学术投稿

PCR产物液相杂交检测的优化

刘宇琴;钟咏梅;郭晏海

关键词:PCR, 液相杂交检测, 优化
摘要:目的为了使液相杂交检测更加灵敏、特异、快速.方法通过改进杂交液的成分,选择佳的探针浓度,使5′端标记生物素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交,杂交条件为:94℃10 s冷却到37℃10 s即完成杂交.杂交后产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测.结果液相杂交的条件优化:杂交液中二甲基亚砜(DMSO)浓度为300ml@L-1,探针浓度为0.5μmol@L-1,杂交温度为37℃.对60~600 bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异,可以检测到1×104copy的PCR产物,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为100%(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清检出HBVDNA阳性率为78.6%(22/28);HBsAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为66.7%(16/24),其余为阴性.结论该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异,适合临床实验室使用.
现代检验医学杂志相关文献
  • 美国Abbott Axsym免疫分析仪性能初步评价

    目的对Abbott Axsym免疫分析仪性能进行评价.方法通过检测HBsAg,对Abbott Axsym免疫分析仪的灵敏度、特异性、正确检测率(可检测性)、重复性、线性及与ELISA检测HBsAg的相关性等指标进行测定.结果Abbott Axsym免疫分析仪的灵敏度达到0.16 μg/L,特异性为100%,正确检测率(可检测性)为99.72%,不同参比血清的总CV值在5.4%~9.4%之间波动,在0.1~100μg/L范围内线性良好(r=0.994 9),与ELISA比较,两法的符合率为97%,结论该仪器设计科学合理,检测快速方便,结果准确可靠,是大、中型医院临床实验室比较理想的免疫分析仪之一.

    作者:王红旗;金晶;成军;孙长贵;孙关忠 刊期: 2003年第02期

  • 血液分析仪红细胞指数质控方法的探讨

    目的探讨血液分析仪红细胞指数的质控方法.方法利用L-J质控空图和某全血质控物提供的有关数据,推理论证红细胞指数[MCV、MCH、MCHC]在控时对其有关测定参数值的新的质控要求.结果红细胞指数有关测定参数值的质控范围应分别为HGB:-x±1.7 s,HCT:-x±1.06 s,RBC:-x±1.06s.超出此范围判定为失控.结论执行该质控判定标准可以实现对红细胞指数实施质控的目的.

    作者:袁应选;阎红;王璇;赵扬 刊期: 2003年第02期

  • 探讨制备尿液微量蛋白质控液

    以乙二醇作为稳定剂制备三种不同浓度的液态质控尿液,并保存于4℃和-20℃,分别作为期一年的稳定性试验,同时作瓶间差分析,结果表明:4℃保存的三种不同浓度的质控尿液分析物M-TP浓度基本稳定;-20℃保存的三种不同浓度的质控尿液,除低浓度的标本外,其余各分析物M-TP浓度也基本稳定,低浓度的标本其M-TP含量约有所降低.瓶间差试验显示三种不同浓度的M-TP含量基本均一,瓶间差极小.认为该院自制的尿液微量蛋白质控液具有可接受的稳定性,可作为室验室推广使用.

    作者:李顺君;黄文方;饶绍琴;杨明清;周敏 刊期: 2003年第02期

  • IL-6免疫放射检测方法的建立及其应用

    采用B淋巴细胞杂交瘤技术,建立分泌抗人IL-6单抗的杂交瘤细胞株;诱生腹水法制备单抗;Protein G免疫亲合层析法纯化单抗;改良的氯胺T法进行单抗的125I标记;在对单抗识别抗原位点鉴定的基础上,建立了稳定、可靠的IL-6免疫放射检测方法(Immunoradio assay,IRA).其灵敏度为5pg/ml,检测范围为5~200pg/ml.采用该法分析的多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者血清中IL-6的含量平均为356pg/ml,明显高于正常对照组的16.9 pg/ml(P<0.01).

    作者:邱玉华;苏成海;谢炜;张学光 刊期: 2003年第02期

  • 微板核酸杂交-酶联显色检测性病沙眼衣原体DNA

    目的建立微板核酸杂交-ELISA方法,检测性病沙眼衣原体.方法采用PCR、核酸杂交和ELISA三大生物技术相结合,建立微板核酸杂交ELISA法,并用此法分别同McCoy细胞培养和免疫学方法检测307份性传播疾病标本进行比较.结果微板核酸杂交-ELISA法检测的阳性率为40.39%(122/307),高于细胞培养的9.77%(30/307)和免疫诊断的12.05%(37/307).结论微板核酸杂交-ELISA技术检测性病沙眼衣原体灵敏度高、特异性好、简便快速.因此,该方法具有很强的实用价值和发展前景.

    作者:任碧琼;田碧文 刊期: 2003年第02期

  • 应用新鲜血校准血液分析仪

    目的应用新鲜血校准血液分析仪.方法在校准STKS基础上,在STKS和ACT diff上分别测定5份新鲜全血,以STKS上的结果为靶值,来计算ACT diff的校正因子.结果校准后的血液分析仪测定结果大大提高了可比性、准确性,相关良好(r=0.921~0.996).结论该法简便、快速、适合临床应用,值得推广.

