徐超；任秀智；王延宙；韩金祥；王子强；鲁艳芹
目的 原核表达及纯化牛源产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC )F41菌毛蛋白,并制备F41菌毛蛋白的多克隆抗体.方法 以ETEC基因组为模板,采用PCR法扩增F41菌毛基因,克隆入表达载体pQE-30,转化大肠杆菌XLl-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析,表达产物经切胶纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot分析F41菌毛蛋白与多抗的反应原性.结果 重组表达质粒pQE-30-F41经双酶切及测序证实构建正确；F41菌毛重组蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为32 000;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35％,纯化的重组蛋白纯度可达92％；制备的抗血清效价达1:2.56×106以上,Western blot结果表明F41菌毛蛋白与制备的多抗具有良好的反应原性.结论 已成功原核表达并纯化了F41菌毛重组蛋白,且制备了高效价的多克隆抗体,为单克隆抗体制备及其免疫检测方法的建立奠定了基础.
作者：倪宏波；郎秀艳；邵光喜；周玉龙；焉秋龙；刘银冰；宫大庆；王春仁 刊期： 2013年第01期
目的 建立适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗(Acellular pertussis vaccine,APV)纯化新工艺,使疫苗主要成分的比例稳定可控.方法 复苏百日咳菌种并传代培养,在大罐发酵培养收获前,调整菌液的pH值至弱酸性,再通过离心获得上清液,经超滤浓缩和脱盐处理,使用阳离子交换层析进行目的组分的分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE分离并经Western blot鉴定,确定佳纯化条件.用建立的层析纯化新工艺连续纯化3批APV,检测各项指标,验证该工艺的重复性.结果 收获前菌液pH值调至5.8～6.0,可使疫苗主要保护抗原在上清液中的含量明显提高；采用强阳离子交换层析的方法,从目的蛋白的捕获到多组分的分离提纯可一步完成,各目的蛋白组分的纯度均可达85％以上,回收率可达90％以上；建立的纯化新工艺具有良好的重复性.结论 初步建立了可线性放大、适合APV大规模生产的层析纯化新工艺,为疫苗质量标准的提高奠定了基础.
作者：吴腾捷；张斌；张青；郑丽华；瞿爱东 刊期： 2013年第01期
目的 探讨联氨基姜黄素( Hydrazinocurcumin,HG)脂质体纳米颗粒(Liposome nanoparticles,NPs)对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响.方法 采用薄膜分散-超声法制备HC-NPs,透射电镜检测纳米颗粒的粒径大小.将4T1细胞分为PBS组、NPs组和HC-NPs组,分别加入10％(v/v)PBS、10％ (v/v)NP、10％(v/v)HC-NPs,培养24 h后,MTT法检测细胞的增殖活力；流式细胞术检测细胞周期和凋亡率的变化；刘氏染色法检测细胞的形态;Transwell试验检测4T1细胞侵袭和迁移能力；Western blot检测转导和转录激活因子STAT3及细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移相关蛋白的表达水平.结果 透射电镜下可见HC-NPs为150 nm左右的脂质体颗粒.HC-NPs对4T1细胞的增殖抑制率明显高于NPs组(P＜0.01)；与PBS组和NPs组相比,HC-NPs可使细胞形态不规则,诱导细胞周期发生G2/M期阻滞,细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),明显抑制细胞侵袭和迁移(P＜0.01)及STAT3的激活,下调CyclinD1、c-Myc、Bcl-2 、Survivin、MMP-9的表达,同时上调Bax的表达(P＜0.05).结论 HC-NPs可能通过抑制STAT3的激活,抑制4T1细胞增殖、侵袭和迁移能力,促进细胞凋亡.
作者：田文霞；张曦文；党微旗；唐浩；王林；曹红；陈婷梅 刊期： 2013年第01期
目的 原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group Atype 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性.方法 通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte( DE3),IPTG诱导表达.表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40 μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价.结果 重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15％；纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95％以上,可与猴CA16抗血清反应；不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系；各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1:8 .结论 已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础.
