毛春梅；杨兰兰；刘先俊
目的 研究山葵提取物对结肠癌SW480细胞增殖及抑癌基因P16INK4amRNA转录水平的影响.方法 采用不同浓度的山葵提取物作用于SW480细胞48 h后,MTT法检测其对SW480细胞增殖的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡和周期分布的变化；RT-pCR检测抑癌基因P16INK4amRNA转录水平的变化.结果 山葵提取物对SW480细胞的增殖具有抑制作用,且呈浓度依赖性,IC50值约为130μmol/L；细胞的早期、晚期凋亡率呈浓度依赖性升高,细胞周期主要阻滞于G2期；细胞中抑癌基因P16INK4amRNA的转录水平下降,且呈浓度依赖性.结论 山葵提取物对SW480细胞的增殖具有抑制作用,并可诱导细胞凋亡；其通过抑制抑癌基因P16INK4amRNA的转录使细胞周期主要阻滞于G2期.
作者：毛春梅；杨兰兰；刘先俊 刊期： 2012年第04期
目的 建立一种可规模化纯化轮状病毒( Rotavirus,RV)的方法.方法 以氯化铯密度梯度离心法(离心法)纯化RV作为对照,分析采用离心-微滤-超滤-层析法(模块法)纯化RV的可行性.透射电镜观察病毒形态；微量滴定法测定病毒的感染性滴度；Bradford法检测纯化前后病毒液的蛋白含量,计算蛋白同收率；以两种方法纯化的病毒免疫BALB/c小鼠,微量中和试验检测小鼠血清中和抗体滴度.结果 模块法纯化的RV结构完整,感染性滴度可达(7.15±0.10)IgCCID50,可清除超过95％的蛋白质,蛋白回收率为(2.58±0.06)％,免疫小鼠可诱导中和抗体.模块法纯化的RV蛋白回收率、感染性滴度及诱导的小鼠中和抗体水平均显著高于离心法(P＜0.05或P＜0.01).结论 模块法可有效纯化RV,为RV灭活疫苗规模化纯化工艺的开发提供了实验依据.
作者：张标；佟琳；易山；张光明；谢天宏；李鸿钧；孙茂盛 刊期： 2012年第04期
目的 探讨高尔基体囊泡转运蛋白(Golgi-vesicular transport protein)p115基因沉默对人胃癌BGC-823细胞侵袭能力的影响及其机制.方法 采用脂质体法将质粒pGPU6/GFP/Neo/p115(p115 shRNA)和阴性对照质粒(shNC)分别转染至BGC-823细胞中,并设空白对照组.转染后48 h,采用RT-PCR、Westemblot和细胞免疫荧光法检测各组细胞中p115基因及蛋白表达的变化,及其对巨噬细胞游走抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)、基质金属蛋白酶-2( Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9基因和蛋白表达的调节；细胞划痕及Transwell小室试验检测细胞迁移及侵袭能力的变化.结果 p115 shRNA组细胞中p115、MIF、MMP-2、MMP-9在基因和蛋白水平的表达均较shNC组和空白对照组明显下降(P＜0.01 );p115shRNA组细胞的划痕愈合能力明显低于两个对照组(P＜0.01)；p115 shRNA组的穿膜细胞数明显低于两个对照组(P＜0.01).结论 在BGC-823细胞中,抑制P115的表达后,可能通过下调MIF、MMP-2、MMP-9的表达,抑制肿瘤细胞的侵袭运动.
作者：闫田静；易永芬；邓玮；文雪；屈玉玲 刊期： 2012年第04期
目的 探讨胰岛新生相关蛋白肽(Islet neogenesis associated protein-pp,INGAP-pp)对体外培养的人胰岛细胞分泌胰岛素水平的影响.方法 取成人胰头癌患者手术中切除的胰腺组织正常胰尾部分,分离纯化胰岛进行体外培养,检测胰岛的生物学活性,并比较添加与不添加INGAP-pp培养的胰岛分泌胰岛素能力的变化.结果 分离纯化的胰岛具有良好的生物学活性.在体外培养21 d后,未添加INGAP-pp的胰岛分泌胰岛素的能力逐渐丢失,胰岛形态发生显著变化,细胞团崩解后细胞逐渐死亡；而添加了INGAP-pp的胰岛形态保持相对良好,且胰岛素分泌水平从培养的第6天起均显著高于未添加组(P＜0.05或P＜0.01).结论 INGAP-pp能显著促进体外培养的人胰岛细胞分泌胰岛素.
