李覃；胜利；范桂香；袁育康；李彤
目的: 原核表达野生型p53与Tat PTD (protein transduction domain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率. 方法: 利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化.以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清.将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率. 结果: 成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白,制备p53特异的抗血清,证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内.结论:Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础.
作者：丁劲；刘军；黄豫晓；李英辉；陈俊；赵亚；薛采芳 刊期： 2005年第05期
目的: 制备特异性的抗人类微小病毒B19单克隆抗体(mAb)杂交瘤.方法:采用PCR从B19病毒感染患者的血清标本中扩增编码VP2蛋白的基因,经克隆、测序确认后,再分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体.以从SDS-PAGE凝胶中回收的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,制备可分泌特异性B19mAb的杂交瘤细胞.以真核表达载体转染CHO细胞后,筛选单细胞表达克隆,将真核表达产物与用原核表达产物为免疫原制备的mAb反应.结果:从患者血清标本中扩增出了1 665 bp长的DNA,测序结果证实为vp2基因.将该基因克隆至原核表达载体中后,在大肠杆菌中获得了表达.表达产物经SDS-PAGE后,在Mr约为6 000处可见1条明显的表达带.Western blot的结果表明,该电泳带与B19患者的血清呈特异性免疫反应.以从SDS-PAGE凝胶中回收的表达产物为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、克隆化,获得2株分泌特异性的抗VP2 mAb的杂交瘤细胞.以这2株杂交瘤细胞制备的腹水可与SDS-PAGE凝胶Mr 6000的蛋白条带也出现很强的免疫反应.用ELISA证明以Vp2基因真核表达载体转染的CHO培养上清,也与筛选到的mAb呈阳性反应.结论:成功地制备抗VP2的mAb,为进一步研制可用于B19病毒感染早期免疫诊断试剂盒奠定了基础.
作者：黄庆生；薛小平 刊期： 2005年第05期
目的: 研究 125I标记的抗p185抗体(鼠mAb A21、人鼠嵌合抗体A21 scFv-Fc及单链抗体A21scFv)在体外的细胞代谢和在体内的生物学分布,为其在诊断和治疗高表达p185肿瘤的临床应用提供依据.方法:通过FACS检测抗体是否与高表达膜表面抗原p185的SKOV3特异结合.采用氯胺T法进行碘标记抗体,用细胞放射免疫分析实验,检测抗体在SKOV3细胞中的代谢.建立荷SKOV3裸鼠模型,以观察抗体的体内生物学分布.结果: 体外细胞代谢实验表明,抗体在与细胞膜表面结合后,进而被内吞入细胞,在细胞内降解和脱碘,后被分泌出细胞外.体内药物代谢实验表明,抗体在动物体内肿瘤部位出现选择性放射性浓聚,而无关抗体未出现放射性浓聚,呈全身分布.结论: mAb A21,A21 scFv-Fc和A21scFv对于高表达p185的卵巢癌在体内和体外都具有亲和力,可望用作高表达p185肿瘤的诊断和治疗.
作者：汪海洋；刘海波；董艳秋；杨建虹；程联胜；刘兢 刊期： 2005年第05期
目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响.方法:①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达.②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量.结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24 h、 48 h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、 5.64%)(P<0.05).②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8 h、 24 h、 48h释放PDGF的量(1 593、 2 625、 2 175 ng/L)明显高于正常孕妇组(235、 405、 133.5ng/L)差异显著(P<0.01).③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24 h、 48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3 266、 2 360 ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05).结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放.
作者：李常玲；许瑞环；张洪德；尹学念 刊期： 2005年第05期
目的: 探讨P38MAPK和MCP-1的关系及其在糖尿病动脉粥样硬化中的作用以及硒的作用机制.方法: 分别以高葡萄糖、糖基化终末产物(AGE)、胰岛素或过氧化氢体外孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并以Westernblot法或RT-PCR法检测P38MAPK和MCP-1在HUVEC的表达.检测并比较有无P38MAPK特异抑制剂SB203580或硒预处理,以上4种因素对P38MAPK和MCP-1在HUVEC表达的影响.结果: 高葡萄糖、 AGE、胰岛素或过氧化氢均可独立激活P38MAPK,并增加MCP-1在HUVEC的表达.SB203580显著抑制MCP-1的表达.硒抑制P38MAPK的活化并减少MCP-1的表达.结论:P38MAPK是MCP-1的上游信号分子,表明P38MAPK可能是糖尿病动脉粥样硬化发生的始动信号之一.硒可能通过抑制P38MAPK磷酸化而抑制MCP-1表达,有预防动脉粥样硬化作用.
