人era基因酵母双杂交诱饵载体的构建及其激活作用的检测

程轶梦；吴元明；陈苏民；陈南春；纪宗玲

关键词：基因, 酵母双杂交

摘要：era基因是细菌生存繁殖所必需的重要基因,与细胞周期和细胞分裂有关.era基因首先在大肠杆菌被发现,由于其编码的氨基酸序列与人及酵母的BAS蛋白有部分相似之处,故命名为E.coli RAS-like(era)基因[1].era基因不仅广泛存在于原核生物中,而且在真核生物(如蠕虫、小鼠和人)的组织中都发现有与细菌era高度同源的基因存在[2-4].人era基因的全长cDNA于1998年被克隆,与原核era基因具有很高的同源性.人ERA蛋白与大肠杆菌ERA蛋白的氨基酸序列有30%相同,两者的相似性为53%.人era基因的功能尚不清楚.我们拟采用酵母双杂交技术,克隆了人era结合蛋白基因,研究了人era与其结合蛋白的相互作用,以便对其功能的研究提供依据.

细胞与分子免疫学杂志相关文献

兔抗人BMP-2成熟肽抗血清的制备

目的利用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-2(hBMP-2)成熟肽,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.方法将含有hBMP-2成熟肽基因的表达载体pDH2m,转化大肠杆菌,热诱导表达hBMP-2成熟肽,经纯化、复性后,再用其免疫兔子,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.并以Western-blot和免疫组化方法对抗血清进行鉴定.结果Western-blot结果显示在对应于hBMP-2成熟肽位置有阳性条带,免疫组化结果显示人软骨细胞胞浆阳性着色.结论hBMP-2成熟肽在大肠杆菌中获得高表达,并成功制备了兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.

作者：张斌；蒲勤；李毅；陈南春；陈苏民刊期： 2001年第06期
类风湿性关节炎患者血浆中ET和CGRP的变化及意义

目的探讨内皮素(ET)及降钙素基因相关肽(CGRP)在类风湿性关节炎(RA)发生、发展过程中的作用.方法采用放射免疫分析法,对30例RA患者及20例正常对照组血浆中ET及CGRP的水平进行检测.结果RA患者血浆中ET的水平及ET/CGRP的比值明显升高,CGRP水平明显降低,与正常对照组相比较差异显著(P＜0.01).进一步分析表明,活动期RA患者及关节x线改变为Ⅲ～Ⅳ期的RA患者,血浆ET的水平及ET/CGRP的比值明显高于稳定期及关节改变为Ⅰ～Ⅱ期的RA患者;而血浆CGRP的水平明显低于后者(P＜0.01).结论RA患者体内存在明显地ET及CGRP的平衡失调,且与RA患者的病情严重程度密切相关,提示ET及CGRP参与了RA的发病过程.

作者：石晓彤；王晓非；蒋莉；赵丽娟刊期： 2001年第06期
反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞P16、P21表达的增强作用

目的观察反义端粒酶RNA对SMMC7721细胞周期的影响,检测P16和P21的表达,探讨端粒酶与细胞周期调控间的关系及反义端粒酶RNA在肝癌基因治疗中的意义.方法经脂质体介导,将反义端粒酶RNA真核表达载体pBBS212-hTR导人SMMC7721细胞中.细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、TRAP-PCR-ELISA及免疫组化技术,结合图像分析,在检测SMMC7721/pBBS212-hTR细胞端粒酶活性的同时,检测P16和P21的表达.结果与对照组相比较,反义端粒酶RNA在抑制SMMC7721细胞端粒酶活性的同时,P16和P21蛋白的表达水平显著增高.结论转染反义端粒酶RNA在封闭细胞端粒酶活性表达的同时,伴发1P21与P16表达水平的升高.本实验研究为探讨肝癌发病机制及治疗提供了一定的依据.