作者：任莉莉；齐晖；陈丽娟；李富荣 刊期： 2012年第04期
目的 原核表达并纯化肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)热休克蛋白ClpL,并评价其作为S.pn疫苗候选蛋白的可行性.方法 PCR扩增S.pn D39全长ClpL基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达,表达的重组ClpL蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗ClpL多克隆抗体的效价及亚型；Western blot分析ClpL蛋白在5种常见S.pn中的保守性；流式细胞术及Western blot分析ClpL蛋白在S.pn中的亚细胞定位.结果 重组表达质粒pET-28a(+ )-ClpL经双酶切及测序证实构建正确；ClpL蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度达90％,浓度为4.97 mg/ml;免疫小鼠可产生高滴度、高特异性的IgG抗体,以IgG1和IgG2b亚型为主；ClpL蛋白在5株常见S.pn中均有表达；ClpL蛋白为分泌型蛋白,不表达于S.pn表面.结论 原核表达并纯化了S.pn ClpL蛋白,其作为一种在S.pn中保守存在的分泌型蛋白,可能是一种较好的疫苗候选蛋白.
作者：钟文；张群；龚艺；张彦青；陈倩；陈特；董杰；王虹；张雪梅 刊期： 2012年第04期
目的 筛选靶向晚期炎症因子高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1 protein,HMGB1)基因的高效RNA干扰(siRNA)序列,并检测其体外生物学效应.方法 选择针对HMGB1基因mRNA的3条不同序列,用T7体外转录系统合成3条siRNA,转染RAW264.7细胞,6h后,加入500 ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)分别刺激24、48 h,另设单纯LPS刺激组和只加培养液的对照组.采用RT-PCR检测各组细胞中HMGB1基因mRNA的转录水平,ELISA检测细胞培养上清液中HMGB1的含量.结果 体外合成的HMGB1 siRNA1～3经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见21 bp的RNA片段；经LPS刺激24和48 h,RAW264.7细胞中HMGB1基因mRMA的转录水平和细胞培养上清液中HMGB1的含量与对照组相比均显著升高,3条HMGB1 siRNA均能抑制细胞中HMGB1基因mRNA的转录水平,并减少细胞培养上清液中HMGB1的含量,其中以HMGB1siRNA1的效果为明显.结论 LPS可刺激RAW264.7细胞释放大量HMGB1,同时增加细胞中mRNA的转录水平；HMGB1siRNA能有效降低HMGB1蛋白和mRNA水平,有望成为控制晚期炎症发展的新的治疗手段.
作者：李小凤；夏云；苏小燕；王慧娟 刊期： 2012年第04期
目的 建立基于TaqMan探针的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)荧光定量PCR检测方法.方法 根据PCV2ORF2的相对保守序列,设计两对特异性引物及TaqMan探针,制备重组质粒标准品；优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性；用建立的方法对50份临床样本进行检测,并与普通PCR检测结果进行比较.结果 重组质粒标准品经PCR及测序鉴定构建正确；建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数对数之间呈良好的线性关系,相关系数R2为0.993 85；该方法的敏感性为6×101拷贝/μl,比普通PCR高2个数量级；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟兔化弱毒均无扩增曲线；检测3份PCV2阳性模板的变异系数在0.07％～0.50％之间；临床样本的阳性检出率(64％)明显高于普通PCR(44％),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 建立的PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和重复性,适用于临床样本中微量PCV2的快速检测及其组织亲嗜性、细胞培养特性的研究.
作者：陈蓉；王艳；魏建忠；刘军军；孙裴；殷宗俊；李郁 刊期： 2012年第04期
目的 分离、培养并鉴定SD大鼠骨髓中神经组织干细胞(Neural tissue committed stem cells,NTCSCs).方法 采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞条件培养液,从大鼠骨髓中分离、培养克隆生长的NTCSCs,采用免疫组化法对骨髓NTCSCs及其分化进行鉴定,RT-PCR法检测骨髓NTCSCs中Nestin、CXCR4、CD31、βⅢ-Tubulin、GFAP基因mRNA的转录.结果 分离培养获得悬浮生长的细胞球,该细胞球表达神经干细胞标志Nestin及CXCR4,分化后表达神经元标志βⅢ-Tubulin和神经胶质细胞标志GFAP；该细胞中有Nestin、CXCR4、CD31、βⅢ-Tubulin、GFAP基因mRNA转录.结论 在骨髓中成功分离到NTCSCs,其具有神经生物学特征,可作为种子细胞,在临床中枢神经系统疾病的治疗及创伤的修复中具有广阔的应用前景.