作者：李艳波；李为民；韩君勇 刊期： 2005年第05期
目的: 探讨白藜芦醇(Res)抗肿瘤作用的免疫学机制.方法: 用MTT比色法测定肿瘤细胞生长抑制率,流式细胞术分析其细胞周期.分别采用MTT比色法、溶血分光光度法、改良的Mayer法及双抗体夹心ELISA法,检测荷瘤小鼠的免疫功能及细胞因子的水平.结果: Res可以时间-剂量依赖的方式抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡,出现明显的凋亡峰和G0/G1期阻滞现象; 抑瘤率高可达42.76%.Res可增强NK细胞的杀伤力、 T细胞增殖、抗体的分泌及CH50活性,并呈剂量依赖性.Res还可显著提高IL-2和TGF-β1的含量; 减少IL-8和VEGF的分泌.结论: Res既可直接作用于肿瘤细胞,也可通过提高机体细胞与体液免疫应答的水平,调节细胞因子的分泌,而发挥抗肿瘤作用.
作者：李覃；胜利；范桂香；袁育康；李彤 刊期： 2005年第05期
目的: 构建人Toll 样受体-9(hTLR-9)基因5′端序列的表达质粒,在大肠杆菌中表达,并以表达的hTLR-9-N免疫小鼠制备抗体.方法: 构建 hTLR-9 基因5′端(707～1 167 bp)的硫氧还蛋白(thioredoxin)融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N.将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.5 mmol/L IPTG诱导下表达.表达产物用SDS-PAGE 进行鉴定.以8 mol/L 尿素溶解的包涵体作为免疫原,免疫昆明种小鼠制备抗hTLR-9-N的抗体.结果:融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N在E.coli BL21 (DE3)中以相对分子质量(Mr)为31 000的包涵体形式表达;Western blot分析证明hTLR-9-N在大肠杆菌中得到正确表达.表达的目的蛋白初步纯化后的纯度达90%以上;以hTLR-9-N为抗原制备的抗血清效价为1∶25 600; 该抗血清可以与转染后稳定表达全长hTLR-9的HEK293细胞产生结合反应.结论:成功地在大肠杆菌中表达hTLR-9 N末端蛋白,制备的抗hTLR-9-N抗体可特异性结合表达全长hTLR-9的真核细胞.
作者：李军；赵文忠；江海燕；朱平；富宁 刊期： 2005年第05期
目的: 建立成人睾丸支持细胞的体外培养方法并探讨其免疫豁免机制.方法: 依次用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶及脱氧核糖核酸酶消化制备成人睾丸支持细胞,以SABC染色法检测支持细胞上Fas-L和TGF-β1的表达.将其与成人脾细胞共同培养,用MTT比色法检测其对脾细胞增殖的抑制作用.结果: 成人睾丸支持细胞占培养细胞总数的80%以上,活性可达90%.睾丸支持细胞上可表达Fas-L和TGF-β1,外可抑制共培养的脾细胞增殖.结论:建立了培养成人睾丸支持细胞的方法,其免疫豁免机制可能与Fas-L和TGF-β1的表达有关.
作者：滕琰；薛武军；冯新顺；田普训；李钊伦 刊期： 2005年第05期
目的:比较磺基罗丹明B(SRB)法与二苯基溴化四氮盐(MTT)比色法细胞计数的灵敏性和稳定性.方法: 取4种不同类型对数生长期的细胞,调整细胞的密度为1×106/L,并按比例稀释为0.039×105～10×105个细胞的梯度.(1)用SRB法与MTT比色法测定各细胞梯度相应A值,分别分析两种方法测到的A值与相应细胞梯度细胞数的相关性.(2)SRB法与MTT比色法各随机取100个A值,测量其在2、 16、 24 h及7d后的A值,比较这两种方法的稳定性.结果:SRB法和MTT比色法测定的A值与不同细胞系的细胞数目均有极好的相关性.SRB法测定的结果几乎不随时间而变化;而MTT法测定的结果受时间影响较大.结论: SRB法与MTT比色法相比较更适于进行大规模的细胞计数.
