学术投稿

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

曾建明;刘飞;谭坪海;王丽娜;李沫;陈中华;李松;龙一飞;李有强;陈茶

关键词:人CD96基因, 原核表达, 白血病干细胞, 多克隆抗体
摘要:目的 原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体.方法 构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性.结果 质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37 000;Western blot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合.结论 成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础.
南方医科大学学报杂志相关文献
  • 冠心病患者经皮冠状动脉介入术后并发造影剂肾病的危险因素分析及防治策略探讨

    目的 总结分析接受冠脉介入治疗的冠心病患者发生造影剂肾病(contrast induced nephropathy,CIN)的危险因素、临床预后及防治策略.方法 回顾总结1232例冠状动脉介入治疗中91例并发CIN患者的危险因素、心血管事件及防治策略.结果 术前伴随的慢性肾功能不全、糖尿病和大剂量使用造影剂与CIN的发生密切相关.CIN患者住院期间心源性死亡率,以及术后1年的心源性死亡率、心肌梗死发生率、心血管事件发生率均较非CIN组患者的明显升高.结论 慢性肾功能不全、糖尿病和造影剂剂是3个独立的CIN危险因素,而且GIN可以影响病人的预后.目前加强冠脉介入治疗嗣手术期的综合管理,特别是水化疗法,是目前防治CIN的重要策略.

    作者:郑华;屠燕;马立勤 刊期: 2011年第07期

  • 邻苯二甲酸酐修饰卵清蛋白体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的活性研究

    目的 研究邻苯二甲酸酐修饰卵清蛋白(3-Hydroxyphthalic anhydride-modified ovalbumin,HP-OVA)体外对抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)的活性.方法 采用化学修饰的方法将3-羟基.邻苯二甲酸酐(HP)修饰卵清蛋白(OVA),合成酸酐修饰蛋白HP-OVA;选用HSV-2 333病毒株及非洲绿猴肾细胞(vero 细胞)靶细胞,采用MTT比色法检测HP-OVA的体外抗HSV-2病毒活性及其对Vero细胞的体外细胞毒性;镜检观察HP-OVA对17株阴道收集的乳酸杆菌的抑菌作用.结果 酸酐修饰卵清蛋白HP-OVA对HSV-2病毒具有明显抑制作用,其IC50为23.56±8.33 μg/ml,且其对病毒作用靶细胞毒性较低,CC50>1 mg/ml,对17株阴道乳酸杆菌均无明显抑制作用,MIC>1 mg/ml.结论 酸酐修饰蛋白HP-OVA体外有较好的抗HSV-2病毒的活性,有望被开发为预防性传播性疾病的候选杀微生物剂.

    作者:何丽丽;段江曼;裘佳寅;于飞;刘叔文;李琳 刊期: 2011年第07期

  • 不稳定性心绞痛患者血清生长分化因子15与TIMI危险评分的相关性

    目的 探讨不稳定性心绞痛(unstable angina pcetoris,UAP)患者血清生长分化因子15(GDF-15)与TIMI危险评分的相关性.方法 采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测97例UA患者与30例健康体检者血清GDF-15的表达水平.采用TIMI危险评分方法将UA患者分为3组,比较各组间GDF-15表达水平差异.分析GDF-15与TIMI危险评分的相关性.结果 UA患者血清GDF-15的表达水平显著高于健康体检者,差异有统计学意义(P<0.01);不同TIMI危险评分分组之间血清GDF-15表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.01);血清GDF-15表达水平与TIMI危险评分之间存在相关关系.结论 血清GDF-15的表达水平可以作为UA患者危险分层评估指标.