作者：李琳；张兴秀；王健；姜容；郑敏 刊期： 2012年第04期
目的 探讨不同剂量粉尘螨提取液对哮喘小鼠CD4+CD25调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)的影响,确定粉尘螨提取液免疫治疗的佳维持剂量.方法 用粉尘螨提取液经腹腔注射C57BL/6小鼠,建立过敏性哮喘模型,将32只哮喘小鼠随机分为4组:生理盐水组以及粉尘螨低(100 μg/只)、中(1 mg/只)和高(2 mg/只)剂量组,治疗完成后,采用流式细胞术检测小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞及Foxp3+C D4+C D25 +Tregs的含量,ELISA法检测小鼠血清中细胞因子IL-10、TGF-β1的水平.结果 生理盐水组、粉尘螨低剂量组小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的百分比均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均＜0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；生理盐水组、粉尘螨低剂量组脾细胞中Foxp3+C D4+CD25 +Tregs占CD4+CD25+T细胞的百分比均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均＜0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；生理盐水组、粉尘螨低剂量组小鼠血清中IL-10和TGF-β1的水平均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均＜0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 中剂量粉尘螨提取液为哮喘特异性免疫治疗的佳维持剂量.
作者：吴雪郡；黄英；韩洁；王模奎；王莹；王莉佳 刊期： 2012年第04期
目的 建立融合蛋白FP3等电点毛细管等电聚焦(Capillary isoelectric focusing,cIEF)电泳分析方法.方法 采用中性涂层的毛细管,有效长度为20 cm,总长度为30 cm,内径为50 μm;分离温度20℃；检测波长280 nm; 20 Psi压力进样99 s,电压20 kV分离聚焦20 min,电压25 kV化学迁移25 min.比较不同两性电解质(PharmalyteTM 3-10和AmpholineTM3.5-10)、增溶剂类型及浓度、聚焦电压(15、20、30 kV)对样品分离效果的影响,并验证系统的适应性、方法的重现性及系统的稳定性.结果 建立的cIEF方法可使样品的电荷异构体有效分离,样品主峰与次主峰的分离度为1.249 (USP).AmpholineTM 3.5-10可使样品的各个电荷异质性组分更有效地分离；6 mol/L尿素能提供良好的增溶环境；20 kV聚焦电压即可获得良好的分离效果.连续5次进样,主峰和次主峰迁移时间相对标准偏差(RSD)分别为1.29％和1.32％,样品主区带等电点范围为6.33～6.90,样品在24h内检测结果稳定.结论 建立了融合蛋白FP3等电点cIEF分析方法,该方法具有分离度高、重现性好、方法稳定和结果准确等优点,为该类制品的质量控制提供了更好的手段.
作者：李响；高向东；田宏；饶春明 刊期： 2012年第04期
随着基因工程技术的发展,蛋白质、多肽类药物的临床应用越来越受到重视.但蛋白质、多肽类药物的免疫原性和毒副反应及半衰期短等问题限制了其应用和发展.聚乙二醇( Polyethylene glycol,PEG)能够使蛋白药物溶解行为改善,稳定性增强,免疫原性消除或降低,循环半衰期延长,药代动力学优化,在生物技术和生物医学中具有广泛的应用前景.本文就蛋白质、多肽类药物的PEG修饰、修饰技术的发展、修饰的主要途径以及PEG修饰药物的现状及前景作一综述.
作者：惠希武；陈虹；黄秉仁 刊期： 2012年第04期
目的 优化长链人胰岛素样生长因子-1(Long chain Arg3 human insulin-like growth factor-1,LR3IGF-1)在毕赤酵母中的表达条件.方法 考察甲醇诱导浓度(0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.25％和1.50％)、诱导温度(25、28、30℃)、pH值(4.75、5.00、5.25、5.50、5.75和6.00)及添加剂(0.1％的精氨酸、甘氨酸、组氨酸、吐温-20和吐温-80)对LR3IGF-1在毕赤酵母中表达的影响,优化LR3IGF-1的表达条件.以佳表达条件在发酵罐中诱导表达LR3IGF-1,检测其表达量,并与初始发酵条件的表达量进行比较.结果 甲醇浓度为0.75％及诱导温度为25℃时,LR3IGF-1的表达量高,分别为76.5和98 mg/L;pH值为5.25,诱导24 h,LR3IGF-1的表达量较高,且降解程度低；添加吐温-20可使LR3IGF-1的表达量提高至271 mg/L.以优化的条件进行发酵,LR3IGF-1的表达量可达497 mg/L,较优化前(52 mg/L)提高了近9倍,且诱导时间从48 h缩短至24h.结论 优化了LR3IGF-1在毕赤酵母中的表达条件,为其规模化生产奠定了基础.