作者：周思朗；屈艳妮；张健；汪森明；张积仁 刊期： 2005年第05期
目的: 明确天然角蛋白反应性B细胞的亚群及解剖定位,初步分析其分泌天然抗角蛋白自身抗体(anti-keratinautoantibody,AK auto Ab)的能力.方法: 取SPF级C57BL/6小鼠的脾细胞和腹腔细胞,荧光抗体染色后用流式细胞仪分析角蛋白反应性B细胞亚群.将脾脏和腹腔淋巴细胞体外培养后,用ELISA分析AK auto Ab的滴度,用ELISPOT法分析分泌AK auto Ab的B细胞数.结果: 腹腔中几乎所有结合角蛋白的B细胞均为B-1a细胞,脾脏中结合角蛋白的B细胞以边缘带B细胞为主.腹腔细胞中分泌AK auto Ab的细胞数显著多于脾细胞,其培养上清中AK autoAb的滴度显著高于脾细胞.结论: 角蛋白反应性B细胞存在于3个成熟B细胞亚群: B-1细胞、滤泡B细胞和边缘带B细胞,其中CD5+的B-1a细胞具有活跃的分泌AK auto Ab的能力.
作者：邢影；李巍；付萌；韩骅；王刚；刘玉峰 刊期： 2005年第05期
目的: 研究LAIR-1(CD305)及LAIR-2(CD306)推定配体在多种细胞系上的分布,为鉴定LAIR-1/LAIR-2推定配体提供了实验依据.方法:建立稳定表达LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白的细胞系.以纯化的融合蛋白进行活细胞免疫荧光染色,用流式细胞仪检测LAIR-1及LAIR-2推定配体在多种细胞系膜表面的表达,并比较LAIR-1和LAIR-2推定配体的分布及可能结合的位点.结果:LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体均在人羊膜来源的上皮细胞系WISH上高表达,在人黑色素瘤细胞系C32、人胚肾上皮细胞系293T及人脐静脉内皮细胞系ECV304上有一定程度的表达.LAIR-1-Fc和LAIR-2-Fc融合蛋白与推定配体的结合,可分别被可同时识别LAIR-2和LAIR-1的单克隆抗体(mAb)FMU-LAIR-2.2和FMU-LAIR-2.1阻断.结论:LAIR-1推定配体及LAIR-2推定配体的分布基本一致,主要表达于WISH、 C32、293T和ECV304细胞系.LAIR-1和LAIR-2可能拥有共同的配体.
作者：许晓光；王春燕；谢鑫；薛江楠；欧阳为明；菅金龙；金伯泉 刊期： 2005年第05期
抗金葡菌多肽(PH-SA)是利用金黄色葡萄球菌信息素(pheromone)和大肠杆菌Ia(colicin)人工合成的新的蛋白质工程多肽(pheromonicin),主要是针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methecillinresistant Staphylococcus aureus,MRSA)及其他致病菌的新型生物信息导向抗菌药物.
作者：肖毅；梅其炳；侯颖；周四元；丘小庆 刊期： 2005年第05期
目的: 构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21 (DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶.方法:用PCR法扩增BirA酶基因.将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA.经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化.以带有生物素酶底物肽(BirA substratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Western blot鉴定表达产物的生物素化活性. 结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61 300 的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白. ELISA和Western blot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化. 结论: 成功地制备了具有生物学活性的BirA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂.