作者：杨永娟；郝春生；李懿；宋冬梅；刘宇；马淑花；田龙；李秀玲 刊期： 2013年第01期
目的 探讨疏水层析纯化重组汉逊酵母(Hansenula polymorpha,HP)表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)层析图谱与蛋白含量及HBsAg含量的相关性.方法 采用疏水层析纯化8批HP-HBsAg小量试验样品和5批小量验证试验样品及5批酿酒酵母表达的HBsAg对照试验样品,采用Lowry法和电化学发光法(Electrochemiluminescent immunoassay,ECLIA)分别检测纯化样品中蛋白含量和HBsAg含量,并计算HBsAg的回收率；通过几何法封闭紫外监测图谱特征峰图形,用数字求积仪采用积分法求出各封闭特征峰的图形面积,并进行分析；取小量验证试验1批样品的层析主峰和副峰收液进行电镜观察.结果 8批HP-HBsAg小量试验和5批HP-HBsAg小量验证试验HBsAg的平均回收率分别为70％和54％.HP-HBsAg疏水层析图谱由两部分构成:穿透峰和目标峰(HBsAg峰),目标峰可见高低不同的两个峰(主峰与副峰)；对照图谱中有穿透峰和目标峰.对目标峰进行量化分析,主峰、副峰与目标峰的面积比值分别与其所对应的收集量、蛋白含量和HBsAg含量比值相关.电镜观察可见小量验证试验样品主峰收液中HBsAg颗粒大小均一,副峰收液中HBsAg颗粒大小不均一.结论 疏水层析纯化重组HP表达的HBsAg效果良好,通过峰形之间面积比值,可获得峰形所对应的收集量、蛋白量和HBsAg量比值,为HBsAg的进一步纯化提供了参考.
作者：许宁；张德有；马锐；冯潇磊；张旭；杨旭琴；李彩梅；柳蔷；沈永才；李津 刊期： 2013年第01期
目的 分离白血病K562细胞株中CD34+细胞群,并分析其生物学特征,为从干细胞角度治疗白血病提供实验依据.方法 采用免疫磁性分选法分离K562细胞中CD34+细胞群,台盼蓝拒染法检测细胞活性；流式细胞术检测CD34+细胞比例及细胞周期；单细胞克隆培养检测CD34+细胞自我更新能力；RT-PCR法检测CD34+细胞分化相关指标促红细胞生成素( Erythropoietin,EPO)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)基因mRNA的转录水平；并检测CD34+细胞耐药蛋白P-gp (P-glycoprotein)的表达.结果 免疫磁性分选法可有效分离出CD34+细胞群,细胞活性为99％～ 100％；分离的CD34+细胞含量占细胞总数的78.5％～85.3％,细胞大部分处于静止状态,G0/G1期细胞比例达80％左右,显著高于分离前的K562细胞；CD34+细胞群具有形成混合集落的能力；与K562细胞相比,CD34+细胞EPO和GM-CSF基因mRNA的转录水平明显下降(P＜0.01),P-gp表达阳性.结论 成功从K562细胞株中分离了CD34+细胞群,其具有自我更新和多向分化的能力,表明其具有白血病干/祖细胞的生物学特点.
作者：刘俊；张先平；蔡世忠；徐春燕；王亚平；林雪梅 刊期： 2013年第01期
目的 对COL1A1和COL1A2基因突变检测为阴性的成骨不全症患者进行隐性致病基因LEPRE1的筛查.方法 采集成骨不全患者外周血样,提取基因组DNA,PCR扩增LEPRE1基因,直接测序法进行突变检测；采用PolyPhen、Align GVGD和SIFT突变功能预测软件分析突变对蛋白功能的影响.结果 检测到1例成骨不全症患者在LEPRE1基大第5号外显子发生碱基GGA＞ AGA,发现甘氨酸被精氨酸替换的1个杂合突变位点(c.1045G＞A,p.Gly349Arg)；其母亲和外祖父有相同杂合突变,家庭其他成员和200份健康对照样本未检测到该突变；PolyPhen、Align GVGD和SIFT软件预测结果表明,p.Gly349Arg突变很可能影响蛋白的正常功能.结论 LEPRE1基因c.1045G＞A突变很可能是成骨不全症潜在的致病突变位点.