作者：张文明；洪静；孙天玮；黄国团；梁军；王大力；林殿海 刊期： 2012年第04期
目的 探讨COL1A1基因干扰对人结肠癌HCT-8细胞增殖的影响.方法 将COL1A1基因干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-COL1A1 (RNAi COL1A1)和阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-shNC( PGNsN)瞬时转染入HCT-8细胞,并设空白对照组.转染后48～ 72 h,采用半定量RT-PCR法检测COL1A1基因在细胞中的转录水平；MTT法检测细胞的增殖活力；并将各组细胞接种至BALB/c小鼠上皮组织中,每隔6d分别测量小鼠体内肿瘤大小.结果 RNAi COL1A1组HCT-8细胞COL1A1基因的mRNA转录水平较PGNsN组和空白对照组显著降低(P＜0.01).RNAi COL1A1组与PGNsN组和空白对照组比较,细胞的增殖活力有所降低,第4～7天差异有统计学意义(P＜0.05),其中在第5和第6天差异极显著(P＜0.01).RNAi COL1A1组小鼠体内肿瘤大小与PGNsN组和空白对照组比较,前18d差异无统计学意义(P＞0.05)；在第24天,显著小于两个对照组(P＜0.05)；在第30天,差异极显著(P＜0.01).结论 COL1A1基因被干扰后,能够抑制HCT-8细胞增殖,为COL1A1成为癌症治疗的候选基因提供了实验依据.
作者：李鹏；马艳娇；李建华；宫鹏涛；杨举；李赫；欧阳红生；张西臣 刊期： 2012年第04期
目的 探讨茶多酚(Tea polyphenols,TP)诱导人胆囊癌细胞GBC-SD凋亡过程中细胞内游离钙离子浓度[Ca+]；及线粒体膜电位(△ψm)的变化.方法 采用MTT法检测TP对GBC-SD细胞增殖的影响；Annexin V-FITC/PI双染色,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning cofocal microscopy,LSCM)观察TP对GBC-SD细胞凋亡的影响；Fluo-3 AM和Rhodamine123染色标记,LSCM观察TP对GBC-SD细胞内[Ca2+]i及△ψm的影响.结果 TP可明显抑制GBC-SD细胞增殖,并诱导细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性；TP能使GBC-SD细胞内[Ca2+].增加,△ψm降低,且呈剂量和时间效应关系.结论 TP对GBC-SD细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用,其机制可能与其上调细胞内[ Ca2+]i、降低△ψm有关.
作者：连超群；张静；陈振东；夏俊 刊期： 2012年第04期
目的 采用超滤法去除A群脑膜炎球菌多糖料液中的苯酚.方法 选取Omega OS01 0C10膜包(C型筛网,10 KD,过滤面积0.1m2)和Omega OS010T12膜包(T型筛网,10 KD,过滤面积0.1m2),分别对A群脑膜炎球菌多糖料液进行超滤,比较两种膜包不同压力对膜滤速的影响,测定超滤前后膜净水滤速的恢复率,分析经超滤和透析后样品中磷和苯酚含量及固体总量.结果 OS010T12膜包切向流速和压力的增加对滤速的影响较OS010C10膜包更显著,且在较低的压力差和过膜压力下,OS010T12膜包具有更高的过滤速度；在浓缩和洗滤阶段,OS010T12膜包的平均滤速较OS010C10膜包高约1.3倍；膜包经清洗后,膜净水滤速OS010T12膜包可恢复至试验前水平；两种膜包超滤的滤出液中苯酚的含量均符合《中国药典》三部(2010版)要求,且多糖回收率均高达90％以上,超滤用时比透析至少节约46 h,且耗水量只有透析工艺的20％.结论 可用OS010T12膜包替换透析袋,对A群脑膜炎球菌多糖料液进行超滤,去除残余苯酚,为A群脑膜炎球菌多糖疫苗的生产提供了参考.
