常娅莉；席仲兴；吴智远；徐秉臣；彭林锋；胡丽娜；热娜；雷刚；韩少波
目的 原核表达及纯化变形链球菌组氨酸蛋白激酶VicK,并进行蛋白活性的检测.方法 以变形链球菌UA159菌株基因组DNA为模板,PCR扩增VicK基因,插入表达载体pET-28a中,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中,IPTG(终浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2及0.3 mmol/L)于18及37℃诱导10、15、20 h,表达产物经Ni离子亲和层析柱纯化,采用Kinase-Glo(R)激酶发光检测试剂盒检测纯化后目的蛋白的活性.结果 重组表达质粒pET-28a-VicK经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组VicK蛋白相对分子质量约51 000;IPTG终浓度0.3 mmol/L,18℃诱导15 h,可溶性目的蛋白的表达量高;纯化的目的蛋白纯度＞90％,浓度为2 mg/ml;随着VicK蛋白浓度的增加,发光值逐渐降低,表明该蛋白具有体外水解ATP的激酶活性.结论 已成功原核表达并纯化了变形链球菌具有激酶活性的VicK蛋白,为后续以此为靶点的抑制物的筛选奠定了实验基础.
作者：钱英子；黄锐；李月恒；周红；郑玉琪；张雪梅；尹一兵；周智 刊期： 2013年第11期
随着生物技术的发展,研究人员对百日咳鲍特菌致病机理进行了大量研究并取得一定的突破,尤其是黏附分子在细菌致病过程中所起的作用.本文就近年来在百日咳鲍特菌黏附分子的研究进展作一简要综述.
作者：柯兵兵 刊期： 2013年第11期
目的 探讨人参皂苷对骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMSC)通过旁分泌途径治疗心肌缺血的促进作用.方法 从SD大鼠胫骨和股骨中分离培养BMSC,取第3代BMSC,流式细胞术检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD34和CD29的表达.建立大鼠心肌缺血模型,将模型鼠随机分为模型组(每天常规喂食水)和人参皂苷组[每天常规喂食水及人参皂苷液(100 mg/100 ml),每日3次,100 ml/次],给药的同时,均经大鼠尾静脉缓慢注射BMSC悬液(1×105个/ml),1ml/只,另设空白对照组(未建模的SD大鼠).分别采集模型组建模后24、48、72 h及人参皂苷组建模后72 h的大鼠心脏血,分离血清,ELISA法检测血清中干细胞因子(stem cell factor,SCF)、干细胞衍生因子(stromal cell derived factor-1,SDF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)的分泌水平.体外迁移试验检测不同浓度SDF-1(1、10、100 ng/ml)对BMSC迁移的影响;取各组大鼠建模后24、48、72 h的心肌组织提取液,检测其对BMSC及经SDF-1抑制剂AMD3100作用的BMSC迁移的影响.结果 大鼠BMSC表面表达CD44、CD29,不表达CD34、CD45.模型组大鼠血清中细胞因子SCF、SDF-1、VEGF、CXCR4的分泌水平随建模时间延长显著上升,人参皂苷组大鼠建模后72 h血清中各细胞因子的表达水平均明显高于模型组(P＜0.05).SDF-1可显著增加BMSC的迁移数,且呈浓度依赖性(P＜0.05);模型组和人参皂苷组大鼠心肌组织提取液作用BMSC的迁移数随建模时间的延长显著上升(P＜0.05),两组相同时间点间差异有统计学意义(P＜0.05);人参皂苷组72h的大鼠心肌组织提取液作用的AMD3100处理的BMSC的迁移数明显低于模型组72 h(P＜0.05).结论 人参皂苷能促进BMSC旁分泌作用,提高BMSC对心肌缺血性疾病的疗效,可作为治疗该疾病的辅助药物.