作者：李青；吴雄文；熊敏；翁秀芳；卢小玲；梁智辉；龚非力 刊期： 2005年第05期
目的: 探索细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在无血清体系中的增殖规律、表型变化及其抗瘤活性.方法: 不同培养基培养CIK细胞,采用活细胞计数法观察CIK细胞的增殖,流式细胞仪检测CIK细胞的表型,CytoTox96非放射性细胞毒试剂盒检测CIK细胞的细胞毒活性.结果:经过细胞因子和抗体刺激后,CIK细胞能明显增殖,无血清培养基加自体血浆组高可扩增473.28±27.53倍,无血清培养基组可扩增218.24±16.86倍,而RPMI1640加FCS只扩增11.52±1.04倍.CD3++CD8+、CD3++CD56+、CD226++CD11a+和CD305++CD11a+细胞随着培养时间的延长而增加,而CD3++CD4+细胞则明显减少.CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用明显高于LAK细胞(P<0.01),且其细胞毒活性随着培养时间的延长而增高.结论: CIK细胞在体外扩增能力强,对肿瘤细胞的杀伤活性高,有望成为新一代抗肿瘤过继免疫细胞制剂而应用于临床.
作者：曹建平；姜志明；张晓晨；蔺迪；陈伟；孙英慧；马东初 刊期： 2005年第05期
目的: 探讨MHC-Ⅱ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱtransactivator)CⅡTA基因对树突状细胞(Dendritic cell,DC)表面MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的上调作用,为肝癌生物治疗提供新的思路.方法: 从小鼠骨髓中大量扩增DC,并用脂质体转染法将小鼠CⅡTA(mCⅡTA)基因转入DC中,用流式细胞术观察转染前、后DC表面MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子及CD80、 CD86的表达.建立小鼠肝癌模型,将荷肝癌小鼠分为4组,第1组:分别于肝癌组织块周围注入PBS; 第2组: 未转入mCⅡTA基因的DC; 第3组: 转入mCⅡTA基因的DC; 第4组:转入mCⅡTA基因并经H22肿瘤抗原刺激的DC.每周1次,连续接种3 wk,连续7 wk动态测量肝癌的大小,观察转染mCⅡTA基因对荷肝癌小鼠抗瘤效应的影响.结果:转染mCⅡTA基因使DC上MHC-Ⅰ/Ⅱ分子的表达率由74.2%/66.7%明显上调为93.6%/91.4%;CD80/CD86的表达率由52.3%/60.5%明显上调为89.7%/91.5%(P<0.05).免疫接种后,第4组荷肝癌小鼠肝癌组织块的平均面积明显小于第1、 2、 3组(在第3、 4、 5、 6、 7周时,与第1、 2组相比较,P<0.05;在第5、 6、 7周时与第3组相比较,P＜0.05). 结论: 转入mCⅡTA后,DC表面MHC-Ⅰ/Ⅱ分子及CD80/CD86的表达率明显上调,DC的抗瘤效应增强.本研究为将DC应用于肿瘤的生物治疗提供了新的途径.
作者：欧启水；林琪；兰斌；郭仁 刊期： 2005年第05期
目的: 分析重组人源抗HBsAgFab的糖基化.方法: 应用PAS糖染色法和经酶切糖苷酶H去糖基后,用MALDI-TOF-MS质谱仪对重组人源抗HBsAgFab的糖基化进行分析.结果: PAS染色法的结果显示,毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组人源抗HBsAgFab呈淡红色.用质谱仪测定P. pastoris表达的经内切糖苷酶H去糖基后的重组人源抗HBsAg Fab的相对分子质量(Mr),从50678.49降低到49 245,相差1 433.49(约相当于少了8个甘露糖基).结论: P. pastoris表达的重组人源抗HBsAgFab,为一种具有生物活性的低糖基化的蛋白,为深入研究其性质及功能奠定了基础.
作者：邓宁；向军俭；唐勇；王宏；粟宽源 刊期： 2005年第05期
目的: 探索自身免疫性疾病患者血清中抗bFGF自身抗体的存在状况.方法: 通过对封闭条件、酶标板类型及抗原用量等条件进行优化,建立了检测自身免疫性疾病患者血清中抗bFGF抗体的ELISA检测方法.采用建立的佳检测条件对395例自身免疫性疾病患者的血清进行了bFGF自身抗体IgG和IgM的检测.结果:在系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、慢性肾炎、皮肌炎(DM)、不明原因发热(FOU)和特发性血小板减少紫癜(IPT)等患者血清中检测到了高滴度的抗bFGF的IgG、 IgM自身抗体,各组的平均值和阳性率均明显高于正常对照组(P<0.05).结论: 在自身免疫性疾病患者体内广泛存在着bFGF的自身抗体,对bFGF自身抗体的调查研究将为自身免疫性疾病的机制的探讨奠定基础.
