艾青；马康华
目的 探讨骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)9-2双表达定向诱导多潜能干细胞C3H10向成骨细胞分化的情况.方法 将C3H10细胞分为4组:BMP9-2、BMP2、BMP9和GFP组,将4种重组腺病毒分别感染C3H10细胞,通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色、定量测定及钙茜素红染色,观察BMP9-2双表达对C3H10细胞成骨分化的定向诱导作用.结果 BMP9-2双表达能诱导C3H10细胞ALP的表达,其染色活性高于BMP2组1.6倍,BMP9组2.5倍,GFP组4倍；其BMP9-2双表达定量表达A520值在病毒感染后5、7、9d均高于BMP2、BMP9和GFP组；BMP9-2双表达能诱导C3H10细胞钙盐的沉积,感染14 d后,钙茜素红染色可见钙化结节,其染色活性高于BMP2组1.4倍,BMP9组1.3倍,GFP组5.2倍.结论 BMP9-2双表达能定向诱导C3H10细胞成骨分化,其成骨活性强于单一成骨诱导因子BMP2和BMP9.
作者：陈聪；罗庆；田雯；迭小红；康权 刊期： 2013年第01期
目的 通过转录机器(RNA聚合酶)σE因子过量表达实现全局转录扰动,筛查迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda,Etarda)毒力相关基因.方法 从E.tarda EIB202中PCR扩增RNA聚合酶σE因子编码基因rpoE,连接到载体pACYC184上,构建rpoE基因过量表达菌株；在克隆rpoE基因时引入突变,使该基因表达失活,构建移码突变失活菌株.感染模式生物斑马鱼,检测各菌株半数致死剂量(LD50),RT-PCR法检测各菌株rpoE及其下游调控基因degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO mRNA的转录水平.结果 重组质粒pACYC 184-rpoE经双酶切及测序证实构建正确；在102、103、104和105 CFU/g注射浓度下,空载体转染菌株和rpoE基因过量表达菌株的毒力差异无统计学意义(P＞0.05)；与空载体转染菌株相比,rpoE基因过量表达菌株rpoE基因mRNA的转录水平上调9.5倍；与rpoE基因移码突变失活菌株相比,rpoE基因过量表达菌株rpoE基因下游调控基因degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO分别上调6.9、2.64、2.85、2.38、1.34倍.结论 成功构建了E.tarda rpoE基因过量表达菌株以及移码突变失活菌株,初步确定degP 、fkpA、plsB、lpxD、yfiO 5个基因与E.tarda毒力相关.
作者：王晓波；叶江；宋姗姗；王克平；张惠展 刊期： 2013年第01期
目的 探讨Apg-2基因沉默对pMIGR1空载体感染的BaF3-MIGR1细胞及稳定表达Bcr-Abl融合基因的BaF3-P210细胞增殖的影响,为进一步研究Apg-2在Bcr-Abl阳性的CML细胞中的作用奠定基础.方法 针对Apg-2基因609 ～ 629、845 ～ 865和2 110 ～2 130核苷酸合成3条shRNA序列Hspa41、Hspa42、Hspa43,同时合成阴性对照序列HspaHK,电穿孔转染BaF3-MIGR1和BaF3-P210细胞,经G418筛选稳定抑制细胞株,RT-PCR和Western blot 检测细胞中Apg-2基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平；Am-blue法检测细胞增殖；甲基纤维素法检测细胞克隆形成能力；流式细胞技术检测细胞周期的变化.结果 转染的3条shRNA质粒中,shRNA-Hspa42的干扰效果佳.Apg-2表达抑制后,BaF3-P210细胞的增殖与克隆形成能力均明显下降(P＜0.05),处于G1期细胞的百分率明显升高(P＜0.05),处于S期的细胞百分率明显下降(P＜0.05)；而BaF3-MIGR1细胞的增殖与克隆形成能力均明显增强(P＜0.05),处于S期的细胞百分率明显升高(P＜0.05).结论 干扰Apg-2基因的表达可抑制Bcr-Abl阳性细胞BaF3-P210的增殖,而对Bcr-Abl阴性细胞BaF3-MIGR1的增殖起促进作用.