    作者:邓明尧;吴国平;冯旭霞;罗江宾 刊期: 2011年第07期

  • 结肠液囊管一期修复结肠吻合口漏的动物实验研究

    目的 研制结肠液囊管作为一种安全可靠的新技术对结直肠吻合口漏进行有效的一期修复.方法 将西藏小型猪随机分为2组,处理组与对照组,每组15头,处理组采用结肠液囊管对结肠吻合口漏进行一期修补,对照组以传统一期吻合口漏缝合近段结肠造瘘,二期结肠回纳手术.在修补术后第7、14、21天检测吻合口漏愈合情况:吻合口漏部位的愈合强度--爆破压、愈合部位组织中微血管密度及羟脯氨酸含量.结果 结肠液囊管能够修复结肠吻合口漏,两组均无动物死亡,无肠管狭窄及坏死.术后第7、14天处理组爆破压、羟脯氨酸含量、微血管密度均高于对照组,但术后第21天两组无显著性差别.结论 应用结肠液囊管技术一期修复结肠吻合口漏是安全、可靠且有效.特别是在结直肠吻合口漏48~72 h以上,腹腔严重感染的环境下能有效修复结直肠吻合口漏.

    作者:王纯忠;黄宗海;沈三弟;史福军;陈飞;李建国;张全安 刊期: 2011年第07期

  • 鼻咽癌中MAP3K5和Epstein-Barr病毒编码的miR-BART22表达的关系及意义

    目的 研究鼻咽癌中MAP3K5和Epstein-Barr病毒编码的miR-BART22的表达及其相关性.方法 收集53例鼻咽癌石蜡档案标本和30例鼻咽黏膜慢性炎标本,分别行EBER和miR-BART22原位杂交及MAP3K5免疫组化检测;另分别选取10例鼻咽癌和鼻咽黏膜新鲜标本提取蛋白行MAP3K5的Western blot检测.结果 53例鼻咽癌EBER均阳性,49例miR-BART22阳性;30例鼻咽黏膜慢性炎EBER和miR-BART22均阴性.MAP3K5在53例鼻咽癌组织中50例为阴性,癌巢周围粘膜组织呈阳性表达,3例弱阳性(+)表达.30例鼻咽粘膜慢性炎中,25例强阳性表达(++~+++),3例弱附性(+)表达,2例阴性;鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎MAP3K5差异具有统计学意义(P<0.001);Western blot检测结果黏膜慢性炎MAP3K5蛋白表达值高于鼻咽癌(P=0.029).MAP3K5和miR-BART22表达呈负相关(P<0.001).结论 MAP3K5在鼻咽癌组织中表达水平低于黏膜上皮组织.MiR-BART22与之相反,在鼻咽癌中高表达,而黏膜慢性炎中缺乏.MAP3K5和miR-BART22在鼻咽癌中表达呈负相关.根据以上实验和相关文献,我们推测MAP3K5町能是EB病毒miR-BART22靶标基因,EB病毒miR-BART22通过抑制MAP3K5的表达,使相应磷酸化MAP3K5蛋白减少,进而下调MAPK通路下游基因蛋白的磷酸化,并行使对NPC细胞抑制凋亡、阻止分化并促进免疫逃逸等作用.

    作者:江庆萍;刘少颜;何秀芳;彭娟;熊汉真;熊中堂;杨獄鑫 刊期: 2011年第07期

  • 粒细胞集落刺激因子对骨髓和外周血中骨髓来源的抑制细胞影响的初步研究

    目的 探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)用于造血干细胞动员对健康供者骨髓和外周血中骨髓来源的抑制细胞(MDSC)的影响和MDSC与移植物抗宿主疾病(GVHD)的关系.方法 对12例健康造血干细胞供者,在G-CSF动员前和动员后第5天分别获取骨髓、外周血及外周血干细胞采集物,用流式细胞术检测其中MDSC的含量变化,统计分析MDSC与GVHD的关系.结果 在正常生理状态下,健康供者外周血、骨髓中均能检测到MDSC,MDSC在外周血中占单个核细胞比例为(1.35±0.35)%,骨髓中为(2.44±1.11)%,骨髓中MDSC比外周血中高(P=0.015);G-CSF动员5 d后MDSC在外周血中占单个核细胞比例为(4.01±1.82)%,骨髓中为(4.38±2.19)%,动员后骨髓与外周血中MDSC比例相比无明显变化(P=0.083).动员后外周血中MDSC含量明显高于动员前(P=0.047),而动员前后骨髓MDSC细胞比例变化无统计学意义(P=0.761).采集物中MDSC细胞数量与GVHD发生率呈明显负相关关系(P=0.048).结论 健康人PB与BM中均能检测到MDSC,且骨髓中比外周血中要高;G-CSF能动员骨髓中MDSC到达外周血,使外周血中MDSC增高;G-CSF动员的外周血干细胞采集物中MDSC增加与造血干细胞移植后低GVHD发生率有关.