作者：艾丽梅；杨关林；刘彤；白雪松 刊期： 2013年第11期
目的 评价武汉生物制品研究所有限责任公司(简称武汉公司)生产的吸附无细胞百白破联合疫苗(DTaP)的安全性.方法 选择成都市疾病预防控制中心(CDC)、西安市CDC对1 331名3～6月龄未接种过百白破联合疫苗,无百日咳、白喉、破伤风疾病史的足月健康婴儿,采用多中心、随机、双盲、平行对照的原则,按2:1的比例随机接种观察疫苗(武汉公司生产的DTaP)或对照疫苗(对照组1:成都生物制品研究所有限责任公司生产的DTaP;对照组2:天坛生物制品有限责任公司生产的DTaP),按计划免疫规程注射3剂DTaP,进行基础免疫,每剂间隔1个月,成都市CDC在基础免疫首剂接种后16个月进行加强免疫,在征集期内进行安全性主动观察;在湖北省、湖南省等全国17省25个市县展武汉公司生产的DTaP大规模接种后异常反应观察.结果 基础免疫后,观察组与对照组预期全身反应、Ⅱ级及Ⅱ级以上发热反应以及Ⅱ级以上局部反应发生率差异均无统计学意义(P＞ 0.05);加强免疫后,观察组与对照组预期全身反应和局部反应发生率差异均无统计学意义(P＞0.05);基础免疫和加强免疫后均未观察到非预期不良反应/事件.58 120名婴幼儿接种武汉公司生产的DTaP后,异常反应发生率为292.5/10万.结论 武汉生物制品研究所有限责任公司生产的DTaP具有良好的安全性.
作者：邹光荣；兰红；李恒星；张量智；杨晓明；吕世成；侯铁军；兰咏梅；项美娟 刊期： 2013年第11期
目的 在毕赤酵母中表达重组人ADAM15去整合素区域蛋白(recombinant human disintegrin of ADAM15,rhddADAM 15)与人血清白蛋白融合蛋白(HSA-rhddADAM 15-His),并测定其活性.方法 以rhddADAM15基因为模板,PCR扩增rhddADAM 15-His基因,克隆入pBluescript-HSA质粒中,经酶切后与pPIC9k载体连接,构建重组表达质粒pPIC9k-HSA-rhddADAM 15-His,将重组表达质粒转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达.表达产物经Blue-Sepharose、Ni2+螯合层析及DEAE阴离子交换层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,利用划痕及SRB法检测其活性.结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;融合蛋白HSA-rhddADAM15-His相对分子质量约76 000,以可溶性分子形式存在于发酵液上清中;纯化的融合蛋白纯度约为75％,可与兔抗rhddADAM15多克隆抗体特异性结合;融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞B16的迁移具有明显的抑制作用,但对其增殖无明显抑制作用.结论 成功在毕赤酵母GS115中表达并纯化了HSA-rhddADAM 15-His蛋白,为其作用机理的研究奠定了基础.
作者：侯颖；储敏；杜芳芳；戴惠云；陈蕴；金坚 刊期： 2013年第11期
目的 采用荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺中间产品、原液及半成品中残留DNA含量.方法 采用《中国药典》三部(2010版)附录ⅨB荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺主要中间产品[丁基琼脂糖层析收集液(以下简称BA富集液)]、原液及半成品中残留DNA含量,对该方法的准确度、精密性进行验证,并用建立的方法检测10批BA富集液、原液及半成品中残留DNA含量.结果 该方法线性范围1.25～80 ng/ml,r2≥0.999,低检测限为1.25 ng/ml;DNA标准品在BA富集液、疫苗原液及半成品中的平均回收率分别为105.8％、101.4％和108.5％,准确度较好;不同时间点重复测定同一批样品的变异系数(CV)在1.6％～6.56％之间,不同试验间重复测定同一批样品的CV在1.4％～3.6％之间,试验内和试验间精密性较好;10批BA富集液中DNA浓度均较高,经过纯化后,原液中DNA含量明显降低,半成品中除个别批号外,均基本达到低于10 ng/剂的要求.结论 荧光染色法可用于重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺中间产品、原液及半成品中残留DNA含量的常规监测,具有简便、快速、自动化程度高等特点,测定前样品无需进行处理.
