NGS测序和宏基因组学分析.结果 SPIA扩增产物片段较短,扩增效率较低;而MDA扩增的产物片段较长,扩增效率也高.SPIA法在两份样本中均检测到目标病原,且目标病原基因组覆盖度较高.MDA在其中一份样本中未能检测出目标病原.结论 SPIA与MDA扩增方法均可用于NGS病原鉴定.SPIA法扩增效率较低,成本较高,但检测病原的能力高于MDA.
作者：邹晓辉；赵翔；冯兆民；王大燕；舒跃龙 刊期： 2016年第02期
目的 研究人冠状病毒(Human Coronavirus,HCoV) OC43的基因型分布特点,为阐明HCoV-OC43的分子流行规律提供数据参考.方法 从2013年-2015年HCoV-OC43检测阳性的呼吸道样本中提取核酸,用逆转录方法扩增cDNA,利用特异性引物扩增全长纤突蛋白基因(S)、聚合酶基因(RdRp)和核蛋白基因(N).用Mega 6.0软件进行序列拼接、进化树构建和S蛋白氨基酸比对.结果 从16份HCoV-OC43阳性样本中获得全长S、RdRp和N基因.其中2013年的1株为D基因型,2014年的8株均为D基因型,2015年的7株中包括3株B、3株D和1株E(CH)基因型.B和D基因型的S蛋白分别有9个和16个氨基酸位点的突变与分离年份有关,B基因型中氨基酸突变呈累加现象,D基因型中出现连续突变和回复突变.结论 HCoV-OC43表现为多基因型共流行,D基因型高流行.抗原蛋白S的氨基酸突变在各基因型流行中起重要作用.本研究为完善和丰富对HCoV-OC43的分子流行特征的认识提供了数据参考.
作者：贾宝迁；肖艳；王营；任丽丽；王健伟 刊期： 2016年第02期
目的 了解2012年12月至2013年1月期间我国广州5起胃肠炎暴发诺如病毒的分子流行病学特征.方法 收集2012年12月至2013年1月广州市5起胃肠炎暴发(A-E)共274份粪便标本和流行病学资料,利用RT-PCR方法对诺如病毒进行检测,对扩增产物进行序列测定.用Clustal X 1.83和MEGA 5.05生物软件对诺如病毒序列进行序列比对和系统进化分析.用SPSS17.0软件进行统计分析.结果 诺如病毒的总阳性率为20.07％(55/274),其中,A高校诺如病毒阳性率为8.70％(2/23)、B幼儿园为36.36％(8/22)、C高校为36.07％(22/61)、D社区卫生中心为100％(5/5)、E高校为11.04％(18/163),60岁及以上年龄组诺如病毒阳性率为100％(6/6),10-19岁年龄组为47.37％(9/19),9岁及以下年龄组为36.36％(8/22).系统进化分析表明33份成功分型的阳性标本均为诺如病毒GⅡ.4型新变异株Sydney 2012感染.结论 诺如病毒是引起广州市急性胃肠炎暴发的主要病原之一,GⅡ.4型新变异株Sydney 2012是当年流行的优势毒株.