作者：陈熙；钟梁；肖青；李春莉；李亚娟；王海霞；冯文莉 刊期： 2013年第01期
目的 对表达谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,EC4.1.1.15,简称GAD或GDC)的重组大肠杆菌的发酵条件进行优化.方法 通过单因素试验优化表达GAD的重组大肠杆菌B3C1的诱导剂IPTG添加时间、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度,再经响应面分析法优化工程菌的发酵条件(氯化钠、胰化蛋白胨、酵母粉、摇床转速、初始pH值、培养时间、接种量、装液量).结果 工程菌的佳诱导条件为:IPTG添加时间为工程菌接种后4h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为35℃；工程菌的佳发酵条件为:酵母粉1.01％,氯化钠0.6％,胰化蛋白胨1.5％,培养时间11.25h,摇床转速250 r/min,初始pH值6.5,接种量3.0％,装液量11.70 ml.工程菌在该条件下发酵培养,GAD酶活达1 227.33 U,比优化前提高了12.29％.结论 已成功对表达GAD的重组大肠杆菌的发酵条件进行了优化,为其工业化生产奠定了基础.
作者：薛正莲；张珂 刊期： 2013年第01期
目的 比较高效液相色谱法( HPLC)和紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量的效果.方法 分别采用HPLC法和紫外分光度法检测亚单位流感疫苗中间体和成品中壬苯醇醚-9的含量,并取中间体进行SDS-PAGE分析.结果 紫外分光光度法测定亚单位流感疫苗成品和中间体的壬苯醇醚-9含量比HPLC法高10％以上,测定中间体3壬苯醇醚-9含量的结果差异更显著；SDS-PAGE分析显示中间体1、2、3的核蛋白(NP)含量差异显著,大多数存在于中间体3中.结论 HPLC法可代替紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9的含量.
作者：田文莉；杨江山；万亚芬；祁骥；杨旭 刊期： 2013年第01期
目的 建立测定单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(Monosialotetrahexosylganglioside sodium salt,GM1)注射液含量的反相高效液相色谱法(Reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC),为GM1注射液的质量控制提供参考.方法 色谱条件:色谱柱:Hypersil ODS C18(4.6 mm× 250 mm,5μm)；流动相:乙腈-水(0.03％的三乙胺加磷酸至pH=7.5)(77:23)；检测波长:205 nm;流速:1.0 ml/min;进样体积:10 μl;理论塔板数按GM1峰计算不低于2 000.以峰面积对浓度进行线性回归,确定该法的线性范围,并对该法进行精密性、稳定性、重复性及加样回收率验证；应用建立的方法测定3批GM1注射液的含量.结果 GM1在50 ～ 800 μg/ml浓度范围内线性关系良好,r=0.999 2；该方法日内日间精密性及重复性均良好,对照品溶液在8h内基本稳定,样品的平均加样回收率为99.74％;用建立的方法检测3批样品中的GM1含量分别为96.80％、98.06％和97.32％.结论 建立了测定GM1注射液含量的RP-HPLC法,该方法准确、简便、快速、可靠,能有效控制GM1注射液的质量.
作者：何丹；杨林；张景勍 刊期： 2013年第01期
目的 原核表达中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sarbood virus,CSBV)结构蛋白,并制备其抗血清.方法 采用RT-PCR法扩增CSBV结构蛋白基因片段,克隆至pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,以可溶性形式表达；纯化后纯度可达95％以上；制备的抗血清可识别天然CSBV结构蛋白.结论 成功在大肠杆菌中表达了CSBV结构蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研究囊状幼虫病病毒与宿主的相互作用及开发血清学诊断方法奠定了基础.
作者：沈克飞；张邑帆；曹兰；王瑞生；杨金龙；杨柳；戴荣国 刊期： 2013年第01期
重组抗体在哺乳动物细胞中的高效表达有赖于高效表达载体的构建、抗体基因序列的优化、抗体稳定细胞株的筛选、表达宿主细胞的改造及细胞培养工艺的优化等.本文对上述问题的研究进展进行综述.
作者：胡迪超；张爱华；杨晓明 刊期： 2013年第01期
硫柳汞是一种在疫苗等生物制品中广泛使用的防腐剂,自上世纪末开始,关于含硫柳汞疫苗的安全性问题一直存在争议.本文对人用疫苗中应用硫柳汞的安全性相关研究、权威机构的立场、去汞行动的措施及存在的问题作一综述.