作者：徐超；任秀智；王延宙；韩金祥；王子强；鲁艳芹 刊期： 2013年第01期
摘要:目的 构建UHRF2不同结构域缺失突变体,并在HEK293细胞中表达.方法 根据UHRF2不同结构域位置特征,构建5种不同结构域缺失突变体；以重组质粒pCMV-3xFlag-UHRF2为模板,PCR法直接扩增△UBL、△RING和△YDG+△RING编码基因,重叠PCR法扩增△PHD和△YDG编码基因,定向克隆至pCMV-3xFlag真核表达载体中,构建重组表达质粒,转染HEK293细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达.结果 UHRF2的结构域缺失体△UBL、△PHD的上游和下游及上下游合并、△YDG的上游和下游及上下游合并、△RING和△YDG+△RING的PCR产物分别可见2018、987、1152、2 272、1 232、629、1 827、2 163和1 287 bp的特异条带；UHRF2各结构域缺失体的重组表达质粒经双酶切和测序鉴定,证明构建正确；重组质粒转染HEK293细胞表达的重组蛋白大小均与理论值相符.结论 成功在HEK293细胞中表达了UHRF2不同结构域缺失突变体,为进一步研究UHRF2各结构域的功能及其与其他蛋白质的相互作用位点奠定了基础.
作者：白露；王筱绘；胡斌；周丹琳；段昌柱 刊期： 2013年第01期
目的 比较高效液相色谱法( HPLC)和紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9含量的效果.方法 分别采用HPLC法和紫外分光度法检测亚单位流感疫苗中间体和成品中壬苯醇醚-9的含量,并取中间体进行SDS-PAGE分析.结果 紫外分光光度法测定亚单位流感疫苗成品和中间体的壬苯醇醚-9含量比HPLC法高10％以上,测定中间体3壬苯醇醚-9含量的结果差异更显著；SDS-PAGE分析显示中间体1、2、3的核蛋白(NP)含量差异显著,大多数存在于中间体3中.结论 HPLC法可代替紫外分光光度法检测亚单位流感疫苗中裂解剂壬苯醇醚-9的含量.
作者：田文莉；杨江山；万亚芬；祁骥；杨旭 刊期： 2013年第01期
目的 观察FTY720对聚乙烯颗粒诱导的破骨细胞前体细胞RAW264.7分化的影响,探讨其防治人工关节无菌性松动的可能性.方法 构建破骨细胞-成骨细胞(RAW264.7-MC3T3)小室共培养体系及破骨细胞-骨片体系,用FTY720干预受聚乙烯磨损颗粒刺激的RAW264.7细胞的分化,倒置显微镜观察分化细胞的形态；抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatas,TRAP)染色法对破骨细胞进行计数；扫描电镜观察破骨细胞的一般形态及骨吸收效应；ELISA法检测共培养体系中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(Lnterleukin-6,IL-6)的分泌水平；RT-PCR检测破骨细胞表面核因子KB受体活化子(Receptor activator of NFKB,RANK)和TRAP基因mRNA的转录水平.结果 聚乙烯颗粒组RAW264.7细胞体积增大,胞质丰富,胞体边缘不齐呈云雾状,细胞核较多；FTY720组TRAP(+)细胞数明显低于聚乙烯颗粒组(P＜0.01)；破骨细胞呈圆形,细胞间可通过纤维样足突连接,骨片上有破骨细胞附着生长,FTY720组骨吸收陷窝和骨吸收面积均明显低于聚乙烯颗粒组(P＜0.01)；聚乙烯颗粒组TNF-α和IL-6的分泌水平均明显增加(P＜0.01),FTY720组TNF-α和IL-6的分泌受到抑制；FTY720组破骨细胞表面TRAP和RANK基因mRNA的转录水平均明显低于颗粒组(P＜0.01).结论 FTY720能有效抑制破骨细胞前体细胞RAW264.7分化成熟,减少破骨细胞的形成及对骨片的溶解吸收,减少TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌,下调RANK、TRAP等破骨细胞特异细胞表型和功能基因mRNA的转录水平,有望成为防治人工关节无菌性松动的药物.