作者：谢华萍；耿进妹；刘静雯；陈纯；蔡文锋；狄飚；袁俊 刊期： 2016年第02期
目的 探讨适应性免疫应答(adaptive immune response)中CD4+T淋巴细胞在不同HBV感染状态患者中功能的差异.方法 采集健康成人(healthy individuals,HI)、急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)、慢性HBV感染免疫耐受期(immune tolerance phase,IT)和免疫清除期(immune clearance phase,IC)患者的外周静脉全血.应用流式细胞术检测外周血CD4+T细胞频数,表面功能分子CD69表达,Th1、Th2亚群细胞频数及Th1/Th2比值,并分析其在HBV感染不同状态患者中的差异.结果 共收集健康人、急性乙型肝炎、慢性HBV感染免疫耐受期和免疫清除期患者各12、33、30、49例.急乙肝组CD4+T细胞频数(AHB,39.99±8.00％)显著高于免疫耐受组(IT,33.86±6.87％)和免疫清除组(IC,34.52±9.17％)(F =4.584,P=0.004),其余各组差异无显著性;急乙肝组的CD69分子的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI) (25.56±9.01)也显著高于免疫清除组(21.66±3.38)和免疫耐受组(21.57±5.58)(F=3.291,P=0.023),而AHB、IC、IT、HI各组的CD69分子绝对分子数(absolute molecular count,ABC)依次降低,且差异均有统计学意义(F=15.201,P=0.000).HBV各感染状态的Th2/Th1比值均无显著性差异(1.76±0.54,1.57±0.59,1.76±0.67,P＞0.05).结论 急性乙型肝炎患者的CD4+T细胞频数及细胞表面活化分子CD69均显著高于慢性HBV感染组;Th2型应答在HBV各感染状态的CD4+T细胞应答中均占主导地位.
作者：张丹；李明慧；屈晓晶；靳丽；张璐；路遥；谢尧；刘顺爱；成军 刊期： 2016年第02期
目的 为了更加直观地观察腺病毒(Adenovirus,Ad)与细胞之间的相互作用,本研究拟构建一株经绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)标记(pⅨ)蛋白的5型重组腺病毒(Ad5-IXGFP).方法 我们将GFP基因构建至腺病毒穿梭质粒pShuttle中Ⅸ基因3'端,通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内的同源重组,获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXGFP.将pAd5-IXGFP质粒经Pac Ⅰ酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒Ad5-IXGFP.结果 经扩增和超速离心纯化后可获得浓度为6.9×1011 vp/ml的重组腺病毒.该病毒于4℃与HEp-2细胞孵育后,重组病毒吸附于HEp-2细胞表面,用荧光显微镜观察,可见绿色荧光.结论 利用反向遗传学技术对重组腺病毒外壳蛋白pⅨ进行修饰,成功制备的经GFP标记的重组腺病毒可用于实时动态追踪腺病毒颗粒感染细胞的过程.
作者：邹小辉；郭小娟；王敏；屈建国；鲁茁壮；洪涛 刊期： 2016年第02期
文章总结分析了作者在从事科研院所外事管理岗位工作实践中的阶段性认识,通过对日常基本工作方法和流程的深入思考,分析出目前科研院所外事管理工作在管理主动性、创新性、精细化水平、服务观念和意识等方面的提升空间,并有针对性的提出优化思路和建议,通过充分履行岗位职责、优化工作流程等途径,增强工作主动性,建立科学系统的精细化管理体系,提高工作效率和服务水平,充分发挥管理工作的导向效能,促进科研事业发展.
作者：徐晶 刊期： 2016年第02期
目的 探索实验室高通量检测前临床样本中病毒核酸特异性纯化富集的方法.方法 以负链RNA病毒发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)为模拟样本,针对病毒基因组S、M和L三个片段设计杂交探针,并进行5'端生物素修饰,与链霉亲和素修饰磁珠共价结合,纯化样本中SFTSV核酸,比较研究特异性纯化富集对样本二代测序效果的影响.结果 cDNA文库制备时全转录组扩增前或后进行特异性富集纯化均较不开展富集纯化有显著改善,有效数据比例分别为5.57％、6.39％、2.71％,差别具有显著性(x2=9 799.8,P＜0.001).对全转录组扩增前或后进行特异性富集纯化对测序结果进行比较分析时发现,扩增后进行纯化优于扩增前(P＜0.001).结论 基于核酸杂交的病毒基因组特异性富集纯化方法可有效降低二代测序中背景值,提高测序效率,具有高通量检测前特异性纯化富集样本的作用.
