毛春梅；杨兰兰；刘先俊
随着基因工程技术的发展,蛋白质、多肽类药物的临床应用越来越受到重视.但蛋白质、多肽类药物的免疫原性和毒副反应及半衰期短等问题限制了其应用和发展.聚乙二醇( Polyethylene glycol,PEG)能够使蛋白药物溶解行为改善,稳定性增强,免疫原性消除或降低,循环半衰期延长,药代动力学优化,在生物技术和生物医学中具有广泛的应用前景.本文就蛋白质、多肽类药物的PEG修饰、修饰技术的发展、修饰的主要途径以及PEG修饰药物的现状及前景作一综述.
作者：惠希武；陈虹；黄秉仁 刊期： 2012年第04期
目的 建立一种可规模化纯化轮状病毒( Rotavirus,RV)的方法.方法 以氯化铯密度梯度离心法(离心法)纯化RV作为对照,分析采用离心-微滤-超滤-层析法(模块法)纯化RV的可行性.透射电镜观察病毒形态；微量滴定法测定病毒的感染性滴度；Bradford法检测纯化前后病毒液的蛋白含量,计算蛋白同收率；以两种方法纯化的病毒免疫BALB/c小鼠,微量中和试验检测小鼠血清中和抗体滴度.结果 模块法纯化的RV结构完整,感染性滴度可达(7.15±0.10)IgCCID50,可清除超过95％的蛋白质,蛋白回收率为(2.58±0.06)％,免疫小鼠可诱导中和抗体.模块法纯化的RV蛋白回收率、感染性滴度及诱导的小鼠中和抗体水平均显著高于离心法(P＜0.05或P＜0.01).结论 模块法可有效纯化RV,为RV灭活疫苗规模化纯化工艺的开发提供了实验依据.
作者：张标；佟琳；易山；张光明；谢天宏；李鸿钧；孙茂盛 刊期： 2012年第04期
目的 原核表达并纯化肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)热休克蛋白ClpL,并评价其作为S.pn疫苗候选蛋白的可行性.方法 PCR扩增S.pn D39全长ClpL基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导表达,表达的重组ClpL蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗ClpL多克隆抗体的效价及亚型；Western blot分析ClpL蛋白在5种常见S.pn中的保守性；流式细胞术及Western blot分析ClpL蛋白在S.pn中的亚细胞定位.结果 重组表达质粒pET-28a(+ )-ClpL经双酶切及测序证实构建正确；ClpL蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度达90％,浓度为4.97 mg/ml;免疫小鼠可产生高滴度、高特异性的IgG抗体,以IgG1和IgG2b亚型为主；ClpL蛋白在5株常见S.pn中均有表达；ClpL蛋白为分泌型蛋白,不表达于S.pn表面.结论 原核表达并纯化了S.pn ClpL蛋白,其作为一种在S.pn中保守存在的分泌型蛋白,可能是一种较好的疫苗候选蛋白.
作者：钟文；张群；龚艺；张彦青；陈倩；陈特；董杰；王虹；张雪梅 刊期： 2012年第04期
目的 分析国内10省市孕妇孕期IgG血型抗体效价与ABO新生儿溶血病(Hemolytic disease of newborn,HDN)的相关性.方法 对本市300名孕妇及其丈夫进行ABO血型定型；对孕妇血清进行IgG抗-A和(或)抗-B效价测定；孕妇分娩后,对有HDN临床指征的患儿进行ABO血型定型及HDN 3项试验；分析本市及国内其他9省市孕妇IgG血型抗体效价与HDN的相关性.结果 本市300名孕妇的ABO血型均为0型,其丈夫为非0型(A、B或AB型).国内10省市HDN的发生率均随孕妇IgG血型抗体效价的升高而升高；各效价组HDN的发生率10省市间相比,差异均有统计学意义(P均＜0.05)；合计国内10省市数据,孕妇IgG血型抗体不同效价组间HDN的发生率均有统计学意义(P＜0.05),孕妇IgG血型抗体效价与HDN的发生率呈正相关(r=0.866,P＜0.05),以抗体效价32～64的HDN发生率增幅大(440％).结论 孕妇IgC血型抗体效价可作为评估HDN发生风险的指标之一,但并非唯一性指标,还应结合其他检测结果及孕妇临床状况综合分析,做出判断.