    作者:凌奕文;刘启发;刘灿;吴秀丽;陈银葵;范志平;宣丽;张钰;江千里;赵婕;孙竞 刊期: 2011年第07期

  • 调强或三维适形放疗联合TP方案化疗治疗局部中晚期食管癌的临床研究

    目的 观察评价调强或三维适形放疗联合多两他赛与顺铂治疗局部中晚期食管癌的疗效及不良反应.方法 局部中晚期的60例食管癌患者随机分为两组:A:30例调强放疗联合TP(多西他赛及顺铂)方案化疗组,B:30例三维适形放疗联合TP(多西他赛及顺铂)方案化疗组.放射剂量为64 Gy/30次/6周.结果 近期疗效,总有效率(CR+PR)调强化疗组的90%好于适形放疗组的80%,但两组比较差异没有统计学意义(P>0.05).1、2、3年生存率分别为调强化疗组86.7%、70.0%、66.7%及适形化疗组的70.0%、63.3%、63.3%,两组比较差异没有统计学意义(P>0.05).比较两组肺V20、V30,调强化疗组有优势(P<0.05),两组急性放射性食管炎比较差异不大,无统计学意义(P>0.05).结论 调强放疗联合TP(多西他赛及顺铂)方案化疗治疗局部中晚期食管癌在目前是一种较有效的方法.

    作者:林晓丹;石兴源;周同冲;张伟军 刊期: 2011年第07期

  • 槲皮素对成年大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的影响

    目的 观察槲皮素对成年大鼠局灶性脑缺血后侧脑室室管膜下区(SVZ)细胞增殖的影响.方法 线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型,术后6 h腹腔注射槲皮素(50mg/kg,1次/3 d),术后4 h腹腔注射BrdU(50mg/kg,1次/d),分别于缺m第7、14、21天采用免疫荧光染色观察侧脑室SVZ BrdU阳性细胞数.结果 脑缺血第7天,缺血侧SVZ BrdU阳性细胞较假手术组明显增多,第14天达峰值,第21大减少(P<0.01).槲皮素组第7天时,缺血侧SVZ BrdU阳性细胞亦明显增多,并随着缺血时间延长明显增加;与缺血组比较,槲皮素组7、14和21 d缺血侧SVZ BrdU阳性细胞数均显著增加(P<0.01),至21 d仍保持高水平.结论 槲皮素可维持成年大鼠局灶性脑缺血后侧脑室SVZ的细胞增殖在较高水平.

    作者:张兰兰;曹琼;胡子有;颜晓慧;吴炳义 刊期: 2011年第07期

  • 风湿性心脏病自身抗原RHDAG1的获得与鉴定

    目的 探索用风湿性心脏病患者噬菌体表达文库构建和免疫筛选方法来研究风湿性心脏病的自身抗原候选分子.方法 提取风湿性瓣膜性心脏病患者心肌组织总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成长链cDNA,用噬菌体载体构建表达文库,用风湿热患者血清免疫筛选该库,对筛选获得的自身抗原基因进行鉴定、生物信息学分析、体外表达、Western blotting鉴定和免疫反应结合性分析.结果 成功构建了风湿性心脏病患者心脏组织噬菌体表达文库,原始文库滴度为3.3×106pfu/ml,重组率为99%,81%外源片段大于1 kb.通过免疫筛选方法获得了自身抗原RHDAG1,该自身抗原与人类角蛋白18同源,能与活动性风湿热患者血清和风湿性心脏病患者血清结合,而与体检健康人血清无结合.结论 构建噬菌体展示文库方法可以有效地用于筛选和获得风湿性心脏病患者自身抗原;本研究提示自身抗原RHDAG1可成为风湿热和威风心病的候选分子标志物.