作者：王利静；刘林；李建东；李伟红；张硕；梁米芳；李德新 刊期： 2016年第02期
目的 了解儿科门诊流感样病例和住院严重急性呼吸道感染病例中人偏肺病毒(hMPV)感染状况、病毒基因特征.方法 选取2011-2013年杭州地区哨点医院,儿科呼吸道门诊、住院病例共2 593例,流感样病例采集咽拭子1 676份,住院重急性呼吸道感染病例采集气管吸取物917份.用实时荧光RT-PCR方法检测hMPV核酸,阳性样本用RT-PCR方法对hMPV融合蛋白(F)基因片段扩增、序列与基因分型.实验结果作描述性统计和样本率的卡方检验.结果 门诊检出率6.62％(111/1 676),住院检出率6.32(58/917),检出率差异无统计学意义(x2=0.086,P=0.769).门诊与住院hMPV性别检出率差异无统计学意义.＜1岁组住院患儿检出率(6.33％,43/679)高于门诊(2.79％,19/681),差异有统计学意义(x2=9.808,P=0.002).hMPV阳性患儿平均年龄门诊(31.33±18.50月)＞住院(10.41±8.28月).冬季门诊检出率13.56％(59/435)高于住院8.06％(20/248),差异有统计学意义(x2=4.669,P=0.031).hMPV共感染检出率住院(31.04％,19/58)高于门诊(18.01％,20/111),差异有统计学意义(x2 =4.663,P=0.031).门诊和住院hMPV均以A2亚型多,不同基因型的临床特征不明显.结论 门诊与住院hMPV感染率无差异,hMPV阳性患儿平均年龄门诊大于住院,冬季hMPV检出率门诊高于住院,门诊与住院hMPV共感染主要病原不同,研究期间门诊与住院基因型均以A2为主.
作者：寇宇；于新芬；李钧；杨旭辉；周银燕；潘劲草；谢立；孙昼；濮小英 刊期： 2016年第02期
目的 对高载量标本HBV-DNA稀释检测时稀释液进行选择和评价,期望筛选出较为理想适用于临床的稀释液.方法 以阴性质控品作为标准稀释液,阴性血清、生理盐水、蒸馏水作为候选稀释液,分别对定值标准品(浓度为2.00×109 IU/ml)进行10倍、100倍的稀释检测,比较使用候选稀释液与标准稀释液的检测结果,同时进行偏差分析.结果 在10倍稀释时,使用蒸馏水稀释与标准稀释液稀释,其检测结果间差异无统计学意义(=2.04,P＞0.05),偏差小于行业标准规定的总允许误差;使用阴性血清、蒸馏水时检测结果高于标准稀释(P＜0.05),分别有16.67％和20.00％的偏差超过行业标准规定的总允许误差.在100倍稀释时,使用待选稀释液,其检测结果均高于使用标准稀释液时,差异有统计学意义(P＜0.05),且以蒸馏水作为稀释液时的检测结果与以标准稀释液稀释时的检测结果呈良好的线性关系,其公式为Y=0.963X+0.267;使用不同稀释液时偏差均小于行业标准规定的总允许误差,以标准稀释液偏差小,其次为蒸馏水、生理盐水、阴性血清(P＜0.05).结论 在10倍稀释时,适稀释液为阴性质控品与蒸馏水;在100倍稀释时,适稀释液为阴性质控品,其次为蒸馏水、生理盐水、阴性血清,以蒸馏水作为稀释液时,可通过公式y=0.963X+0.267对检测结果进行校正,确保结果更为精确.