作者：何鹏 刊期： 2013年第01期
目的 构建人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1 (Breast cancer anti-estrogen resistance 1,BCAR1)基因siRNA慢病毒载体,并进行鉴定.方法 针对人BCAR1基因靶序列设计并合成4条siRNA序列(PLVT350、PLVT351、PLVT352、PLVT353)及1条阴性对照序列(PLVT4),分别退火后,插入经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的慢病毒载体pMagic 4.1中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,经PCR和DNA测序筛选阳性克隆,提取重组干扰质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞,进行慢病毒包装,浓缩后,采用梯度稀释法测定病毒滴度.将重组慢病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察感染效率,实时荧光定量PCR检测干扰效率,筛选干扰效果好的重组慢病毒感染肺癌A549细胞,Western blot检测BCAR1蛋白的表达水平.结果 成功构建了4种人BCAR1基因慢病毒干扰质粒,PLVT350、PLVT351、PLVT352和PLVT353的病毒滴度分别为3.45×108、2.13×108、3.01×108和2.47 × 108 TU/ml;慢病毒感染3d后,A549细胞的感染效率均达90％以上；除PLVT350外,其他3个均为有效靶点,PLVT351、PLVT352和PLVT353的沉默率分别为82％、73％和82％,BCAR1基因的表达量显著低于未转染和PLVT4组A549细胞(P＜0.001);PLVT351感染的A549细胞中BCAR1蛋白的表达水平明显低于未感染和PLVT4组A549细胞(P＜0.01).结论 成功构建了人BCAR1基因siRNA慢病毒载体,并建立了稳定表达的A549细胞株,为进一步探索BCAR1基因在肺癌中的相关功能及其分子机制奠定了基础.
作者：黄伟；范小青；王如文；邓波；蒋耀光；赵云平；郭伟 刊期： 2013年第01期
目的 分析Ezrin基因敲低及过表达对脑胶质瘤细胞U87迁移的影响,以探讨脑胶质瘤浸润性生长的机理.方法 从U87细胞中扩增Ezrin基因CDS区片段,克隆至表达载体pEGFP-C1中,构建Ezrin基因表达质粒pEGFP-C1/Ezrin.将pEGFP-C1/Ezrin、Ezrin基因shRNA质粒shRNA-Ezrin-2和pEGFP-C1以脂质体LipofectimineTM 2000介导分别转染U87细胞,Western blot分析转染细胞中Ezrin蛋白的表达；划痕试验检测转染细胞的迁移情况.结果 克隆的Ezrin基因与GenBank中登录的Homo sapiens ezrin (EZR),transcript variant 1,mRNA序列同源性达99％；该基因编码的氨基酸序列与ezrin[ Homo sapiens] (Sequence ID:reflNP_003370.21,Length:586)的一致性为99％,在第S66P、K258R、P265L和K577R位发生变异,读码框正确.pEGFP-C1/Ezrin转染的U87细胞中Ezrin蛋白的相对表达量(1.17)高于shRNA-Ezrin-2转染组(0.47)和pEGFP-C1转染组(0.82).划痕试验显示,shRNA-Ezrin-2转染组有少量细胞迁移至划痕处,pEGFP-C1/Ezrin转染组细胞几乎占满划痕处.结论 Ezrin基因敲低可阻止U87细胞迁移,其过表达可促进细胞迁移,表明U87细胞浸润性生长与Ezrin基因的表达有关.
作者：刘乃杰；秦治刚；孙利波；金星一；叶保国；张金男；朱庆三 刊期： 2013年第01期
目的 比较去冷沉淀血浆(Cryoprecipitate-reduced plasma,CRP)中系列凝血因子、纤维蛋白原(Fibrinogen,Fib)和血管性血友病因子裂解蛋白酶(A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin-1 repeats 13,ADAMTS-13)水平的变化.方法 用140人份新鲜冰冻血浆(Fresh frozen plasma,FFP)制备CRP,采用Biggers一期法测定FFP和CRP中FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FX、FⅪ、FⅫ的促凝活性；免疫比浊法测定Fib和血管性血友病因子抗原因子活动度(vWF:Ag)水平；荧光共振能量转移法(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)测定70人份FFP和CRP中的ADAMTS13活性及抗原含量.结果 与FFP比较,CRP中FⅧ:C、FⅤ:C、FⅦ:C、FⅨ:C、FX:C、FⅪ:C、Fib、vWF:Ag水平均明显下降,且差异均有统计学意义(P＜0.05或＜0.001)；FⅡ:C、FⅫ:C、ADAMTS13抗原含量和活性差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 CRP可代替FFP用于血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)的治疗,而不适用于FⅧ、Fib及vWF缺乏患者的补充治疗.