作者：张昀；陈国明；李娜；何伟平；李嫌；杨旭琴；李津 刊期： 2013年第11期
目的 研究姜黄素对侵袭相关因子中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin,NGAL)表达的调控,初步探讨姜黄素在防治乳腺癌侵袭转移中可能存在的新的作用机制.方法 以高侵袭性乳腺癌细胞株MDA-MB-231为研究对象,采用不同剂量姜黄素处理,并使用核转录因子-κB(nuclear transcriptionfactor-κB,NF-κB)特异性抑制剂Bay-117082(20 μmol/L)对比观察.MTT法检测5、10、15、20、25、30、35、40、50 μmol/L姜黄素作用24、48、72 h对细胞的毒性作用;Transwell小室侵袭试验法检测5、10、15 μmol/L姜黄素对细胞的侵袭能力,黏附试验法检测对细胞的黏附能力;Western blot法检测5、10、15 μmol/L姜黄素、20μmol/L Bay-117082及15 μmol/L姜黄素+20 μmol/L Bay-117082对细胞中核转录因子κB抑制剂α(inhibitor α of κB,IκBα)磷酸化的IκBα(phosphorylated-IκBα,p-IκBα)及NGAL蛋白表达水平的影响,RT-PCR法检测对细胞中NGAL基因mRNA转录水平的影响.结果 姜黄素浓度＞ 15 μmol/L,作用时间＞24h时,对细胞的生长抑制呈时间和剂量依赖性(P＜0.001),当姜黄素浓度≤15 μmol/L,作用时间为24 h时,对细胞无明显毒性作用,细胞存活率＞90％;随着姜黄素浓度的增加,细胞侵袭能力和黏附能力逐渐降低,以15 μmol/L姜黄素作用效果明显(P＜0.05);姜黄素对p-IκBα、NGAL蛋白表达的抑制作用与NF-κB特异性抑制剂Bay-117082相似,且呈剂量依赖性(P＜0.05),而对IκBα蛋白的表达无明显影响;姜黄素可明显抑制NGAL基因mRNA转录水平,其抑制作用呈剂量依赖性(P＜0.05),且Bay-117082抑制NGAL基因mRNA转录水平的作用与15 μmol/L姜黄素相似.结论 姜黄素可通过抑制NF-κB信号通路的活化及此信号通路靶基因NGAL的表达降低乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭性.
作者：李静；曹友德；江进 刊期： 2013年第11期
目的 用血小板裂解液(platelet lysate,PL)大规模扩增人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC),并检测其生物学特性,为临床应用提供实验依据.方法 分别采用PL和胎牛血清(FBS)低密度扩增人UCMSC,比较两组UCMSC的细胞形态、大小、克隆形成率、增殖能力、细胞表型和分化能力.结果 PL扩增的UCMSC形态细长;直径明显小于FBS扩增的UCMSC(P＜0.05);克隆形成率与FBS扩增的UCMSC差异无统计学意义(P＞0.05);有更高的细胞累积群倍数;与FBS扩增的UCMSC有相似的细胞表型;与FBS扩增的UCMSC均具有成骨、成脂诱导分化能力,但PL扩增的UCMSC成骨分化能力更强.结论 PL可取代FBS用于大规模扩增UCMSC.
作者：浦仕彪；马致洁；王伽伯；肖小河 刊期： 2013年第11期
目的 探讨小窝蛋白-3 (caveolin-3,Cav-3)在蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)Eplison亚型(PKCε)介导缺血预适应心脏保护中的作用机制.方法 将大鼠心肌细胞置于密闭容器中进行诱导缺氧,建立缺血预适应模型,通过Western blot、荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测PKC 5种亚型在缺血预适应后的变化,判断Cav-3与PKCε表达、转位及活化的相关性.结果 缺血预适应后,PKCε、PKCδ、PKCα选择性转位到富含Cav的浆膜上,但不包括PKCβ1和PKCξ.缺血预适应增加了FRET信号,促进PKCε转位到富含Cav浆膜上及增加Cav-3与PKCε蛋白的偶联量.结论 缺血预适应可能直接通过Cav-3促进PKCε、PKCδ、PKCα与心肌细胞富含Cav浆膜微小结构域的联系,这种调节机制在心肌保护中起重要作用.
作者：遇红梅；吕晓明；杨宇丹；孙巍；潘肃 刊期： 2013年第11期
目的 从富油土壤中筛选磷脂酶A1高产菌株,优化其发酵条件,并经等离子诱变提高其产酶能力.方法 用筛选培养基和发酵培养基分别对富油土壤中磷脂酶A1产生菌进行初筛和复筛,经气相色谱鉴定产酶类型;对获得的高产菌株进行形态、生理生化特征和分子生物学鉴定;优化该菌株的发酵时间,温度,pH值及摇床转速;从该菌株出发进行等离子体诱变,绘制致死率曲线,进行平板初筛及摇瓶复筛,并检测获得菌株的遗传稳定性.结果 经初筛和复筛,获得1株磷脂酶A1高产菌株W22,经气相色谱鉴定其产酶为磷脂酶A1;该菌株在普通琼脂培养基上呈圆形,质地软,表面光滑、扁平,乳白色,晕圈明显,为芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌;佳发酵条件为:发酵时间12h,初始pH8.0,温度32℃,摇床转速200 r/min,优化后酶活为9.12 U/ml,较优化前(6.74 U/ml)提高了35.3％;等离子体诱变后,经平板及摇瓶筛选,获得的菌株W22-5酶活高,为12.80 U/ml,较诱变前(9.12 U/ml)提高了89.91％,且具有良好的遗传稳定性.结论 成功获得1株磷脂酶A1高产菌株W22,优化了该菌的发酵条件,且经等离子诱变进一步提高了菌株的产酶能力,为磷脂酶A1的生产和应用奠定了基础.