作者：朱业华；伍伟健；马春会；郭如华；余晋林 刊期： 2012年第04期
目的 探讨茶多酚(Tea polyphenols,TP)诱导人胆囊癌细胞GBC-SD凋亡过程中细胞内游离钙离子浓度[Ca+]；及线粒体膜电位(△ψm)的变化.方法 采用MTT法检测TP对GBC-SD细胞增殖的影响；Annexin V-FITC/PI双染色,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning cofocal microscopy,LSCM)观察TP对GBC-SD细胞凋亡的影响；Fluo-3 AM和Rhodamine123染色标记,LSCM观察TP对GBC-SD细胞内[Ca2+]i及△ψm的影响.结果 TP可明显抑制GBC-SD细胞增殖,并诱导细胞凋亡,且呈时间和剂量依赖性；TP能使GBC-SD细胞内[Ca2+].增加,△ψm降低,且呈剂量和时间效应关系.结论 TP对GBC-SD细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用,其机制可能与其上调细胞内[ Ca2+]i、降低△ψm有关.
作者：连超群；张静；陈振东；夏俊 刊期： 2012年第04期
目的 克隆人白细胞介素-29 (Interleukin-29,IL-29)基因并进行真核表达.方法 提取人外周血单个核细胞( PBMC)总RNA,经逆转录合成cDNA,以其为模板,PCR扩增IL-29基因,插入真核表达载体pPIC9K,构建重组真核表达质粒pPIC9K-29,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果 扩增的IL-29基因序列与GenBank中登录的序列(NM_172140)相同；重组表达质粒pPIC9K-29经双酶切及测序证实构建正确；表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量分别约30 000和27 000的特异蛋白条带,经Western blot分析,均可与羊抗人IL-29多抗发生特异性反应.结论 已克隆并在毕赤酵母GS115中表达了人IL-29,为进一步研究其生物学活性及其应用奠定了基础.
作者：陈伟；于明磊；郑海军；郁心；邬敏辰；吴静 刊期： 2012年第04期
目的 构建结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达融合蛋白.方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增CFP10和PPE68基因,基因拼接法扩增CFP10-PPE68融合基因,克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-CFP10-PPE68,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒pET-32a( +)-CFP10-PPE68经双酶切和测序证明构建正确；表达的融合蛋白相对分子质量为68 630,表达量为菌体总蛋白的41.8％,主要以可溶性形式存在,且可与PPE68 rBCG免疫兔血清发生特异性反应.结论 成功构建了结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21( DE3)中表达了融合蛋白,为其在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础.
作者：董志玲；何永林；徐蕾；王静娴；张壮苗；杨静；冯鑫；杨春 刊期： 2012年第04期
目的 采用乙酰丙酮分光光度法检测亚单位流感疫苗中的甲醛含量.方法 采用乙酰丙酮分光光度法检测亚单位流感疫苗中的甲醛含量,对测定波长、乙酰丙酮、乙酸、乙酸铵浓度、保温时间、降温时间进行优化,并对方法进行验证.结果 在500 μl样品和4.5ml乙酰丙酮溶液反应体系中,在0.125％乙酰丙酮、1.5％乙酸、25％乙酸铰条件下,40℃保温30 min,室温静置30 min后,在波长414 nm处测定甲醛含量,可获得佳检测效果；在1- 50 μg/ml的浓度范围内标准曲线线性关系良好,回收率为101.9％,低定量限为1μg/ml.结论 应用乙酰丙酮分光光度法检测亚单位流感疫苗中的甲醛含量简便、快速、准确,灵敏度高,适用于实验室对甲醛含量的常规检测.