作者：马莉；孙盼；林方昭；刁戈；李剑平；张红抑；刘建强；张心声；柏则蓉；周静宇；黎美君；李长清 刊期： 2013年第01期
目的 分析麻腮风联合减毒活疫苗的渗透压摩尔浓度,为提高该疫苗的质量标准提供参考.方法 按照《中国药典》三部(2010版)附录渗透压摩尔浓度测定法,采用冰点下降法测定市售31批麻腮风联合减毒活疫苗的渗透压摩尔浓度.结果 31批麻腮风联合减毒活疫苗的渗透压摩尔浓度存在一定差异,在620 ～ 774 mOsmol/kg之间.结论 在麻腮风联合减毒活疫苗成品质量标准中增加渗透压摩尔浓度的检测十分必要.
作者：丁锐；纪宏；胡琴；陈思；刘奕明；周长明 刊期： 2013年第01期
目的 构建人肝细胞生长因子(Human hepatocyte growth factor,hHGF)真核表达质粒,并检测其在人骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中的表达及其对细胞生长的影响.方法 采用密度梯度法从人骨髓中分离BMSCs,流式细胞术检测细胞表型,成脂及成骨诱导其分化.PCR扩增hHGF基因,定向克隆至pEGFP-N1载体中,构建重组表达质粒pEGFP-N 1-hHGF,通过电穿孔法转染BMSCs,荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR及Western blot法检测hHGF基因mRNA的转录及蛋白的表达,MTT法检测hHGF对BMSCs增殖活力的影响.结果 BMSCs高表达CD29和CD44,不表达CD34和CD45；BMSCs在体外有向成脂及成骨细胞诱导分化的能力.酶切及基因测序证实,重组表达质粒pEGFP-N 1-hHGF构建正确；转染后48 h观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达；RT-PCR法和Western blot检测到hHGF基因在BMSCs中表达；转染hHGF基因的BMSCs增殖活力明显高于空白对照组和空载体转染组(P＜0.05).结论 成功构建了hHGF基因真核表达质粒,转染人BMSCs后获得表达,表达的hHGF可促进BMSCs增殖.
作者：崔洁；蒋明德；梅浙川；陈丽；曾维政；郑淑梅；王钊 刊期： 2013年第01期
目的 探讨疏水层析纯化重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)层析图谱与蛋白含量及HBsAg含量的相关性.方法 采用疏水层析纯化8批HP-HBsAg小量试验样品和5批小量验证试验样品及5批酿酒酵母表达的HBsAg对照试验样品,采用Lowry法和电化学发光法(Electrochemiluminescent immunoassay,ECLIA)分别检测纯化样品中蛋白含量和HBsAg含量,并计算HBsAg的回收率；通过几何法封闭紫外监测图谱特征峰图形,用数字求积仪采用积分法求出各封闭特征峰的图形面积,并进行分析；取小量验证试验1批样品的层析主峰和副峰收液进行电镜观察.结果 8批HP-HBsAg小量试验和5批HP-HBsAg小量验证试验HBsAg的平均回收率分别为70％和54％.HP-HBsAg疏水层析图谱由两部分构成:穿透峰和目标峰(HBsAg峰),目标峰可见高低不同的两个峰(主峰与副峰)；对照图谱中有穿透峰和目标峰.对目标峰进行量化分析,主峰、副峰与目标峰的面积比值分别与其所对应的收集量、蛋白含量和HBsAg含量比值相关.电镜观察可见小量验证试验样品主峰收液中HBsAg颗粒大小均一,副峰收液中HBsAg颗粒大小不均一.结论 疏水层析纯化重组HP表达的HBsAg效果良好,通过峰形之间面积比值,可获得峰形所对应的收集量、蛋白量和HBsAg量比值,为HBsAg的进一步纯化提供了参考.