作者：马琦亚；薛正莲；苏燕南；王洲；赵世光 刊期： 2013年第11期
目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号转导通路在脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion,I/R)中的作用及机制.方法 将大鼠随机分为6组:未使用p38MAPK抑制剂SB203580的假手术组(Sham组)、使用抑制剂的假手术组(Sham/SB组)、未使用抑制剂再灌注24h组(I/R24h组)、未使用抑制剂再灌注48 h组(I/R 48 h组)、使用抑制剂再灌注24 h组(SB 24 h组)和使用抑制剂再灌注48 h组(SB 48 h组).采用大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)复制大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,使用抑制剂的各组于造模前30 min经腹腔注射SB203580(5 mg /kg,溶于5 mg/ml DMSO).采用免疫荧光双标法检测大鼠大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)和脑微血管(microvascular,Mic.V)周围IgG的渗出;Western blot和RT-PCR法检测大鼠脑组织中p38、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase,MMP-9)、胶原Ⅳ型(collagenⅣ)蛋白和基因表达的变化.结果 随着再灌注时间的延长,大鼠脑血管内IgG渗出量增加(P＜0.01);经p38MAPK抑制剂预处理后,IgG的渗出程度有所减轻.脑缺血再灌注后,大鼠脑组织中p38、iNOS、MMP-9蛋白的表达水平和基因mRNA的转录水平均明显升高(P＜0.05),经p38MAPK抑制剂预处理后,能显著抑制p38、iNos、MMP-9蛋白的表达水平和基因mRNA的转录水平(P＜0.05);collagenⅣ蛋白的表达水平和基因mRNA的转录水平随着缺血时间的延长而逐渐下降(P＜0.05),经p38MAPK抑制剂预处理后,其下降程度有所减轻(P＜0.05).结论 MAPK通路中的关键蛋白p38、iNOS、MMP-9在脑缺血时表达显著增加,其过度表达直接导致血脑屏障的破坏,抑制其表达,从而遏制对血脑屏障的破坏,有望为I/R的治疗提供新的途径.
作者：余音；郭倩；潘乾广；石瑶；叶秀峰 刊期： 2013年第11期
目的 通过血浆特定蛋白检测,对层析法纯化IgG的中试工艺进行质量控制.方法 采用免疫散射比浊法及BNP特定蛋白分析仪及配套试剂,全面检测生产用和中试纯化工艺用原料血浆的组成,建立血浆中白蛋白(albumin,ALB)、IgG、IgA、IgM、补体3(compliment 3,C3)、C4、转铁蛋白(transferin,TRF)、αl-抗胰蛋白酶(α 1-antitrypsin,AAT)、α2巨球蛋白(alpha2-macroglobin,A2M)、触珠蛋白(haptoglobin,HPT)、α1酸性糖蛋白(alpha1-acid glycoprotein,AAG)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CER)、纤维蛋白原(fibfinogen,FIB)、抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ,ATⅢ)、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 18项特定蛋白分布的数据库;对3批中试纯化工艺各步骤中ALB、IgG、IgA、IgM、FIB、AAT的去除情况及IgG回收率进行监测,验证工艺的稳定性;将3批中试纯化工艺制备的原液及成品中IgG含量的检测结果与凯氏定氮法检测结果进行比较,验证免疫散射比浊法的准确度及不同人员重复检测的中间精密度;对中试纯化工艺及低温乙醇法制备的IgG原液的杂质含量及亚类进行比较分析.结果 中试纯化工艺用原料混浆中仅TRF、A2M、ATⅢ含量与生产用原料混浆差异有统计学意义(P＜0.05);中试纯化工艺用原料血浆经A2P亲和层析去除了大部分的ALB、AAT,辛酸盐沉淀去除了剩余的ALB、FIB和IgM,DEAE离子交换纯化去除了IgA和ALB,IgG总回收率高于70％,表明该工艺稳定性好,提高了目标蛋白的得率.中试纯化工艺制备的IgG原液及成品的检测CV值均＜10％,回收率在90％～ 110％之间,表明该方法准确度及精密度良好;与低温乙醇法制备的IgG原液相比,中试纯化工艺制备的原液杂质含量更低,IgG的亚类分布与所用的原料血浆相似.结论 血浆特定蛋白检测在血浆蛋白纯化工艺的监控和优化中具有应用价值.