    作者:孟锦绣;李运雄;朱平;李玲;卢聪;郑少忆;李广华;余细勇 刊期: 2011年第07期

  • 高压球囊扩张术后留置双D-J管治疗输尿管回肠吻合口狭窄

    目的 探讨高压球囊扩张术后留置双D-J管治疗膀胱全切术后输尿管回肠吻合口狭窄的疗效.方法 采用高压球囊扩张术后留置双D-J管治疗输尿管同肠吻合口狭窄17例(23侧);男11例,女6例,平均年龄56.65±6.28岁;单侧狭窄11例,双侧狭窄6例;回肠膀胱术后吻合口狭窄13例,原位回肠新膀胱术后吻合口狭窄4例;对照组采用开放手术治疗膀胱全切术后输尿管回肠吻合口狭窄21例(25侧).结果 试验组17例(23侧)全部随访,治愈12侧,好转7侧,无效4侧,总有效率达82.6%.对照组随访18例(21侧),治愈11侧,好转7侧,无效3侧,总有效率达85.7%,两组间疗效比较无明显差异(P>0.05);试验组平均手术时间(34.12±7.52)min,对照组平均手术时间(87.42±10.35)min,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);试验组手术平均失血量(21.54±6.15)ml,对照组手术平均失血量(203.16±32.67)ml,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05);试验组术后平均住院天数(3.24±0.35)d,对照组术后平均住院天数(10.12±1.19)d,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 采用高压球囊扩张术后留置双D-J管治疗输尿管回肠吻合口狭窄创伤小、安全,疗效较开放手术无明显差异.

    作者:郁华亮;叶林阳;林茂虎;杨渝 刊期: 2011年第07期

  • 同种异体脂肪源干细胞移植对耐力训练大鼠血清生化指标及运动能力的影响

    目的 从筋膜学角度观察同种异体移植脂肪源干细胞(ADSCs)对耐力训练大鼠体内某些血清生化指标活性及运动能力的影响.方法 40只Wistar雄性大鼠随机分成安静对照组(空白对照组)、游泳训练照组(模型组)、安静移植细胞组(实验对照组)和游泳移植细胞组(实验组).模型组和实验组进行力竭游泳训练.力竭游泳训练1周后,实验组与实验对照纽经尾静脉输入ADSCs.游泳训练结束后,记录各组大鼠游泳力竭的时间以及检测血清尿素(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)、血乳酸(BLa)和血红蛋白(Hb)含量.结果 模犁组与空白对照组比较,Hb水平显著降低,血清BUN、LDH、BLa水平均显著升高(P<0.01),力竭时间显著延长(P<0.01);与模型组比较,实验组Hb显著提高(P<0.01),而BUN、LDH、BLa水平均明显降低(P<0.01),力竭时间有较大提高(P<0.01).结论 移植ADSCs可有效延缓了大鼠运动性疲劳的产生,提高了大鼠的运动能力.

    作者:杨会营;陶晖;余美春;杨春;曲戎梅;曾文钦;段富华;余磊;戴景兴;原林 刊期: 2011年第07期

  • 融合蛋白CAC免疫对大鼠海马内注射β-淀粉样肽的作用

    目的 观察融合蛋白CAC(HBcAg与β-淀粉样肽基因重组的原核表达产物)免疫对大鼠海马内注射聚集态β-淀粉样肽(Aβ)的作用.方法 用融合蛋白CAC免疫SD大鼠,通过ELISA方法检测其血清中的Aβ抗体的滴度.当滴度大于1:3000时,给大鼠海马CAl区注射聚集态Aβ1-40.2周后进行行为学测试,病理学检测.结果 融合蛋白免疫5次后,大鼠血清中Aβ体的滴度达到了1:3000.未经CAC免疫的大鼠,在海马内注射AB后,学习记忆能力显著减低,注射区可见细胞损伤和刚果红染色的淀粉样沉积,伴有大量的胶质细胞浸润.CAC免疫大鼠的学习记忆能力有明显改善,淀粉样沉积面积减少或几乎消失.结论 融合蛋白CAC免疫可抑制海马内注射Aβ的毒性作用,促进其降解和排出.

