脑源性神经营养因子(rBDNF)转基因小鼠载体的构建和体外表达

郑小芳；那波宏之；张洪涛

关键词：大鼠脑源性神经营养因子, 条件性基因敲除, 脑, 增强绿色荧光蛋白

摘要：目的构建大鼠脑源性神经营养因子(rBDNF)的条件性转基因小鼠载体,鉴定其在体外细胞系中的表达.方法用PCR方法扩增rBDNF片断,插入pNAO载体(lox-Stop-lox-IRES-EGFP),构建成rBDNF条件性基因载体(lox-Stop-lox-rBDNF-IRES-EGFP),使用Fugene 6转染试剂,将其同Cre重组酶表达质粒pGK-Cre共同导入HEK-293细胞系中,通过荧光显微镜观察、PCR 及ELISA方法确定Cre-lox同源重组. 结果经酶切和测序鉴定,rBDNF条件性基因载体构建成功.共转染后的HEK-293细胞中,观察到绿色荧光蛋白(EGFP)的强荧光表达;细胞基因组DNA中检测到Cre-lox基因重组;对rBDNF定量检测的ELISA结果显示,细胞内有大量的rBDNF释放到细胞外. 结论 rBDNF条件性基因载体构建成功,在体外细胞系中,检测到rBDNF及EGFP强表达,为转基因显微注射打下基础.

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目的研究基质金属蛋白酶抑制剂强力霉素和三七皂甙对大鼠脑栓塞后不同时间尿激酶静脉溶栓效果及并发症的干预作用,评价基质金属蛋白酶抑制剂对尿激酶溶栓治疗时间窗的干预效果.方法采用大鼠自体血栓塞大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,分别用免疫组织化学法、TTC染色、伊文氏蓝法和分光光度计法对基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、脑梗死体积、血脑屏障通透性和脑出血量进行检测. 结果相应时间段尿激酶(UK)溶栓组与缺血对照组比较MMP-9表达显著增高,血脑屏障通透性和脑出血量均有增加趋势,以12h UK组明显;6h UK组较缺血对照组脑梗死体积明显降低.强力霉素和三七皂甙联合尿激酶治疗的各组与相应时间点单用尿激酶组比较MMP-9表达显著降低,脑梗死体积明显下降,血脑屏障通透性和脑出血量均有改善.结论基质金属蛋白酶抑制剂联合溶栓治疗,提高溶栓疗效,减轻溶栓后血脑屏障破坏和出血性转化,可能有延长溶栓治疗时间窗的作用.

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