作者：周园东；王信；李平；万睿；陈婷梅；张健 刊期： 2013年第01期
目的 建立三氯醋酸(Trichloroacetic acid,TCA)沉淀法测定食蟹猴体内125I-rhIL-12的含量,并进行验证及初步应用.方法 采用Na125I标记结合TCA沉淀蛋白的方法测定食蟹猴体内125I-rhIL-12的含量,对建立的方法进行线性、精密度及回收率验证；将2μg/kg 125I-rhIL-12单剂量皮下注射食蟹猴,分别于注射后4、8、24、32、48、72、96、120、144和168 h收集尿和粪,用建立的方法测定放射性,计算排出放射性占注入放射性的百分比.结果 125I-rhIL- 12的效价与未标记对照品效价无显著差异；在0.02 ～ 200 ng-当量范围内,不同组织/体液中125I-rhIL-12的加入量与总放射性及TCA沉淀放射性之间线性关系良好,变异系数(CV)多小于20％；125I-rhIL- 12原形主要在TCA沉淀部分.125I-rhIL-12经皮下注射食蟹猴后,放射性主要经尿排泄,少量经粪排泄,皮下注射后168 h,可排泄完全.结论 125I与rhIL-12在体内结合稳定,TCA沉淀法可用于测定食蟹猴体内125I-rhIL-12的含量.
作者：李淑穗；李若冰；李茹冰；李健；陈新；孙智平；张宜俊；傅泳航 刊期： 2013年第01期
重组抗体在哺乳动物细胞中的高效表达有赖于高效表达载体的构建、抗体基因序列的优化、抗体稳定细胞株的筛选、表达宿主细胞的改造及细胞培养工艺的优化等.本文对上述问题的研究进展进行综述.
作者：胡迪超；张爱华；杨晓明 刊期： 2013年第01期
目的 研制静注肠道病毒71型人免疫球蛋白(pH4)[Enterovirus 71 human immunoglobulin( pH 4)for intravenous injection,EV71-IVIG],用于治疗重症手足口病.方法 采用细胞病变抑制法检测原料血浆的抗EV71中和抗体效价(EV71 neutralizing antibody titer,EV71-NT),确定EV71抗体血浆的筛选标准；从健康人血浆中筛选中和效价较高的EV71血浆,按《中国药典》三部(2010版)的生产工艺连续制备3批EV71-IVIG;以乳鼠模型评价EV71-IVIG的治疗效果,并以细胞病变抑制法检测EV71-IVIG对EV71临床分离株及CA16病毒的中和活性.结果 从90批原料血浆中筛选出约3.8吨EV71抗体血浆,制备的3批EV71-IVIG符合《中国药典》三部(2010版)“静注人免疫球蛋白(pH 4)”的质量标准,EV71-NT为国内普通IVIG的4～5倍.0.5 mg EV71-IVIG即可充分保护经10 LD50EV71攻击的乳鼠,存活率达100％.EV71-IVIG对近几年流行的EV71临床分离株有较高的中和活性.结论 已成功研制EV71-IVIG,为重症手足口病患者的治疗提供了新的用药选择.
作者：刘兰军；杨春；武志强；秦婷婷；李小姣；刘瑞熙；刘波；张雪梅；杨汇川 刊期： 2013年第01期
目的 建立测定单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(Monosialotetrahexosylganglioside sodium salt,GM1)注射液含量的反相高效液相色谱法(Reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC),为GM1注射液的质量控制提供参考.方法 色谱条件:色谱柱:Hypersil ODS C18(4.6 mm× 250 mm,5μm)；流动相:乙腈-水(0.03％的三乙胺加磷酸至pH=7.5)(77:23)；检测波长:205 nm;流速:1.0 ml/min;进样体积:10 μl;理论塔板数按GM1峰计算不低于2 000.以峰面积对浓度进行线性回归,确定该法的线性范围,并对该法进行精密性、稳定性、重复性及加样回收率验证；应用建立的方法测定3批GM1注射液的含量.结果 GM1在50 ～ 800 μg/ml浓度范围内线性关系良好,r=0.999 2；该方法日内日间精密性及重复性均良好,对照品溶液在8h内基本稳定,样品的平均加样回收率为99.74％;用建立的方法检测3批样品中的GM1含量分别为96.80％、98.06％和97.32％.结论 建立了测定GM1注射液含量的RP-HPLC法,该方法准确、简便、快速、可靠,能有效控制GM1注射液的质量.