作者：张传山；王文亮；马福成；胡沛臻；赵一岭；刘利；张衍国刊期： 2001年第06期
结直肠癌中血管内皮生长因子与p53表达关系的研究

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth fac-tor,VEGF)是一种血管内皮细胞特异的有丝分裂原,对血管的通透性也起重要作用.许多研究表明,肿瘤组织中VEGF的高表达和肿瘤的增殖、转移密切相关[1],但有关VEGF表达的调控机制仍未被彻底阐明,近一些实验表明,头颈部肿瘤、胃癌等肿瘤组织p53基因的突变与肿瘤细胞VEGF的表达有一定的相关性

作者：孟冬娅；薛文成；胡晓芳；胡华；王一楠；罗军刊期： 2001年第06期
长期大量饮酒者的红细胞免疫功能及意义

酒精对人体心、肝和脑等器官的损害已众所周知，其降低人体红细胞的变形性（RCD）也有报道，但其对人体红细胞免疫功能的影响，尚未见报道。为此，我们观察了山东省利津县长期大量饮酒者红细胞免疫功能的状态。

作者：杨文东；王光红；安振国；綦映柳；陈明刊期： 2001年第06期
培养人RPE细胞核因子κB的表达及地塞米松对其表达的影响

目的观察培养人视网膜色素上皮细胞(RPE细胞)核因子κB(Nucleartranscriptionfactor-κB,NF-κB)的表达,及地塞米松对其表达的影响.方法培养人RPE细胞接种于24孔板,随机分为阴性对照组、脂多糖(Lipolysaccharide,LPS)刺激组和地塞米松及LPS作用组,做免疫组化ABC法染色,显微镜下观察.结果对照组NF-κB在培养RPE细胞胞浆中表达,LPS刺激后转入胞核表达,地塞米松作用后,再以LPS刺激,RPE细胞核及细胞浆内NF-κB的表达减弱,胞核中表达水平减弱明显,且减弱的程度与地塞米松浓度有关.结论LPS能够激活RPE细胞的NF-κB使其向核内转入,一定浓度的地塞米松对RPE细胞的NF-κB表达及向胞核转入有抑制作用.

作者：田艳明；惠延年；宋宗明刊期： 2001年第06期
细胞因子对K562/ADM耐药细胞株耐药性的逆转作用

目的探讨细胞因子和抗Pgp单抗(mAb)对K562/ADM耐药细胞株耐药性的逆转作用.方法利用K562细胞的耐阿霉素细胞株K562/ADM,采用免疫细胞化学染色法和流式细胞术,分别检测mAb MRK-16及rhGM-CSF、rhM-CSF或TNF-α对其PgP表达的影响.结果将TNF-α(100 kU/L)、rhGM-CSF(10μg/L)或rhM-CSF(10μg/L)分别单独与K562/ADM细胞孵育48 h,Pgp表达细胞的阳性率分别为72.19%、80.04%和70.30%,与未经任何作用的K562/ADM细胞PgP表达的阳性率(77.02%)相比较,无明显差异(P＞0.05).mAb MRK-16(10 mg/L)以及mAb MRK-16分别与TNF-α或rhGM-CSF共同作用于K562/ADM细胞后,PgP表达的阳性率分别为67.49%、67.14%和70.56%,与K562/ADM细胞的表达率(77.02%)相比较,PgP的表达率虽有降低,但差别不明显(P＞0.05);只有rhM-GSF与mAb MRK-16共同作用(Pgp表达的阳性率为64.29%),可明显抑制K562/ADM细胞上Pgp的表达(P＜0.05).结论rhM-CSF加mAb MRk-16联合应用,具有逆转K562/ADM细胞MDR的作用.

作者：肖东杰；孙善会；张红；申红；刘宗印刊期： 2001年第06期
IgA肾病患者肾间质肥大细胞浸润的临床意义

目的研究肥大细胞(MC)在IgA肾病患者肾间质中的分布及与间质纤维化的关系.方法采用甲苯胺蓝特殊染色法及MC特异酶(即类胰蛋白酶,tryptase)免疫组化染色法,对12例IgA肾病患者肾活检标本中的MC进行了观察.结果(1)肾脏皮、髓质均可见到MC,多见于纤维化区域、血管周围、萎缩或扩张小管周围及肾小球周围.(2)系膜细胞的增殖程度与MC数无关,而随着IgA肾病患者MC的数增加,间质纤维化加重,差异显著(P＜0.025).结论IgA肾病患者的肾间质中存在MC,并与肾间质的纤维化有关.