作者：田文莉；杨江山；万亚芬；祁骥；杨旭；李小强 刊期： 2012年第04期
目的 探讨干扰素(Interferon,IFN)及白细胞介素-6( Interleukin-6,IL-6)、IL-1β在肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染过程中的作用.方法 采用EV71-FY23,在IFNα1b、IFNλ1和IFNγ分别存在的条件下感染Vero细胞及KMB17细胞,检测IFN对细胞的保护作用；建立EV71感染乳鼠模型,检测IFNα1b、IFNλ1、IFNγ、IL-6及IL-1β的抗病毒作用.结果 IFNα1b和IFNλ1对EV71感染的细胞具有明显的保护作用,而IFNγ的保护作用不明显；IFNα1b对感染EV71的乳鼠具有较好的保护效果,其在病毒感染之前的预处理方式产生的保护效果较为明显；IL-1β对感染EV71的乳鼠亦有不同程度的保护作用,而IL-6预处理方式不但无保护作用,反而加速了乳鼠的死亡.结论 IFN和IL-1β对EV71感染具有保护作用,而IL-6无此作用.
作者：范胜涛；王丽春；赵恒；刘龙丁；李琦涵 刊期： 2012年第04期
目的 建立基于TaqMan探针的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)荧光定量PCR检测方法.方法 根据PCV2ORF2的相对保守序列,设计两对特异性引物及TaqMan探针,制备重组质粒标准品；优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性；用建立的方法对50份临床样本进行检测,并与普通PCR检测结果进行比较.结果 重组质粒标准品经PCR及测序鉴定构建正确；建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数对数之间呈良好的线性关系,相关系数R2为0.993 85；该方法的敏感性为6×101拷贝/μl,比普通PCR高2个数量级；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟兔化弱毒均无扩增曲线；检测3份PCV2阳性模板的变异系数在0.07％～0.50％之间；临床样本的阳性检出率(64％)明显高于普通PCR(44％),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 建立的PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和重复性,适用于临床样本中微量PCV2的快速检测及其组织亲嗜性、细胞培养特性的研究.
作者：陈蓉；王艳；魏建忠；刘军军；孙裴；殷宗俊；李郁 刊期： 2012年第04期
目的 建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法.方法 基于高致病性PRRSVTJ株及其基因缺失致弱疫苗株TJM-F92的nsp2基因序列设计1对引物,建立可鉴别不同高致病性PRRSV野毒株与基因双缺失弱毒疫苗株的一步法RT-PCR,并进行特异性、灵敏度、敏感性、重复性验证.结果 高致病性PRRSV TJ株扩增出1 100bp的条带,基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92扩增出740 bp的条带,可对两毒株作出准确鉴别；建立的一步法RT-PCR可测出101 TCID50/ml的PRRSV-TJ疫苗毒株,灵敏度较高；对已知阳性和阴性仔猪血清样品的检测结果100％相符,敏感性较高,且重复性较好.结论 建立的一步法RT-PCR可用于接种TJM-F92疫苗猪群中PRRSV野毒感染与疫苗免疫猪的临床鉴别,有助于评价疫苗的免疫效果并及早发现野毒感染.
作者：梅林；高英杰；梁智选；赵建增 刊期： 2012年第04期
目的 建立NaOH乙醇溶液和γ射线辐照两步法灭活壳聚糖中病毒的工艺.方法 以牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)为指示病毒,分别采用NaOH乙醇溶液和γ射线辐照法灭活壳聚糖中的BVDV和PPV,并对两种方法进行优化.以优化的灭活条件建立两步法灭活工艺,测定病毒滴度、壳聚糖相对分子质量、脱乙酰度和乙醇含量.结果 含8 mol/L NaOH的10％乙醇溶液,35℃处理1h后冻干,再采用γ射线辐照(5 kGy),BVDV和PPV的滴度均下降4 lgTCID50以上,同时,壳聚糖的相对分子质量仅降低8.4％,脱乙酰度无显著变化,未检出残留乙醇.结论 NaOH乙醇溶液和γ射线辐照两步法可有效灭活壳聚糖中的指示病毒,同时对壳聚糖质量影响较小,为保证壳聚糖作为生物材料及药用辅料使用的安全性提供了保障.
作者：李博；张家骊；夏文水 刊期： 2012年第04期
目的 研究山葵提取物对结肠癌SW480细胞增殖及抑癌基因P16INK4amRNA转录水平的影响.方法 采用不同浓度的山葵提取物作用于SW480细胞48 h后,MTT法检测其对SW480细胞增殖的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡和周期分布的变化；RT-pCR检测抑癌基因P16INK4amRNA转录水平的变化.结果 山葵提取物对SW480细胞的增殖具有抑制作用,且呈浓度依赖性,IC50值约为130μmol/L；细胞的早期、晚期凋亡率呈浓度依赖性升高,细胞周期主要阻滞于G2期；细胞中抑癌基因P16INK4amRNA的转录水平下降,且呈浓度依赖性.结论 山葵提取物对SW480细胞的增殖具有抑制作用,并可诱导细胞凋亡；其通过抑制抑癌基因P16INK4amRNA的转录使细胞周期主要阻滞于G2期.