作者：何丹；杨林；张景勍 刊期： 2013年第01期
目的 分析北京市朝阳区部分社区老年人肺炎疫苗接种率及其影响因素,以提高老年人肺炎疫苗的接种率,降低社区老年人肺炎球菌感染的危害.方法 通过整群抽样的方法,选取北京市朝阳区年龄≥60岁的部分社区老年人进行问卷调查,收集调查对象的基本信息、健康状况、就医行为及疫苗接种情况,分析社区老年人肺炎疫苗接种率的影响因素.结果 调查数据显示社区老年人的肺炎疫苗接种率为2.1％,经多因素Logistic回归分析,年龄、受教育程度及健康状况是肺炎疫苗接种率的主要影响因素(P＜0.05).结论 应通过多种措施提高老年人等优先人群肺炎疫苗的接种率；干预过程中应重视受教育程度较低、身体素质较好以及年龄相对较轻的老年人
作者：张国辉；郑东旖；时念民；艾星；白云骅 刊期： 2013年第01期
目的 探讨血管紧张素-( 1-7)[ Angiotensin-( 1-7),Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)在大鼠心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)中信号转导的影响及其机制.方法 原代分离培养并鉴定新生SD大鼠的CFs,将细胞分为8组:空白对照组、AngⅡ组、Ang-( 1-7)组、AngⅡ+Ang-( 1-7)组、AngⅡ+Ang-(1-7)+A-779组、AngⅡ+Ang-(1-7)+ PAO组、Ang-(1-7)+ PAO组和AngⅡ+PAO组,Western blot法检测细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)和磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)的表达；免疫沉淀捕捉分析法检测蛋白酪氨酸磷酸酶-1(Src-homology domain 2 containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1)的酶活性；实时荧光定量PCR检测转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-31)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ,ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白( CollagenⅢ,ColⅢ)基因mRNA的转录水平.结果 AngⅡ可增加细胞内p-ERK1/2的表达水平和p-ERK/ERK值(磷酸化的p-ERK1/2与总的ERK1/2的比值),Ang-(1-7)通过与Mas受体结合可拮抗AngⅡ引起的上述效应；Ang-( 1-7)通过与Mas受体结合而激活胞内SHP-1的活性,并可拮抗AngⅡ所致的SHP-1活性降低；抑制SHP-1的活性后,Ang-( 1-7)拈抗AngⅡ诱导的p-ERK1/2表达水平和p-ERK/ERK值增高的效应被抑制.Ang-( 1-7)对TGF-β1、Col Ⅰ和ColⅢ基因mRNA的转录水平无显著影响,但可抑制AngⅡ所诱导的上述基因mRNA转录水平的增加.结论 Ang-( 1-7)通过与Mas受体结合而激活SHP-1,该效应与Ang-(1-7)拮抗AngⅡ诱导的p-ERK1/2的表达水平和p-ERK/ERK值增高密切相关；Ang-( 1-7)可抑制AngⅡ所诱导的TGF-β1、Col Ⅰ和ColⅢ基因表达上调,这些现象可能体现了一种Ang-(1-7)拮抗AngⅡ所致的不良效应的保护性机制.
作者：考国营；范晋奇；张晓歌；崔坤；谭利；苏立；殷跃辉 刊期： 2013年第01期
目的 探讨骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)9-2双表达定向诱导多潜能干细胞C3H10向成骨细胞分化的情况.方法 将C3H10细胞分为4组:BMP9-2、BMP2、BMP9和GFP组,将4种重组腺病毒分别感染C3H10细胞,通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色、定量测定及钙茜素红染色,观察BMP9-2双表达对C3H10细胞成骨分化的定向诱导作用.结果 BMP9-2双表达能诱导C3H10细胞ALP的表达,其染色活性高于BMP2组1.6倍,BMP9组2.5倍,GFP组4倍；其BMP9-2双表达定量表达A520值在病毒感染后5、7、9d均高于BMP2、BMP9和GFP组；BMP9-2双表达能诱导C3H10细胞钙盐的沉积,感染14 d后,钙茜素红染色可见钙化结节,其染色活性高于BMP2组1.4倍,BMP9组1.3倍,GFP组5.2倍.结论 BMP9-2双表达能定向诱导C3H10细胞成骨分化,其成骨活性强于单一成骨诱导因子BMP2和BMP9.