作者：李策生；周志军；胡勇；李陶敬；林连珍；彭焱；高少阳 刊期： 2013年第11期
目的 分析中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)重庆株(CSBV-CQ)编码序列的分子特性.方法 采用RT-PCR法从重庆地区中蜂囊状幼虫病病死幼虫体内扩增CSBV编码序列片段,并进行序列测定,使用ClustalW2软件进行多序列比对分析,利用推导的氨基酸序列进行保守结构域BLAST和同源建模,采用MEGA 4软件的邻接法(neighbor-joining)中的大可能性算法(maximum likelihood method)构建系统进化树.结果 扩增的片段拼接出8 358 nt的片段,约占SBV基因组长度的95％; CSBV-CQ与CSBV-GZ的核苷酸和氨基酸序列同源性均高,在CSBV-GZ的2 270～2 320位碱基缺失51 nt核苷酸;多聚蛋白N-末端包含2个小RNA病毒衣壳蛋白药物结合口袋(drug-binding pocket)结构域(domain),C-末端包含RNA解旋酶(RNA helicase)和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)2个结构域;基于基因组水平的系统进化分析显示,所有东方蜜蜂分离株、西方蜜蜂分离株AmSBV-Korl9构成1个基因型,但基于基因组片段的分子系统进化分析显示,部分毒株包含2个基因型片段.结论 SBV基因型间存在基因重组现象.
作者：曹兰；张邑帆；沈克飞；任勤；杨柳；付利芝 刊期： 2013年第11期
目的 了解南昌市外伤人群的流行病学特征,探讨应用破伤风人免疫球蛋白(human tetanus lmmunoglobulin,TIG)的安全性及破伤风预防的效果.方法 按病历内容,对2009 ～ 2012年来南昌市疾控中心预防门诊注射TIG的781例外伤者进行流行病学调查,采用SPSS软件对调查资料进行统计学分析.结果 781例外伤者中男性549例,女性232例(P＜0.000 1),以青壮年(19 ～ 30岁)居多(P＜0.000 1);职业分布以工人、中小学生和个体工商户居多(P＜0.000 1);致伤原因以建筑铁钉、铁管等铁器致伤为主因,其次为摔伤、铁器致伤和斗殴致伤(P＜0.000 1);致伤部位主要为四肢伤(P＜0.000 1).有98.08％外伤者在24 h之内接种TIG,全部外伤者注射TIG后均未出现不良反应或发生破伤风病例.结论 外伤者应用TIG预防破伤风,高效安全,特别适用于破伤风抗毒素(tetanus anti-toxin,TAT)过敏者.
作者：唐荔伟；金燕；王菁；章媛英；喻迎九 刊期： 2013年第11期
目的 采用新型层析技术快速纯化人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs).方法 应用新型的基于阴离子交换和分子筛原理的色谱填料CaptoCore 700初纯昆虫细胞表达的HPV L1蛋白VLPs,再用高流速、高分辨力的阴离子交换树脂Capto Q ImpRes进一步纯化.各步纯化的样品经SDS-PAGE进行分析,采用ImageQuant图像分析软件分析两步纯化后蛋白的纯度,并对初纯蛋白进行质谱分析;改良Lowry法测定初纯蛋白的浓度,并计算杂蛋白去除率.结果 昆虫细胞表达的HPV L1蛋白经CaptoCore 700初纯后,目标蛋白组成的VLPs存在于流穿组分中,经质谱分析,为目的蛋白HPV L1;料液处理量为1个柱体积时,杂蛋白去除率达80％,料液处理量为2个柱体积时,杂蛋白去除率为76％.初纯的蛋白经Capto Q ImpRes进一步层析纯化,HPV L1蛋白的纯度接近100％.结论 CaptoCore 700加Capto Q ImpRes两步层析纯化能够快速高效地纯化HPV L1蛋白VLPs,整个工艺过程简单、快速、高效、易放大,适用于大规模生产.