作者：毛春梅；杨兰兰；刘先俊 刊期： 2012年第04期
目的 探讨不同剂量粉尘螨提取液对哮喘小鼠CD4+CD25调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)的影响,确定粉尘螨提取液免疫治疗的佳维持剂量.方法 用粉尘螨提取液经腹腔注射C57BL/6小鼠,建立过敏性哮喘模型,将32只哮喘小鼠随机分为4组:生理盐水组以及粉尘螨低(100 μg/只)、中(1 mg/只)和高(2 mg/只)剂量组,治疗完成后,采用流式细胞术检测小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞及Foxp3+C D4+C D25 +Tregs的含量,ELISA法检测小鼠血清中细胞因子IL-10、TGF-β1的水平.结果 生理盐水组、粉尘螨低剂量组小鼠脾细胞中CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的百分比均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均＜0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；生理盐水组、粉尘螨低剂量组脾细胞中Foxp3+C D4+CD25 +Tregs占CD4+CD25+T细胞的百分比均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均＜0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；生理盐水组、粉尘螨低剂量组小鼠血清中IL-10和TGF-β1的水平均明显低于粉尘螨中剂量组和高剂量组(P均＜0.05),而中剂量组与高剂量组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 中剂量粉尘螨提取液为哮喘特异性免疫治疗的佳维持剂量.
作者：吴雪郡；黄英；韩洁；王模奎；王莹；王莉佳 刊期： 2012年第04期
目的 原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株黏附蛋白(G)片段.方法 利用PCR技术从HRSV兰州株(A亚型)中扩增G基因AA75-225片段,克隆至原核表达载体pET-42b(+)中,构建重组表达质粒pET-42b-G,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 PCR扩增获得453 bp的DNA片段；重组表达质粒pET-42b-G经双酶切及测序鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量为50 230,表达量占菌体总蛋白的25％,以包涵体和可溶性两种方式存在；纯化后重组蛋白纯度可达95％以上,可与抗RSV-G蛋白单克隆抗体特异性结合.结论 已成功地在大肠杆菌BL21( DE3)中表达了HRSV兰州株G片段,为后续RSV疫苗的研制、RSV感染的血清学诊断及试剂盒的研发提供了材料.
作者：朱传凤；傅生芳；寇桂英；陈汉泉；余黎；周旭 刊期： 2012年第04期
目的 探讨COL1A1基因干扰对人结肠癌HCT-8细胞增殖的影响.方法 将COL1A1基因干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-COL1A1 (RNAi COL1A1)和阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-shNC( PGNsN)瞬时转染入HCT-8细胞,并设空白对照组.转染后48～ 72 h,采用半定量RT-PCR法检测COL1A1基因在细胞中的转录水平；MTT法检测细胞的增殖活力；并将各组细胞接种至BALB/c小鼠上皮组织中,每隔6d分别测量小鼠体内肿瘤大小.结果 RNAi COL1A1组HCT-8细胞COL1A1基因的mRNA转录水平较PGNsN组和空白对照组显著降低(P＜0.01).RNAi COL1A1组与PGNsN组和空白对照组比较,细胞的增殖活力有所降低,第4～7天差异有统计学意义(P＜0.05),其中在第5和第6天差异极显著(P＜0.01).RNAi COL1A1组小鼠体内肿瘤大小与PGNsN组和空白对照组比较,前18d差异无统计学意义(P＞0.05)；在第24天,显著小于两个对照组(P＜0.05)；在第30天,差异极显著(P＜0.01).结论 COL1A1基因被干扰后,能够抑制HCT-8细胞增殖,为COL1A1成为癌症治疗的候选基因提供了实验依据.