作者：汪东剑；余维涛；张晓云；刘冬萍；邱华琴；彭慧琼 刊期： 2016年第02期
目的 获取原核表达过程中自发生物素化的风疹病毒(Rubella Virus,RV)重组抗原E1(RV-E1),并初步评价其抗原性.方法 将2×BirA酶底物(BSP)插入到RV-E1抗原优势表位区域aa 148-295的羧基端,硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)插入到RV-E1的氨基端,密码子优化后全基因合成;在大肠埃希进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化获取生物素化的RV-E1抗原;利用Western Blotting技术对目的蛋白进行鉴定,并建立风疹病毒IgM抗体检测方法,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.结果 获取高度均质的生物素化的可溶性RV-E1抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被RV-E1抗原和TRX抗原单克隆抗体识别,而且可以被标记HRP的链霉亲和素所识别.分别对50份风疹病毒感染阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.结论 RV-E1诊断抗原携带BSP,可以在大肠埃希菌表达过程中自发共价结合生物素分子,并可以作为新型诊断抗原应用于生物素-亲和素ELISA血清学检测中.
作者：苏秋东；郭敏卓；邱丰；贾志远；卢学新；孟庆玲；田瑞光；高燕；毕胜利 刊期： 2016年第02期
乙型肝炎病毒(hepatitis B vlrus,HBV)表面抗原(HBsAg)作为HBV感染的主要标志之一,近年来,其定量检测开始应用于HBV感染状态评估和指导抗病毒疗效分析领域.治疗过程中血清HBsAg水平的下降速度或HBsAg和HBVDNA水平共同下降可预测CHB患者抗病毒治疗的持续病毒学应答及治疗结束后HBsAg的血清学转换.本研究拟对HBsAg的定量分析以及对慢乙肝患者诊疗的指导意义做一综述.
作者：杨笑萍；刘寿荣 刊期： 2016年第02期
目的 建立偏肺病毒逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR),并检测临床样本,了解偏肺病毒感染患儿的临床流行病学特点.方法 针对保守基因F合成引物和探针,制备偏肺病毒转录RNA标准品并建立标准曲线,检测线性范围、低检测限、重复性、灵敏度和特异性.对采集自2010年12月至2011年11月兰州地区急性呼吸道疾病患儿的222份下呼吸道临床标本进行偏肺病毒筛查,同时对阳性标本进行常见呼吸道病毒的共感染筛查,并对偏肺病毒进行相关流行病学分析.结果 方法线性检测范围是10-108拷贝/μl,低检测限是10拷贝/μl,曲线相关系数是1,扩增效率是91.62％,Ct值组内CV值小于2％.以传统PCR产物的测序结果为参照,逆转录实时荧光定量PCR的敏感性和特异性分别是100％和96.17％.偏肺病毒检出22例(9.46％),其中男童13例(5.86％),女童8例(3.60％).春、夏、秋、冬的检出率分别是15.71％、0％、5.08％、11.11％.偏肺病毒载量与混合感染、疾病种类、临床症状差异均无统计学意义.结论 该方法是检测偏肺病毒灵敏度、特异性和重复性均较好的方法;偏肺病毒在兰州地区儿童呼吸道感染中占有重要地位,长期系统的监测具有重要意义.
作者：周杰英；林应标；曹友德；段招军 刊期： 2016年第02期
目的 检测经典Wnt/β-catenin信号通路在朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中的功能状态.方法 运用real time-PCR方法检测了朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中,经典Wnt/β-catenin信号通路调控的靶基因mRNA表达水平;应用Western Blot方法检测稳定感染羊瘙痒因子Chandler株的小鼠神经细胞系SMB-S15中经典Wnt/β-catenin信号通路的相关调控蛋白及靶蛋白的表达.结果 与磷酸戊聚糖治愈的细胞对照SMB-PS相比,SMB-S15细胞中经典Wnt信号通路的靶基因cyclin D1、c-myc、survivin转录水平均有显著下调.经典Wnt信号通路的调控蛋白中,磷酸化p-catenin (Ser33,37,Thr41)表达明显上调,且其靶基因cyclin D1的蛋白表达明显下调,失活形式磷酸化糖原合成激酶(GSK-3β Ser9)表达明显下调.结论 在朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中经典Wnt/β-catenin信号通路被抑制.