    作者:赖卫强;李素珍;张秋芳 刊期: 2003年第02期

  • PCR产物液相杂交检测的优化

    目的为了使液相杂交检测更加灵敏、特异、快速.方法通过改进杂交液的成分,选择佳的探针浓度,使5′端标记生物素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交,杂交条件为:94℃10 s冷却到37℃10 s即完成杂交.杂交后产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测.结果液相杂交的条件优化:杂交液中二甲基亚砜(DMSO)浓度为300ml@L-1,探针浓度为0.5μmol@L-1,杂交温度为37℃.对60~600 bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异,可以检测到1×104copy的PCR产物,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为100%(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清检出HBVDNA阳性率为78.6%(22/28);HBsAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为66.7%(16/24),其余为阴性.结论该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异,适合临床实验室使用.

    作者:刘宇琴;钟咏梅;郭晏海 刊期: 2003年第02期

  • TGF-β1在ANA阳性自身免疫病中的诊断意义初探

    目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在自身免疫性疾病诊断中的作用.方法以临床诊断为自身免疫性疾病病例为研究对象,采用双抗体夹心ELISA法,测定了不同滴度ANA阳性及其它自身抗体SSA、SSB、U1-RNP阳性患者血清中TGF-β1的水平.结果ANA 1:1000阳性、ANA 1:10 000阳性患者的TGF-β1水平均显著低于ANA 1:100阳性者(P<0.05);ANA 1:1000和ANA 1:10 000伴有SSA、SSB、U1-RNP(+)患者TGF-β1水平显著低于单纯ANA 1:100、ANA 1:1 000、ANA 1:10000阳性(P<0.05).结论TGF-β1水平的降低与高滴度ANA阳性及部分自身抗体阳性有关,提示TGF-β1对自身免疫性疾病具有辅助诊断作用.

    作者:向英;高春芳;徐玲玲;赵文静;仲人前 刊期: 2003年第02期

  • 用患者样本进行方法学对比及在两种葡萄糖测定法中的应用

    目的用患者样本分析葡萄糖氧化酶-氧电极法(简称电极法)和己糖激酶(HK)法测定血清葡萄糖(GLU)时的偏倚.方法依据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP9-A文件,每天取患者样本8份,分别用两种方法测定血清葡萄糖含量,共测定5 d,记录检验结果,去除离群点,计算线性方程和相关系数,并进行偏倚估计.结果在进行患者葡萄糖测定时,电极法(Y)和HK法(X)测定结果的回归方程为:Y=0.985 7X+0.089 67,r2=0.999 2;电极法和HK法测定结果的预期相对偏倚在GLU=15 mmol/L时为0.80%,GLU=9 mmol/L时为0.44%,GLU=6 mmol/L时为0.00%,GLU=3 mmol/L时为1.67%.结论电极法和HK法测定血清葡萄糖时,测定结果在低浓度时偏倚较大,在中、高浓度时偏倚较小,两法间有良好的相关性.

    作者:陈松劲;俞旭峰;张田新;李红胜 刊期: 2003年第02期

  • 加样时间对ELISA快速一步法检测乙型肝炎血清标志物的影响

    目前,实验室常规做乙型肝炎(HBV)血清标志物检测多采用快速酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunoadsordent Assay;ELISA)一步法,即样本和包被的相应抗体或抗原以及相应酶标抗体同时在30 min内反应完成,而多数实验室仍采用手工加样法,在此过程中如果样本量较大,同一批检样中加在前面的样本与加在后的样本时间相差较大,少则半小时,多则一个小时,这一时间差远超过了样本和酶标抗体同时反应的时间,这样的差异是否对检测结果有影响?为此我们作了相关的实验观察,现报告如下.

    作者:夏吉荣;王富兰 刊期: 2003年第02期

  • 惰性液体包裹待测样本现象及解决方法

    美国泰尔康RA-1000型全自动生化分析仪使用惰性液体防止交叉污染,我们在使用该仪器的过程中碰到如下现象:某些项目的结果常不明原因的很低甚至接近或等于零,而仪器未有任何提示或报警.在不做任何处理的情况下用样本复查有时偶可正常测出,但往往结果仍然偏低.该现象多发生于样品用量较少的项目,如血清总蛋白、白蛋白等.

    作者:罗进才;叶长钦;彭兰芬;江利敏 刊期: 2003年第02期

  • SLE患者血清IL-2、IL-10的表达与双链DNA相关性研究

    目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中IL-2、IL-10的表达与双链DNA(ds-DNA)的关系.方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了22例SLE患者血清中的白细胞介素2(IL-2)、IL-10和抗ds-DNA抗体水平.结果 SLE患者血清中IL-10和IL-10/IL-2比值均与抗ds-DNA抗体呈现较好的正相关性,IL-2与抗ds-DNA抗体呈现低度负相关性或不相关.结论血清中IL-10、IL-10/IL-2比值与抗ds-DNA抗体的相关性可作为SLE患者病情的诊断、监测和疗效观察的指标.