作者：李鹏；马艳娇；李建华；宫鹏涛；杨举；李赫；欧阳红生；张西臣 刊期： 2012年第04期
目的 构建人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)基因原核表达质粒,表达并纯化带有硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的Trx-Cys C融合蛋白,并制备抗人Trx-Cys C多克隆抗体.方法 在不改变氨基酸序列的前提下,对Cys C的全长编码基因进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化后,人工合成其序列,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+ )-Cys C,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG低温诱导表达.表达的融合蛋白经Ni-Sepharose 6FF纯化后,免疫新西兰大白兔,制备抗人Cys C 多克隆抗体,采用间接ELISA及Western blot进行鉴定.结果 重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确,获得的经同义密码子优化后的序列与预期一致；重组Cys C蛋白获得了可溶性表达,相对分子质量约为35 000,表达量约占菌体总蛋白的50％；纯化的重组蛋白纯度达90％以上,可被Cys C临床检测试剂盒所识别.制备的抗人Cys C多克隆抗体效价达1∶(5.12× 106)以上,并能特异性识别市售Cys C蛋白.结论 已成功原核表达并纯化了可溶性重组Cys C蛋白,并制备了高效价的抗人Cys C多克隆抗体,为进一步建立Cys C免疫学检测方法奠定了基础.
作者：陈特；黄美容；王鹏；刘宇思；王虹；张雪梅；胥文春 刊期： 2012年第04期
目的 制备乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2株(简称SA)和P3株单克隆抗体,并进行初步应用.方法 分别用JEV SA株减毒活疫苗和P3抗原免疫BALB/c小鼠,交叉加强免疫1次,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,选择人血清白蛋白(HSA)抗体阴性、JEV抗体阳性的克隆进行2次亚克隆,制备腹水并纯化,对单抗及杂交瘤细胞进行鉴定.用SA单抗建立捕获ELISA法检测JEV抗体,竞争抑制ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测JEV抗原含量.结果 经3次融合,共获得4株分泌抗JEV SA株单抗和3株分泌抗JEV P3株单抗的杂交瘤细胞株,未获得SA株和P3株共同决定簇的单抗；7株单抗均为IgG1型,特异性良好,但均无中和活性；SA株单抗的相对亲和力大小为:3DI＞ 5E3＞ 6H3＞ 4F12,均能识别SA相同的抗原表位；P3株单抗的相对亲和力大小为:1C7＞ 5H12＞ 3C4,均能识别P3相同的抗原表位；7株杂交瘤细胞于液氮中放置6个月及体外连续培养3个月后,制备的腹水抗体效价保持稳定；用5E3株SA单抗建立了检测JEV抗体的捕获ELISA法及检测JEV抗原的竞争抑制ELISA法和双抗体夹心ELISA法.结论 已制备了JEV SA株和P3株单克隆抗体；以SA株单抗建立的捕获ELISA法检测JEV抗体比间接ELISA法更简便,且敏感性更高,对于抗原浓度高的样品,双抗体夹心ELISA法检测比竞争抑制ELISA法更有优势.
作者：周志军；施金荣；朱华松；王平；余模松 刊期： 2012年第04期
目的 构建细胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达.方法 以pMD19-T simple-Ipr1质粒为模板,采用PCR法扩增Ipr1基因,克隆至表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+ )-Ipr1,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确；表达的重组Ipr1蛋白相对分子质量约为70 000,以1.5 mmol/L IPTG诱导4h,目的蛋白的表达量高,约占菌体总蛋白的16％,重组Ipr1蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了Ipr1基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组Ipr1蛋白,为进一步探讨Ipr1蛋白的功能及Ipr1重组BCG的构建奠定了基础.
作者：余茜；徐蕾；何永林；靳志栋；张丹；杨春 刊期： 2012年第04期
随着扩大免疫规划的执行以及新型疫苗的不断开发和应用,儿童接种疫苗的针次越来越多,这不但增加了儿童接种疫苗的痛苦,也给家长和医务工作者带来诸多不便.因此,开发和应用接种1次能预防多种疾病的联合疫苗是发展的趋势.本文对国内外联合疫苗的新研究进展作一综述.
作者：王丽婵 刊期： 2012年第04期
中国生物制品学杂志
主管:中华人民共和国卫生部
主办：中华预防医学会,长春生物制品研究所有限责任公司