    作者:冯改丰;胡海涛;靳辉;王唯析;钱亦华 刊期: 2011年第07期

  • 大鼠钝性脊髓损伤后BMPR Ia型受体的表达

    目的 观察脊髓损伤后BMPR Ia型受体的表达.方法 运用免疫组织化学方法,首先检测3种BMP受体(BMPR)Ia、Ib、II型在正常成体大鼠脊髓中的表达分布.运用大鼠钝性脊髓损伤模型,以150 kdyn的撞击力直接撞击脊髓,观察动物撞击后1、3、7、14、30、60 d后脊髓中BMPR Ia的表达改变.结果 在正常成年大鼠脊髓中,BMPR Ia、II型受体主要在少突胶质细胞、灰质神经元中表达,在部分星形胶质细胞和大多数小胶质细胞中表达.灰质神经元中未检测到Ib型受体的表达或表达很低.脊髓损伤后,BMPR Ia在星形胶质细胞中表达激剧增加,高表达可持续至损伤后1个月;脊髓损伤诱导脊髓小胶质细胞活化,活化的小胶质细胞中表达BMPR Ia明显增加.结论 大鼠脊髓损伤后,诱导BMPR Ia受体在星形胶质细胞、小胶质细胞激剧增加,BMPR Ia高表达提示BMP信号在胶质细胞的重要病理生理作用,这一发现为进一步研究BMP信号的功能作用提供基础.

    作者:李华凤;江兴华;邹定全;曹启林;吕静;李媛;张慧芳;王亚平 刊期: 2011年第07期

  • 蛋白S基因突变导致深静脉血栓形成的研究

    目的 了解1例青少年起病的复发性深静脉血栓形成(DVT)患者蛋白S(PS)缺乏的分子发病机制.方法 收集患者及其家系成员的血标本,进行凝血和抗凝指标的检测.凝血功能的检测采用一步凝固法,蛋白C、蛋白S的活性检测采用发色底物法,蛋白S抗原检测采用ELISA方法.对患者及其家系成员的PS基因各外显子片段及外显子内含子侧翼序列进行PCR扩增和产物送测序分析.结果 患者及其父亲为遗传性PS缺乏患者,其PS基因第10号外显子发生了C82792T杂合点突变,导致PS蛋白氨基酸肽链第314个精氨酸残基(R)被半胱氨酸残基(C)所替换,发生R314C杂合突变.结论 患者反复发作DVT系由PS基因错义杂合突变导致的遗传性PS缺乏所致,该基因突变为国际上首次报道.

    作者:叶絮;刘晓力;冯莹;周旭红;邢志芳 刊期: 2011年第07期

  • 枸杞多糖对血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞衰老及P53和P16表达的影响

    目的 观察枸杞多糖对血管紧张素II(AngII)诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)衰老及对细胞衰老相关基因P53和P16表达的影响,以探讨其抗衰老作用及机制.方法 体外培养HuVEcs加入终浓度10-6mol/L AngII诱导细胞衰老,建立内皮细胞衰老模型.实验分为空白对照组、AngII模型组和枸杞多糖组;β-半乳糖苷酶染色法鉴定内皮细胞衰老状态;流式细胞技术分析细胞周期变化;CCK-8法检测细胞存活率情况;Western blotting法检测P53、P16蛋白的表达.结果 AngII模型组与空白对照组比较,β-gal阳性染色率明显增多,细胞周期多停滞于G0/G1期,S期细胞逐渐减少,细胞存活率明显下降,P53、P16蛋白表达水平明显上调.给予枸杞多糖处理后改善了细胞衰老状态,β-gal阳性染色率减少,G0/G1期细胞减少,S期细胞逐渐增多,细胞存活率增多,P53、P16蛋白的表达较AngII组下调.结论 枸杞多糖能够抑制AngII 诱导HUVECs衰老,其作用机制可能是通过下调P53及P16的表达而实现的.