    作者:赵亚军;储萍;李卫党;王震;王君 刊期: 2003年第02期

  • 急性早幼粒细胞白血病细胞形态学分型的研究

    目的解决急性早幼粒细胞白血病(M3)目前国内因粗细颗粒混杂而造成的分型困难.方法以粗颗粒型早幼粒细胞的百分率进行分型,规定:粗颗粒型早幼粒细胞>70%为M3a(粗颗粒型);30%<粗颗粒型早幼粒细胞≤70%为M3b(混合颗粒型);粗颗粒型早幼粒细胞≤30%为M3c(细颗粒型).结果三种亚型在性别、年龄分布上,以及在临床症状、血象、骨髓象上均有不同的表现与特征.结论对于临床治疗和判断预后具有指导意义,并有利于今后以同一分型标准进行学术交流.

    作者:刘瑞锁;王克强;赵辉;晋红梅;杨凤霞 刊期: 2003年第02期

  • 介绍一种周围神经纤维和髓鞘的染色法

    神经纤维和髓鞘的染色法很多,一般均为单一染色.我们经反复试验在镀银后再进行丽春红套染色,显色对比度好,能清晰地分辨神经纤维和髓鞘.同时一些细微组织的成分结构(如神经内膜、神经束膜等)亦明显被衬托出来,为神经病理学的诊断提供了方便.

    作者:李晨薇 刊期: 2003年第02期

  • 酶免疫一步法检测HBsAg的前带现象及其对策

    酶免疫一步法(简称一步法)检测HBsAg因其操作简便、快速省时而被各实验室广泛应用.但在实践中笔者发现对于高滴度HBsAg的标本,该法存在着明显的前带现象,致使高滴度的HBsAg标本漏检.现报告如下:

    作者:毛新友 刊期: 2003年第02期

  • 革兰氏阴性杆菌去阻遏持续高产AmpC酶的检测

    目的探讨酶提取物三维试验法检测革兰氏阴性杆菌去阻遏持续高产AmpC酶(包括染色体型和质粒型)在该院的临床应用价值及分布.方法在常规NCCLS纸片扩散法基础上接种大肠埃希菌ATCC25922,在平皿中央贴一头孢西丁纸片,并在距纸片5 mm处由里向外切割一道狭缝,将酶提取物加入狭缝内.结果由于AmpC酶水解头孢西丁,在狭缝与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区域.使用该法检测标准产酶株大肠埃希菌CT7和临床分离的72株可疑菌,标准株结果准确无误,分离的可疑菌有8株持续高产AmpC酶试验阳性.结论酶提取物三维试验法是一种简单易行,适用于临床试验室快速检测持续高产AmpC酶的有效方法.

    作者:周吕蒙;周讯;余小平;肖剑萍 刊期: 2003年第02期

  • SEBIA电泳仪及其配套试剂测定血清蛋白电泳的方法学评价

    目的评价法国SEBIA电泳仪及其配套试剂测定血清蛋白电泳的性能.方法用混合血清进行批内批间重复性测定;与BECKMAN电泳仪及配套试剂进行比较,做相关性检验;用健康查体标本做室内正常参考值.结果混合血清蛋白电泳的批内和批间重复性较好;与BECKMAN电泳仪比较,五种蛋白组分的相关系数为0.824~0.988;室内正常参考值为:Alb59.06~71.94、α11.49~2.49、α25.98~10.58、β7.22~11.46、γ10.57~19.09.结论SEBIA电泳仪采用高自动化的电泳和染色技术,辅以先进的激光扫描仪及完善的计算机处理,应用优质的琼脂糖凝胶试剂盒,使得血清蛋白电泳操作简便、图谱清晰、分辨率高、重复性好、结果准确.

    作者:王彩云;杨敬芳;田亚平 刊期: 2003年第02期

  • UF-100流式尿沉渣全自动分析仪常见故障分析和排除

    UF-100流式沉渣全自动分析仪系日本希森美康(Sysmex)公司产品,为当今世界上先进的全自动尿液沉渣分析仪,该仪器利用先进的流式细胞技术、电阻法、电导体、激光和荧光染色方法,检测尿液中各种有形成分(白细胞、红细胞、上皮细胞、酵母样细胞、细菌、各种管型、结晶、精子等)产生的不同散射光和荧光强度,经计算机多参数分析,得出图像和定量报告,有助于临床对病情的分析和尿液测定标准化,具有准确、快速、重复性好等优点.

    作者:金志刚;章满红;杨琼 刊期: 2003年第02期

  • 真菌直接检查方法的改进

    氢氧化钾法直接制片检查鳞屑和头发中的真菌菌丝和孢子的方法简便、迅速,被广泛采用.

    作者:朱玲;胡斌;赵兰香 刊期: 2003年第02期

  • OLYMPUS AU 640生化分析仪特殊参数设置及特殊故障排除

    OLYMPUS AU 640是日本OLYMPUS公司生产的带有钾、钠、氯离子选择性电极的较大型全自动生化分析仪.

    作者:幸贵邦 刊期: 2003年第02期

现代检验医学杂志

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主管:陕西省卫生厅

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