作者：孙静；王晶；陈利娜；杨晓东；肖康；陈操；田婵；石琦；董小平 刊期： 2016年第02期
目的 建立甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)协同感染小鼠模型,在该模型中初步探索自噬和凋亡的发生情况.方法 将IAV和SP以不同顺序感染Balb/c小鼠,观察其体重变化和死亡率,检测其肺部IAV和SP滴度、病理改变情况,建立IAV ～ SP协同感染动物模型.使用免疫组化法检测自噬特征蛋白LC3及凋亡特征蛋白Caspase-3的表达情况.结果 IAV～SP组第二次感染后24 h时小鼠肺部IAV和SP滴度高,死亡率也明显高于其他各组,48 h病理改变也为严重.免疫组化结果显示IAV感染早期(24 h～48 h)LC3蛋白表达出现峰值,Caspase-3缓慢上升;晚期(72 h～96 h)Caspase-3蛋白表达出现峰值,而LC3蛋白表达逐渐下降.结论 本研究成功建立了1AV～ SP协同感染动物模型,模型鼠中自噬先于凋亡发生,为进一步研究自噬和凋亡在IAV～ SP协同感染中的作用奠定了基础.
作者：秦臻；王红仁；黄筱钧；罗俊；游江舟；李婉宜；杨远；周琳琳；李明远 刊期： 2016年第02期
目的 了解2007-2014年四川省急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中柯萨奇病毒B组5型(Coxsackie virus B5,CVB5)的基因特征.方法 对四川省2007 ～2014年AFP病例中分离到的10株CVB5进行全VP1区逆转录-聚合酶链(RT-PCR)反应扩增和核苷酸序列测定,构建遗传进化树进行基因特征分析.结果 10株分离株均为D基因型,与CVB5原型株(Faulkner株)之间的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为80.4％ ～ 81.9％和95％ ～97.1％.2014年1株资阳分离株和1株成都分离株VP1区氨基酸序列完全一致,1株南充分离株和1株宜宾分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性均为100％.结论 2007-2014年四川地区AFP病例中分离到的CVB5为D基因型,且遗传特性较为稳定.
作者：马小珍；童文彬；刘李；曹冉冉；陈娜 刊期： 2016年第02期
目的 了解头颈部鳞状细胞癌患者PrP蛋白的表达与临床进展及病理分级的关系.方法 在92例临床诊断的头颈部鳞状细胞癌患者中,通过免疫组化的方法对PrP蛋白在组织中的表达进行检测,同时对PrP蛋白与患者临床进展及病理分级程度的关系进行统计学分析.结果 在92例临床诊断的头颈部鳞状细胞癌患者中,PrP蛋白在肿瘤发生的不同部位其阳性率不同,随着患者的临床病程的进展其阳性率增高,随着肿瘤的病理分级的严重其阳性率增高.结论 PrP蛋白的高表达与头颈部鳞状细胞癌的发生、发展具有一定的相关性.
作者：魏炜；晋俊涛；张宝云；宋韫韬；张乃嵩；董小平；石琦 刊期： 2016年第02期
目的 分析ADAM10对铜离子诱导后的PrP蛋白的剪切特点.方法 常规方法表达、纯化人PrP全长蛋白(aa 23-230),利用氯化铜对纯化后的PrP蛋白进行诱导.用不同浓度的ADAM10对PrP蛋白进行处理,检测诱导后全长蛋白及剪切片段的PK抗性.结果 重组人PrP蛋白经Cu2诱导后具有部分抵抗PK消化的特点.Cu2+诱导后的PrP蛋白可被ADAM10剪切,具有剂量依赖性.ADAM10对Cu2+诱导的PrP蛋白处理后抵抗PK消化的能力明显加强.结论 ADAM10可以剪切Cu2+诱导的PrP蛋白,同时增加了处理后PrP蛋白的PK抗性.