作者：陈聪；罗庆；田雯；迭小红；康权 刊期： 2013年第01期
目的 原核表达中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sarbood virus,CSBV)结构蛋白,并制备其抗血清.方法 采用RT-PCR法扩增CSBV结构蛋白基因片段,克隆至pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot鉴定.结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,以可溶性形式表达；纯化后纯度可达95％以上；制备的抗血清可识别天然CSBV结构蛋白.结论 成功在大肠杆菌中表达了CSBV结构蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研究囊状幼虫病病毒与宿主的相互作用及开发血清学诊断方法奠定了基础.
作者：沈克飞；张邑帆；曹兰；王瑞生；杨金龙；杨柳；戴荣国 刊期： 2013年第01期
目的 分析Ezrin基因敲低及过表达对脑胶质瘤细胞U87迁移的影响,以探讨脑胶质瘤浸润性生长的机理.方法 从U87细胞中扩增Ezrin基因CDS区片段,克隆至表达载体pEGFP-C1中,构建Ezrin基因表达质粒pEGFP-C1/Ezrin.将pEGFP-C1/Ezrin、Ezrin基因shRNA质粒shRNA-Ezrin-2和pEGFP-C1以脂质体LipofectimineTM 2000介导分别转染U87细胞,Western blot分析转染细胞中Ezrin蛋白的表达；划痕试验检测转染细胞的迁移情况.结果 克隆的Ezrin基因与GenBank中登录的Homo sapiens ezrin (EZR),transcript variant 1,mRNA序列同源性达99％；该基因编码的氨基酸序列与ezrin[ Homo sapiens] (Sequence ID:reflNP_003370.21,Length:586)的一致性为99％,在第S66P、K258R、P265L和K577R位发生变异,读码框正确.pEGFP-C1/Ezrin转染的U87细胞中Ezrin蛋白的相对表达量(1.17)高于shRNA-Ezrin-2转染组(0.47)和pEGFP-C1转染组(0.82).划痕试验显示,shRNA-Ezrin-2转染组有少量细胞迁移至划痕处,pEGFP-C1/Ezrin转染组细胞几乎占满划痕处.结论 Ezrin基因敲低可阻止U87细胞迁移,其过表达可促进细胞迁移,表明U87细胞浸润性生长与Ezrin基因的表达有关.
作者：刘乃杰；秦治刚；孙利波；金星一；叶保国；张金男；朱庆三 刊期： 2013年第01期
目的 通过转录机器(RNA聚合酶)σE因子过量表达实现全局转录扰动,筛查迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda,Etarda)毒力相关基因.方法 从E.tarda EIB202中PCR扩增RNA聚合酶σE因子编码基因rpoE,连接到载体pACYC184上,构建rpoE基因过量表达菌株；在克隆rpoE基因时引入突变,使该基因表达失活,构建移码突变失活菌株.感染模式生物斑马鱼,检测各菌株半数致死剂量(LD50),RT-PCR法检测各菌株rpoE及其下游调控基因degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO mRNA的转录水平.结果 重组质粒pACYC 184-rpoE经双酶切及测序证实构建正确；在102、103、104和105 CFU/g注射浓度下,空载体转染菌株和rpoE基因过量表达菌株的毒力差异无统计学意义(P＞0.05)；与空载体转染菌株相比,rpoE基因过量表达菌株rpoE基因mRNA的转录水平上调9.5倍；与rpoE基因移码突变失活菌株相比,rpoE基因过量表达菌株rpoE基因下游调控基因degP、fkpA、plsB、lpxD、yfiO分别上调6.9、2.64、2.85、2.38、1.34倍.结论 成功构建了E.tarda rpoE基因过量表达菌株以及移码突变失活菌株,初步确定degP 、fkpA、plsB、lpxD、yfiO 5个基因与E.tarda毒力相关.
作者：王晓波；叶江；宋姗姗；王克平；张惠展 刊期： 2013年第01期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