作者：向军俭；漆秋兰；邓宁；王彤歌；王宏；唐勇；江振友 刊期： 2005年第05期
目的: 构建人E1A激活基因阻遏子(human cellular repressor of E1A-stimulated gene,hCREG)基因的原核表达载体,纯化重组的hCREG融合蛋白并制备兔抗hCREG抗体.探讨hCREG蛋白在人血管平滑肌细胞克隆株(HITASY)中的表达、定位.方法:用PCR技术,扩增hCREG并构建pGEX-4T-1/hCREG原核表达载体.诱导表达重组谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase,GST)-hCREG融合蛋白.以GST-hCREG为抗原,制备兔抗人GST-hCREG的抗血清,并通过蛋白A和GST亲和层析纯化.用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性;用免疫荧光染色法检查去血清培养前后HITASY细胞中hCREG蛋白的表达及定位;用BrdU染色观察分泌型hCREG蛋白对HITASY细胞增殖的影响.结果:经鉴定证实构建的重组质粒正确.诱导后pGEX-4T-1/hCREG菌株可表达大量的GST-hCREG融合蛋白,层析纯化后其纯度达90%.Western blot检测表明,纯化的兔抗hCREG抗体可与hCREG蛋白特异性结合.ELISA测得该抗体的效价＞1∶105.免疫荧光染色检测显示,去血清培养诱导的HITASY细胞中hCREG蛋白的表达增加且定位在核周围.BrdU染色表明,hCREG可明显抑制HITASY细胞增殖.结论:成功地获得兔抗hCREG抗体.证实去血清培养的血管平滑肌细胞中CREG蛋白的表达上调.表达的hCREG蛋白可抑制HITASY细胞增殖,提示hCREG可能参与调控血管平滑肌细胞的增殖与分化.
作者：韩雅玲；刘海伟；闫承慧；康建；王效增；胡叶 刊期： 2005年第05期
目的: 构建共表达质粒pSLC-IRES-IL-2,并在COS-7细胞中表达.方法: 根据人SLC和IL-2 cDNA的序列分别设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的SLC和IL-2基因的真核表达质粒pSLC-IRES-IL-2,用电穿孔法以共表达质粒转染COS-7细胞.用Western blot检测SLC和IL-2的表达.结果: Western blot检测表明,以重组共表达质粒pSLC-IRES-IL-2转染的COS-7细胞能表达SLC和IL-2,表达产物的Mr同预期的结果相一致.结论:成功地构建SLC和IL-2基因的共表达质粒,以其转染COS-7细胞后,能分泌性表达SLC和IL-2,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径.
作者：侯丽；赵跃然；王来城；焦玉莲；张捷；马春燕；崔彬 刊期： 2005年第05期
目的: 建立双抗体夹心ELISA法,定量检测重组可诱导共刺激分子(ICOS)-mIg融合蛋白的分泌型表达,并对其灵敏度、特异性及线性检测范围进行评价.方法: 用分子生物学技术制备重组ICOS-mIg融合蛋白.以羊抗小鼠IgG 为包被抗体,HRP标记的马抗小鼠IgG为检测抗体,通过配对试验、方阵滴定试验及绘制mIgG浓度与A450值的标准曲线,建立定量检测重组ICOS-mIg融合蛋白的双抗体夹心ELISA法.结果: 建立了双抗体夹心ELISA法,检测的线性范围为7.8～500 μg/L,标准曲线的回归方程为: y=-0.7864+1.1635 log(x),R2=0.9911,P<0.0001.应用该方法可快速检测哺乳动物细胞表达的重组ICOS-mIg融合蛋白的分泌量.结论:建立了一种可快速定量检测重组ICOS-mIg融合蛋白分泌表达的双抗体夹心ELISA法.该法灵敏、准确、快速、实用性好,对优化ICOS-mIg融合蛋白表达细胞的筛选和大规模制备具有重要价值.
作者：王健；沈茜 刊期： 2005年第05期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