作者：陈操；吕燕；石琦；董小平 刊期： 2016年第02期
目的 研究安徽阜阳2013年冬季手足几病患儿合并其他病毒感染情况.方法 根据手足口病病例诊断标准诊断收集2013年11月-2013年12月安徽阜阳手足口病住院病例及资料,采集患儿血清.使用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血清标本中的细小病毒B19、I型单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的IgM抗体.整理分析患儿合并病毒感染情况.结果 2013年11月-2013年12月45份手足口病患儿血清腺病毒IgM阳性30例(67.7％),呼吸道合胞病毒IgM阳性8例(17.8％),细小病毒B19 IgM阳性8例(17.8％),巨细胞病毒IgM阳性3例(6.7％),单纯疱疹病毒IgM阳性l例(2.2％),血清中未检测出现副流感病毒IgM抗体.同时发现多例合并两种以上病毒IgM阳性现象.结论 2013年阜阳地区冬季手足口病合并腺病毒、呼吸道合胞病毒和细小病毒B19等为主的感染.
作者：于洁；牛军伟；谢涵坤；宋娟；宋芹芹；夏冬；王欣玲；罗小暖；朱红梅 刊期： 2016年第02期
目的 建立灵敏、特异的GIV诺如病毒的荧光定量检测方法.方法 合成针对GIV诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,根据我国新发人GIV诺如病毒序列(GenBank序列号:KC894731)构建荧光定量检测的RNA标准品,对其灵敏度、特异性、重复性进行评估,以传统逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法作为参考评价.结果 该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102拷贝/μl,检测范围为102 ～ 108拷贝/μl;与GⅠ、GⅡ诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒等无交叉反应;批内和批间重复性实验的循环阈值(Ct)变异系数(CV)分别小于1.31％和3.68％;在阳性粪便标本的对比检测中发现,该方法与普通RT-PCR相比具有灵敏度高、能够定量的优势.结论 本研究建立的检测GIV诺如病毒的荧光定量一步RT-PCR法,可应用于G1V诺如病毒的检测.
作者：敖元云；虞结梅；周冬梅；靳淼；李莉莉；段招军 刊期： 2016年第02期
目的 确定我国O1群El Tor生物型霍乱弧菌“噬菌体-生物分型”方案中“溶原性测定”中检测噬菌体的种类,研究溶原性测定的原理.方法 选择O1群El Tor型霍乱弧菌76株、O1群古典株8株、O139群菌株34株,利用溶原性测定方法检测菌株溶原性,检测菌株自发产生的溶原性噬菌体种类,检测阳性和阴性菌株染色体中该前噬菌体基因组,并检测这些菌株对溶原性噬菌体919TP(弧菌噬菌体K139家族)的敏感性.结果 O1群El Tor型菌株溶原性测定为阳性的19株菌,其释放的噬菌体主要为K139家族,具有溶原化的K139噬菌体,并对溶原性噬菌体919TP的敏感性为阴性;O1群El Tor型菌株22株对溶原性噬菌体919TP的敏感性为阳性,溶原性测定全部为阴性,基因组中不含有K139噬菌体;6株O1群古典型菌株溶原性检测为阳性株,但产生的噬菌体不是K139类;0139群菌株中5株溶原性测定为阳性,能检测到溶原性K139噬菌体基因组,并且34株菌全部不能被919TP感染.结论 O1群El Tor型霍乱弧菌“噬菌体-生物分型”方案中溶原性测定指标主要检测的是菌株释放K139类噬菌体的能力,即是否有K139噬菌体的溶原化并释放子代,“对溶原性噬菌体的敏感性”检测的是菌株能否被K139家族噬菌体(919TP)感染,因此生物分型中“溶原性测定”与“对溶原性噬菌体的敏感性”两个指标是相关联的.
作者：申小娜；张京云；付秀萍；李杰；梁未丽；阚飙 刊期： 2016年第02期
中华实验和临床病毒学杂志
主管:实验和临床病毒学杂志
主办：中国科学技术协会