作者：胡菁；薛红刚；郭蓉；陈有喜；瞿明霞；陈浩军 刊期： 2012年第04期
目的 应用AOXl和GAP双启动子共表达体系提高人胰岛素原在毕赤酵母中的表达量.方法 用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pMD18-T-HMPIDesB30质粒,回收含短C肽AAK并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物HMPIDesB30( Human mini-proinsulin des B30)片段,插入pGAPZαA载体中,构建重组质粒pGAPZαA-HMPIDesB30,电转化至经质粒pPIC9K-HMPIDesB30异位整合的胰岛素原分泌菌株FJ-H1(pPIC9K-HMPIDesB30/GS115)中,应用抗生素法筛选高表达菌株,并进行发酵试验.结果 重组质粒pGA PZαA-HM PIDesB30经双酶切及测序证实构建正确；经Zeocin筛选获得高表达量菌株FJ-H3.经30 L发酵罐发酵,FJ-H3菌株人胰岛素原的表达水平可达1.6 g/L,分别为FJ-H1菌株的1.6倍,FJ-H2菌株(pGAPZαA-HMPIDesB30/GS 115)的5.3倍；经质谱分析,胰蛋白酶酶切后的目的蛋白相对分子质量与理论值相符.结论 利用AOX1和GAP双启动子在毕赤酵母中高效表达了人胰岛素原类似物HMPIDesB30,为实现胰岛素的规模化制备奠定了基础.
作者：李红亮；陈勇；陈海容；黄程；冯一建；梅翔；何跃；范开 刊期： 2012年第04期
目的 建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法.方法 基于高致病性PRRSVTJ株及其基因缺失致弱疫苗株TJM-F92的nsp2基因序列设计1对引物,建立可鉴别不同高致病性PRRSV野毒株与基因双缺失弱毒疫苗株的一步法RT-PCR,并进行特异性、灵敏度、敏感性、重复性验证.结果 高致病性PRRSV TJ株扩增出1 100bp的条带,基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92扩增出740 bp的条带,可对两毒株作出准确鉴别；建立的一步法RT-PCR可测出101 TCID50/ml的PRRSV-TJ疫苗毒株,灵敏度较高；对已知阳性和阴性仔猪血清样品的检测结果100％相符,敏感性较高,且重复性较好.结论 建立的一步法RT-PCR可用于接种TJM-F92疫苗猪群中PRRSV野毒感染与疫苗免疫猪的临床鉴别,有助于评价疫苗的免疫效果并及早发现野毒感染.
作者：梅林；高英杰；梁智选；赵建增 刊期： 2012年第04期
随着扩大免疫规划的执行以及新型疫苗的不断开发和应用,儿童接种疫苗的针次越来越多,这不但增加了儿童接种疫苗的痛苦,也给家长和医务工作者带来诸多不便.因此,开发和应用接种1次能预防多种疾病的联合疫苗是发展的趋势.本文对国内外联合疫苗的新研究进展作一综述.
作者：王丽婵 刊期： 2012年第04期
目的 构建细胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达.方法 以pMD19-T simple-Ipr1质粒为模板,采用PCR法扩增Ipr1基因,克隆至表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+ )-Ipr1,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确；表达的重组Ipr1蛋白相对分子质量约为70 000,以1.5 mmol/L IPTG诱导4h,目的蛋白的表达量高,约占菌体总蛋白的16％,重组Ipr1蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了Ipr1基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组Ipr1蛋白,为进一步探讨Ipr1蛋白的功能及Ipr1重组BCG的构建奠定了基础.
作者：余茜；徐蕾；何永林；靳志栋；张丹；杨春 刊期： 2012年第04期
目的 优化pUC118-ski/DH5α工程菌的发酵工艺.方法 筛选高拷贝质粒工程菌,通过优化培养基组分、发酵温度、补料成分和补料方式及培养时间,确定佳发酵参数；以佳发酵参数在50 L发酵罐中连续发酵3批,验证优化的发酵工艺的重复性.结果 佳发酵参数为:以甘油为碳源的培养基,发酵温度25℃,以50％Glycerol梯度恒速流加方式补料,培养时间为12 h；以佳发酵参数在50 L发酵罐中连续发酵3批工程菌,菌体湿重和质粒含量分别达52.7～60.3 g/L和1.79～1.95 mg/g湿菌,质粒拷贝数为1012 copies/μl,超螺旋质粒的比例达90％以上.结论 优化了pUC 118-ski/DH5α工程菌的发酵工艺,为重组质粒的规模化生产及下游纯化奠定了基础.
作者：彭艳；李平；刘苹；周元国 刊期： 2012年第04期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