作者：陆丽芳；隋礼丽 刊期： 2013年第11期
目的 观察姜黄素(curcumin)对APP/PS1(β-amyloid precursop protein/presenilin-1)双转基因阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)模型小鼠大脑海马组织中自噬相关基因Beclin1的表达以及淀粉样蛋白β(β-amyloid,Aβ)42生成的影响.方法 将APP/PS1双转基因小鼠随机分为姜黄素高、低剂量模型组和空白对照组,每组10只,高、低剂量组分别将姜黄素按1 000和160 mg/kg加入饲料中喂养,连续给药6个月,空白对照组给予正常饲料,采用免疫组化和Western blot法检测姜黄素对小鼠大脑海马中Beclin1的表达和Aβ42生成的作用.结果 与空白对照组相比,高、低剂量模型组小鼠大脑海马中Beclin1蛋白阳性细胞数及表达量均明显增多(P均＜0.05),Beclin1蛋白的表达无剂量依赖性;Aβ42的生成随药物浓度的增加明显减少(P＜0.05).结论 姜黄素可诱导APP/PS1双转基因小鼠大脑海马组织中Beelin1蛋白的表达,其机制可能是姜黄素通过促进自噬作用而抑制了Aβ42的生成,从而发挥其保护作用.
作者：王晨；滕志朋；张雄；李昱 刊期： 2013年第11期
目的 研制鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证.方法 用鼠疫菌F1抗原免疫家兔制备抗血清,经50％饱和硫酸铵盐析2次后,再经Sephacryl S-300凝胶柱层析纯化,作为包被抗体;制备鼠疫菌F1抗原单克隆抗体腹水,并进行纯化,用HRP标记单抗,作为酶标抗体;建立鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品.对试剂盒进行板内板间精密性、灵敏度、线性范围、特异性、重复性、准确性和稳定性验证.结果 制备的试剂盒检测精密性参比品的板内变异系数为5.2％,板间变异系数为8.23％;试剂盒的线性范围为3.91 ～ 62.5 ng/ml,低检测限为3.0 ng/ml;试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性,而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应;试剂盒检测高、中、低3种浓度F1抗原含量的变异系数为4.54％～8.4％,回收率在104％～108％之间;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年.结论 成功制备了鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,为鼠疫的临床诊断及流行病学监测提供了一种快速检测手段,也为新型鼠疫组分疫苗F1抗原含量的检测提供了方法.
作者：常娅莉；席仲兴；吴智远；徐秉臣；彭林锋；胡丽娜；热娜；雷刚；韩少波 刊期： 2013年第11期
目的 构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原表位的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗,为开展IL-13主动免疫干预慢性哮喘进程的研究奠定基础.方法 通过抗原性及亲水性预测并结合三维结构分析,获得处于人IL-13分子与其受体结合部位潜在的B细胞表位;根据预测的人IL-13抗原肽,合成寡核苷酸序列,并经变性、退火形成双链DNA片段,插入表达乙肝核心抗原(HBcAg)的pThioHisA-HBcAg(NP)载体中,构建重组表达质粒,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)DH5α,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经硫酸铵沉淀、洗涤初步纯化,并经凝胶过滤层析、密度梯度离心、电镜观察检测其VLPs的存在;将纯化后的重组蛋白在不使用任何常规佐剂的情况下免疫昆明小鼠,ELISA法检测小鼠血清中IL-13特异性抗体的滴度.结果 预测分析获得了3个潜在的B细胞表位;3个重组表达质粒pThioHisA(NP)-A、B、C经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白HBcAg+A、B、C相对分子质量分别约为20 000、19 000、18 500,可被兔抗人IL-13多克隆抗体特异性识别,并以VLPs形式存在;HBcAg+A和HBcAg+B重组蛋白诱导小鼠产生了较强的抗体应答,血清中IL-13抗体滴度高可达1:64000,而HBcAg+C重组蛋白未见特异抗体应答.结论 成功构建了呈现人IL-13抗原表位的VLPs疫苗,该疫苗可有效打破B细胞免疫耐受,免疫小鼠后产生了高滴度的特异性抗体,为进一步在猴体哮喘模型和人类临床试验中开展IL-13疫苗主动免疫干预哮喘疾病进程的研究奠定了基础.