作者：左巍；赵红；刘亚革；张晓晨；左伟刊期： 2001年第06期
单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞浆区编码基因的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得高纯度的重组单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)糖蛋白B(gB)胞浆区蛋白并制备其特异性抗体.方法从感染HSV-1的BHK细胞中,提取总RNA,用RT-PCR特异性扩增HSV-1gB胞浆区编码基因,经双酶切后,克隆入表达载体pGEX4T-1中,进行融合表达.以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗体,进行Western b1ot鉴定.结果用IPTG诱导后,表达出相对分子质量(Mr)约42 000的融合蛋白.用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备的抗体滴度为1:400.结论获得重组HSV-1 gB胞浆区蛋白及其特异性抗体,为后续功能研究奠定了基础.

作者：李英辉；刘军；薛采芳；甄荣芬；李旬；王宪锋；刘忠湘；万磊刊期： 2001年第06期
大容量人源天然噬菌体抗体文库的建立

随着噬菌体展示技术的发展,抗体库的构建方案日趋成熟,使人们可以从人源噬菌体抗体库中淘选到全人源化的基因工程抗体[1].为抗病毒、抗肿瘤以及自身免疫性疾病等的治疗,开辟了新的途径[2].

作者：张志超；胡学军；张红梅；安利佳；袁晓东刊期： 2001年第06期
SPIDDM家系一级亲属IGT患者NA、胰岛β细胞功能变化的研究

HLA-DQβ链第57位的非门冬氨酸(NA)或门冬氨酸(A)与l型糖尿病的易感性有关.国内外已有广泛报道,这些基因紧密连锁,使各单倍型由亲代完整传递到子代[1].现已明确,糖尿病(DM)家族成员发生糖尿病者远高于非DM家族成员,特别是DM患者一级亲属,在发生DM前有明显的β细胞功能减退[2].糖耐量低减(IGT)是糖尿病的前期表现,本研究通过对IGT患者的HLA-DQβ链第57位NA或A,以及β细胞功能变化的研究,进一步认识成人缓慢进展型l型糖尿病(Slowly pro-gressive IDDM,SPIDDM)家系一级亲属的IGT在糖尿病病程中的地位,这将有助于开展对糖尿病的预防研究[3].

作者：季洪赞；缪东培；段苏友；杨继红；李琳；胡拥军；商玮；邱龄龄；胡兰萍刊期： 2001年第06期
抗HBsAg人IgG在CHO细胞中表达的影响因素探讨

目的探讨CHO-HB2细胞株表达抗HBsAg人IgG的影响因素.方法观察CHO-HB2细胞表达抗体的稳定性,不同培养基以及添加剂的效用,细胞接种密度和培养持续时间的选择,金属离子Zn2+诱导表达的作用,以及滚瓶的培养效果.结果CHO-HB2细胞的亚克隆株F4经液氮冻存半年多复苏后,在无氨甲喋呤(MTX)的培养基中连续传代第2个月,抗体表达量开始下降,5个月时接近用(MTX)施加选择压力前的基础水平.在培养基中添加多种氨基酸和维生素,并加入适量的Zn2+诱导金属硫蛋白启动子,可使表达量明显增加.滚瓶培养可进一步增加抗体的表达量,在无蛋白的无血清培养基中的表达量,从6.2mg/L提高到28mg/L.结论应及时用MTX对细胞株进行再加压筛选,以保持细胞稳定表达抗体的能力.通过优化培养条件,使用完全无蛋白的无血清培养基,可收到较好的效果,且有利于表达抗体的纯化.