    作者:刘凌;王雪妮;刘泽;王鲁妮;吴军;王伟;封菊香 刊期: 2011年第07期

  • ITGA9基因rs189897与rs2212020及其单体型分子标志影响脑梗死发生

    目的 研究ITGA9基因rs189897和rs2212020位点及其单体型与脑梗死的关系.方法 在脑梗死和正常对照样本中,利用PcR-测序方法对rs189897和rs2212020位点进行基因分型,分型结果经SHEsis软件进行单个位点以及两个位点构建的单体型与疾病关联性进行分析.结果 rs189897和rs2212020位点等位基因频率、等位基因型频率在脑梗死患者和正常对照人群巾的分布存在统计学差异(P<0.05),同时还发现其A-C单体型为脑梗死发病的保护因子,拥有该单体型的个体发生脑梗死的机率为不拥有该单体型个体的0.130倍.结论 ITGA9基因rs189897、rs2212020位点与脑梗死发病密切相关,其A-C单体型分子标志是脑梗死发生的保护因子.

    作者:李湘民;李静;曾凤;易红 刊期: 2011年第07期

  • 生长抑素类似物奥曲肽对人胃癌p53和Ras蛋白表达的影响

    目的 探讨生长抑素类似物奥曲肽对人胃癌生长的抑制作用.方法 50例胃癌患者随机分为对照组25例,术前不用药物;奥曲肽组25例,术前奥曲肽100μg皮下注射,1次/d,共7d.术中切除标本送组织学研究.免疫组化法检测胃癌组织p53和Ras蛋白表达情况.结果 与对照组比较,奥曲肽组胃癌组织坏死差异有统计学意义(P<0.05),纤维组织增生明显(P<0.05),p53和Ras蛋白表达有统计学意义(P<0.05).结论 奥曲肽通过抑制人体内胃癌p53和Ras蛋白的表达,从而发挥抑制胃癌细胞生长的作用.

    作者:田蕾;李舒 刊期: 2011年第07期

  • 一种基于图割的交互式脑膜瘤核磁共振图像分割方法

    为实现脑膜瘤核磁共振(MR)图像的精确分割,本文提出了一种新的基于图割的交互式图像分割算法.该方法首先提取高维图像特征,然后利用加权KNN(K-Nearest Neighbor)分类器估计待分类像素属于肿瘤与背景区域的概率,并构造新的能量函数;后采用图割优化方法对能量函数优化求解.对脑膜瘤MR图像的分割实验表明,本方法较基于灰度信息的图割方法在精度上有明显提高.

    作者:李拴强;冯前进;陈武凡;林亚忠 刊期: 2011年第07期

  • 脑干和杏仁中央核的谷氨酸能神经元参与甜味觉的传递与调制

    目的 探讨谷氨酸能神经元是否参与甜味觉感知与调制的脑干和边缘前脑机制.方法 口腔内给予SD大鼠蔗糖溶液和蒸馏水刺激之后,用荧光免疫组织化学方法,观察被激活神经元(c-Fos作为解剖标志)与谷氨酸阳性神经元(谷氨酸囊泡转运体3标记)在脑干和杏仁核中央核的表达.结果 与对照组相比,口腔内给予甜味溶液刺激后,脑干和杏仁核内c-Fos阳性神经元显著增加,共表达神经元也显著增加.结论 脑干和杏仁核中央核参与了甜味觉信息的传递和调控,该作用部分是由谷氨酸介导的.

    作者:赵小林;闫剑群;陈坷;杨雪娟;李金容;张嫄 刊期: 2011年第07期

  • 大鼠Atohl基因真核表达载体的构建及转染293T细胞的实验研究

    目的 利用基因工程方法克隆SD大鼠Atohl基因CDS,构建大鼠核转录因子Atohl的真核表达载体并在真核细胞中表达.方法 从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atohl基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T载体中.测序鉴定后将Atohl基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点(internal ribosome entrysite,IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜、PT-PCR和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果 扩增得到大鼠Atohl CDS区长1056 bp,编码351个氨基酸,与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP),突变为无义突变,不影响蛋白表达.双酶切和测序结果证明Atohl已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染293T细胞48 h后,荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达,PT-PCR和Western blot证实Atohl 的mRNA和蛋白能在293T细胞中正确表达.结论 成功构建了真核表达载体pAtohl-IRES2-EGFP,并在293T细胞中成功表达,为进一步研究Atohl的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础.

    作者:郑国玺;祝康;朱珠;侯瑾;韦俊荣;许珉 刊期: 2011年第07期

南方医科大学学报杂志

南方医科大学学报杂志

主管:广东省教育厅

主办:南方医科大学