作者：许宁；张德有；马锐；冯潇磊；张旭；杨旭琴；李彩梅；柳蔷；沈永才；李津 刊期： 2013年第01期
目的 建立前列腺特异抗原(Prostate specific antigen,PSA)光激发化学发光免疫(Light induced chemiluminescent immunoassay,LICA)定量检测方法.方法 用PSA多克隆抗体包被受体微粒,PSA单克隆抗体标记生物素,两者与链霉亲和素包被的供体微粒共同组成检测试剂检测PSA,优化测定条件并对方法进行验证.分别采用本方法与Roche公司电化学发光免疫分析法对82份临床标本进行检测,并进行比较分析.结果 本方法的分析灵敏度为0.31 ng/ml;批内变异系数为4.66％ ～6.75％,批间变异系数为5.68％ ～ 8.42％;回收率为95.1％～105.2％.两种方法具有较好的相关性,其R2为0.981 5.结论 建立的均相化学发光免疫测定方法能够用于血清PSA的定量测定,且其性能指标符合临床要求.
作者：刘志永；任杰；李婵；李晓蕾；陈新瑛；李会强 刊期： 2013年第01期
目的 建立三氯醋酸(Trichloroacetic acid,TCA)沉淀法测定食蟹猴体内125I-rhIL-12的含量,并进行验证及初步应用.方法 采用Na125I标记结合TCA沉淀蛋白的方法测定食蟹猴体内125I-rhIL-12的含量,对建立的方法进行线性、精密度及回收率验证；将2μg/kg 125I-rhIL-12单剂量皮下注射食蟹猴,分别于注射后4、8、24、32、48、72、96、120、144和168 h收集尿和粪,用建立的方法测定放射性,计算排出放射性占注入放射性的百分比.结果 125I-rhIL- 12的效价与未标记对照品效价无显著差异；在0.02 ～ 200 ng-当量范围内,不同组织/体液中125I-rhIL-12的加入量与总放射性及TCA沉淀放射性之间线性关系良好,变异系数(CV)多小于20％；125I-rhIL- 12原形主要在TCA沉淀部分.125I-rhIL-12经皮下注射食蟹猴后,放射性主要经尿排泄,少量经粪排泄,皮下注射后168 h,可排泄完全.结论 125I与rhIL-12在体内结合稳定,TCA沉淀法可用于测定食蟹猴体内125I-rhIL-12的含量.
作者：李淑穗；李若冰；李茹冰；李健；陈新；孙智平；张宜俊；傅泳航 刊期： 2013年第01期
目的 优化肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)在Vero细胞中的培养条件.方法 分别采用吸附法和直接接种法将EV71接种于Vero细胞中进行增殖,检测病毒滴度；选择佳接种方法接种病毒,考察血清浓度、收毒方式、病毒接种量(MOI)和收毒时间对病毒滴度的影响.结果 将MOI为0.02～0.2的病毒直接接种于不含血清的培养基中,培养60 h,胞外收毒,可获得较高的病毒滴度.结论 优化了EV71在Vero细胞中的培养条件,为EV71的大规模培养及其疫苗研发奠定了基础.
作者：陈丽；江元翔；夏德镇；杨志建；张高峡 刊期： 2013年第01期
新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-lactamase-1,NDM-1)是新近发现的由细菌产生的一种能够水解碳青霉烯类的金属β-内酰胺酶.NDM-1具有强大的水解作用,几乎能抵抗目前使用的所有抗生素,已严重威胁人类健康.本文对NDM-1携带菌的流行现状、NDM-1的基因排布特点、蛋白结构特点及酶活性中心的新研究进展作一综述.
作者：夏力亮；孙洋 刊期： 2013年第01期
目的 原核表达及纯化牛源产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC )F41菌毛蛋白,并制备F41菌毛蛋白的多克隆抗体.方法 以ETEC基因组为模板,采用PCR法扩增F41菌毛基因,克隆入表达载体pQE-30,转化大肠杆菌XLl-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析,表达产物经切胶纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot分析F41菌毛蛋白与多抗的反应原性.结果 重组表达质粒pQE-30-F41经双酶切及测序证实构建正确；F41菌毛重组蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为32 000;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35％,纯化的重组蛋白纯度可达92％；制备的抗血清效价达1:2.56×106以上,Western blot结果表明F41菌毛蛋白与制备的多抗具有良好的反应原性.结论 已成功原核表达并纯化了F41菌毛重组蛋白,且制备了高效价的多克隆抗体,为单克隆抗体制备及其免疫检测方法的建立奠定了基础.
作者：倪宏波；郎秀艳；邵光喜；周玉龙；焉秋龙；刘银冰；宫大庆；王春仁 刊期： 2013年第01期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