作者：陈晓穗；王欲晓；朱迎春；张海荣；王琰刊期： 2001年第06期
人era基因酵母双杂交诱饵载体的构建及其激活作用的检测

era基因是细菌生存繁殖所必需的重要基因,与细胞周期和细胞分裂有关.era基因首先在大肠杆菌被发现,由于其编码的氨基酸序列与人及酵母的BAS蛋白有部分相似之处,故命名为E.coli RAS-like(era)基因[1].era基因不仅广泛存在于原核生物中,而且在真核生物(如蠕虫、小鼠和人)的组织中都发现有与细菌era高度同源的基因存在[2-4].人era基因的全长cDNA于1998年被克隆,与原核era基因具有很高的同源性.人ERA蛋白与大肠杆菌ERA蛋白的氨基酸序列有30%相同,两者的相似性为53%.人era基因的功能尚不清楚.我们拟采用酵母双杂交技术,克隆了人era结合蛋白基因,研究了人era与其结合蛋白的相互作用,以便对其功能的研究提供依据.

作者：程轶梦；吴元明；陈苏民；陈南春；纪宗玲刊期： 2001年第06期
正常足月胎盘和胎儿宫内生长迟缓胎盘中滋养细胞的凋亡及相关基因表达

目的比较正常足月胎盘与胎儿宫内生长迟缓胎盘(IUGR)中的滋养细胞凋亡指数,以及bcl-2和fas的表达,以探讨滋养细胞的凋亡与bcl-2和fas表达的关系.方法取正常足月胎盘组织和Ⅰ-UGR胎盘组织各5例,固定、石蜡包埋、切片,每组分别TUNEL法以及ABC法抗bcl-2和抗fas免疫组织化学染色.镜下计数滋养细胞的凋亡指数,并对bcl-2和fas的表达量进行显微图像分析.结果与正常足月胎盘相比,IUGR胎盘的凋亡指数显著增多(P＜0.01),bcl-2表达量显著减低(P＜0.01),而fas表达量无显著差异(p＞0.05).结论IUGR胎盘滋养细胞的凋亡指数明显增多可能与细胞bcl-2表达量减少有关,而不受fas表达量的影响.

作者：卢小东；朱华英；徐昌芬刊期： 2001年第06期
IL-10的表达和调控在角质形成细胞诱导免疫抑制中的作用

目的探讨白细胞介素10(IL-10)的表达和调控,在角质形成细胞诱导免疫抑制作用中的意义.方法从体外建立的混合表皮淋巴细胞培养体系(MELC)中,分离贴壁的角质形成细胞,并分析IL-10的表达来源.我们将抗IL-10单抗引入培养体系中,观察其对角质形成细胞所诱导的免疫抑制的影响.结果在混合培养体系中,IL-10主要来源于角质形成细胞.抗IL-10单抗可有效地阻断角质形成细胞所诱导的免疫抑制效应.结论IL-10的表达在角质形成细胞所诱导的免疫抑制效应中可能起重要作用.

作者：周洪；沈佰华；李宁丽；郑泽铣；周光炎刊期： 2001年第06期
抗人CD130胞内磷酸化酪氨酸单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得一组抗人CD130胞内磷酸化酪氨酸单克隆抗体(mAb),用于研究IL-6介导的信号转导.方法按照CD130分子胞内N752-G766区的氨基酸序列,化学合成Y759磷酸化的15肽作为抗原,应用细胞融合法制备一组抗CD130磷酸化酪氨酸的mAb,并用ELISA、Western blot、免疫沉淀和免疫组化染色等技术,对这组mAb的性质和功能进行探讨.结果(1)通过细胞融合获得了4株稳定分泌抗CD130胞内Y759磷酸化mAb的杂交瘤细胞株(MIY1、MIY2、MIY3和MIY4),这组mAb仅对合成肽N752-G766产生特异性反应.(2)Western blot分析表明,这组mAb识别的靶分子的相对分子质量(Mt)为13×104～14×104的.用此组mAb免疫沉淀的Mr为13×104～14×104蛋白,可被抗CD130 mAb所识别;同时用抗CD130mAb免疫沉淀的13×104～14×104分子也可被这组mAb所识别;(3)进一步研究证实,这组mAb可识别由IL-6诱导的细胞内酪氨酸磷酸化的蛋白分子.结论成功地研制了抗人CD130胞内磷酸化酪氨酸的mAb.