作者：唐增华；龙琼；姚宇峰；黄惟巍；杨旭；孙文佳；刘存宝；马雁冰；魏云林 刊期： 2013年第11期
目的 探讨人参皂苷Rgt对辐射致造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSC/HPC)衰老的影响及其机制.方法 将C57BL/6小鼠随机分为假照射组、照射组和照射+Rg1组,照射组与照射+Rg1组利用6.5Gy的X射线全身一次性辐射小鼠.照射+ Rg1组于照射前第7天起连续经腹腔注射人参皂苷Rg1 20 mg/(kg·d),照射后继续注射同剂量人参皂苷Rg1直至处死;照射组同时注射等剂量的生理盐水;假照射组小鼠处理同照射组,但不照射.辐射后不同时间点处死各组动物,改良免疫磁性吸附细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)法分离、纯化骨髓Sea-1+ HSC/HPC并计数;SA-β-gal染色检测衰老细胞百分率;流式细胞术分析细胞周期;造血祖细胞混合集落(colony forming unit-mixture,CFU-Mix)体外培养评价人参皂苷Rg1对辐射小鼠HSC/HPC衰老的影响;彗星试验测定细胞DNA损伤;并检测细胞内SOD活性和MDA含量.结果 经MACS分离纯化后,Sca-1+ HSC/HPC的纯度可达93.66％,活性可达99.4％.照射组Sea-1+ HSC/HPC数量显著降低,且恢复缓慢,照射+Rg1组Sea-1+HSC/HPC数量下降在照射后第3天和第7天得到阻止,与照射组比较,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.001);照射组SA-β-gal阳性细胞率明显高于假照射组和照射+Rg1组(P＜0.001);照射组Sea-1+ HSC/HPC与假照射组相比出现G1期阻滞,照射+ Rg1组第3和第7天G1期细胞比例较照射组降低(P＜0.05或P＜0.01);照射组Sea-1+ HSC/HPC形成CFU-Mix的数量明显低于假照射组(P＜0.001),照射+Rg1组形成CFU-Mix的数量较照射组明显增加(P＜0.001);照射组DNA彗星尾长和Olive尾矩均明显大于假照射组和照射+Rg1组(P＜0.001);与假照射组相比,照射组Sea-1+ HSC/HPC的SOD活性明显降低(P＜0.001),MDA含量明显升高(P＜0.001),与照射组相比,照射+ Rg1组Sca-1+ HSC/HPC SOD活性明显升高(P＜0.01),MDA含量明显降低(P＜0.001).结论 辐射损伤可导致HSC/HPC衰老;人参皂苷Rg1具有抗辐射致HSC/HPC衰老的作用,其机制可能与抑制辐射致HSC/HPC氧化应激反应,减少氧化应激介导的DNA损伤密切相关.本实验为人参皂苷抗辐射损伤致细胞衰老提供了实验依据.
作者：陈萃；孙可；耿珊；刘俊；周玥；王璐；王建伟；黄国宁；王亚平 刊期： 2013年第11期
目的 比较卡介苗(bacillus Calmette-Guerin vaccine,BCG)与结核分枝杆菌早期分泌靶抗原(early secreted an-tigenic target-6,ESAT-6)刺激人外周血γδT细胞分泌细胞因子的能力.方法 采用Ficoll密度梯度离心法分离健康人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),加入Anti-human gamma-delta TCR-FITC抗体标记γδT细胞,上流式细胞仪进行分离纯化;分别用BCG和ESAT-6刺激γδT细胞,同时,以不加任何刺激因子的γδT细胞作为空白对照,分别于刺激培养后第1、3、6、9和12天取上清,采用ELISA试剂盒检测IL-17、TNF-α及IFNγ的分泌水平;上流式细胞仪检测yδT细胞的增殖水平.结果 γδT细胞占PBMC的4.83％,其纯度为88.90％;与空白对照组比较,BCG和ESAT-6刺激的yδT细胞分泌的IL-17、TNF-α及IFNγ水平均明显升高,且ESAT-6组明显高于BCG组(P均＜0.05);与空白对照组相比,BCG组和ESAT-6组γδT细胞数量明显增加,且ESAT-6组较BCG组增加明显(P均＜0.05).结论 BCG和ESAT-6均可刺激γδT细胞增殖,并大量分泌IL-17、TNF-α及IFNγ,且ESTA-6的刺激作用强于BCG.
作者：代光明；汪洪；郑权；杜发旺；杜先智 刊期： 2013年第11期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