作者：于鸣；黎燕；贺永怀；孙瑛勋；沈倍奋刊期： 2001年第06期
子宫内膜异位症患者γδ+T细胞及NK细胞的功能分析

目的分析子宫内膜异位症患者中γδ+T细胞和天然杀伤细胞(NK)功能的变化,以及探讨患者腹腔液对正常人γδ+T细胞和自然杀伤细胞(NK)功能的影响.方法采用免疫荧光细胞检测及细胞毒活性检测法,分析22例子宫内膜异位症患者外周血、腹腔液中γδ+T细胞及NK细胞的表型与功能.结果子宫内膜异位症(疾病组)患者外周血、腹腔液中CD56+细胞与正常对照组相比较无明显差异,而疾病组腹腔液中γδ+T细胞的百分率高于其外周血和正常对照组.疾病组腹腔液中的γδ+T细胞及NK细胞的功能低于外周血及正常对照组.疾病组的腹腔液对正常人外周血γδ+T细胞及NK细胞的功能具有负调节作用.结论子宫内膜异位症患者的γδ+T细胞及NK细胞的功能低下,处于被抑制状态,提示患者的腹腔液中,可能存在γδ+T细胞及NK细胞的功能抑制因子.

作者：马安伦；葛海良；王树军；张冬青；余奇文；徐红；林其德刊期： 2001年第06期
抑癌基因PTEN诱导人脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡

目的研究外源性PTEN基因对人脑胶质瘤细胞系SHG-¨凋亡的影响,探讨PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制.方法以携有人PTEN基因的真核表达载体体外转染SHG-44细胞,筛选阳性转染的细胞克隆并扩增培养.以原位杂交和免疫组化染色法检测PTEN基因的表达.采用透射电镜、流式细胞仪和核DNA琼脂糖凝胶电泳,检测转染PTEN基因后SHG-44胶质瘤细胞的凋亡.观察导人人PTEN基因对SHG-44细胞裸鼠致瘤能力的影响.结果获得PTEN基因稳定转染的胶质瘤细胞SHG-44,并检测到PTEN基因和蛋白的表达.透射电镜下可见转染PTEN基因后细胞核染色质浓缩边集、胞浆浓缩、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡表现.流式细胞仪显示,细胞周期从G1期到S期发生抑制,并在G1期峰前出现1个明显的凋亡峰(12.9%).细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的梯状条带.转染空载体及未转染的SHG-44细胞未见明显的凋亡表现.转染PTEN基因后,SHG-44细胞对裸鼠致瘤能力明显降低.结论将外源性PTEN基因导入SHG-44肿瘤细胞后,可诱导细胞凋亡,这可能是PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的重要机制之一.

作者：刘先珍；章翔；费舟；郭衍；荆俊杰；李侠；王煊刊期： 2001年第06期
高浓度聚丙烯酰胺凝胶的简易干燥法

聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽时，凝胶浓度通常在16％以上。对这类高浓度凝胶我们曾采用文献[1，2]的方法制干胶，但效果不好，凝胶易干裂或皱缩。经反复实验，我们摸索出一种极为简便的方法，仅用一张玻璃纸即可将高浓度凝胶制成平整光亮，清晰透明的理想干胶，此方法也适用于其他浓度的凝胶。具体方法如下：

作者：张延凤；张晓楠刊期： 2001年第06期
利用噬菌体呈现技术筛选单抗MG7 ScFv片段

动物源性全抗体应用于人体往往会引起人抗动物抗体反应及过敏反应[1],将其小型化可显著降低这些不良免疫反应.目前,主要依赖基因工程技术来实现动物源性抗体的小型化,其中近10年来发展和逐渐成熟起来的噬菌体呈现技术是抗体小型化的佳方式[2,3].单抗(mAb)MG7是我所研制的一种特异性较高的鼠抗人胃癌的mAb,其针对的抗原在临床病例中的阳性率达90%,因此将其用于胃癌的靶向治疗具有一定的临床前景[4].为降低MG7全抗体用于体内研究时出现的强抗原性,我们以MG7杂交瘤为材料,利用噬菌体呈现技术,制备并筛选了mAb MG7ScFv,为进一步加强该mAb的应用研究奠定了基础.

作者：喻召才；丁杰；樊代明；张学庸刊期： 2001年第06期