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德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

赵霞;张仁利;耿艺介;黄达娜;高世同;李晓恒;胡章立

关键词:德国小蠊, 细胞色素P450, 原核表达, 重组CYP4G19蛋白, 多克隆抗体
摘要:目的 构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体.方法 应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western.blot检测多抗的效价及特异性.结果 从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000 Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白.将纯化、复性的重组蛋白免疫 9,得到了滴度高于1:10<'6>的高效价多克隆抗体.Western-blot显示此多抗能与32000 Mr的重组蛋白特异结合.并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白.结论 利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性.制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具.
热带医学杂志相关文献
  • 老年人戊肝临床特点分析

    目的 探讨老年人戊型病毒性肝炎(戊肝)的临床特点.方法 对老年人戊肝60例及非老年人戊肝64例作对照分析,比较两组之间的临床特点.结果 老年戊肝患者组急性黄疸型比率和重型肝炎发病率,重叠感染率,合并基础疾病率,病死率,病程,胆红素水平,并发症(感染,腹水及感性脑病)的发生率均明显高于非老年组;而ALT,胆固醇,白蛋白及凝血酶原活动度要低于非老年组.两组在性别及临床表现上无明显差异.结论 老年人戊肝不少见,病程长,病情重,预后不佳.

    作者:李德昌;彭琳 刊期: 2009年第06期

  • 广州地区ALT不合格献血者再次献血血液筛查结果分析

    目的 探讨ALT筛查在无偿献血血液安全中的作用.方法 采用回顾性调查方法,追踪广州地区2007-2008年ALT单项检测首次不合格的献血者再次献血时的血液筛查结果,并进行比较分析.结果 2007-2008年广州地区9122位ALT单项检测首次不合格的献血者中,1005人(11%)再次来献血,其中,五项传染病指标全部标合格者747人(74.3%),258人(25.7%)不合格,其中ALT单项仍为阳性者240人,为不合格总人数的93%,有18人(7%)献血者传染病指标转为不合格,其中ALT阴性而其他四项指标不合格者15人,ALT合并其他传染病指标不合格者3人.结论 ALT筛杳在一定程度上能够减少肝炎病毒窗口期或隐匿性感染的漏检,在其他更敏感和特异的检测方法引入我国血液筛查之前,ALT筛查对降低输血传染病残留风险仍具有不可忽视的作用.

    作者:戎霞;付涌水;汪传喜;郑优荣;唐钱;滕青 刊期: 2009年第06期

  • 瑞舒伐他汀对大鼠颈动脉球囊损伤后细胞凋亡的影响

    目的 观察瑞舒伐他汀对大鼠颈动脉球囊损伤后细胞凋亡的影响.方法 36只雄性SD大鼠随机分为对照组、损伤组和治疗组,每组12只.损伤组和治疗组分别建立大鼠左侧颈动脉球囊损伤模型,右侧颈动脉未予球囊损伤.治疗组于损伤前3 d始连续每天给予瑞舒伐他汀5 mg/(kg·d)灌胃,对照组和损伤组予9g/L氯化钠溶液灌胃.术后14 d取左侧颈总动脉.进行HE染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素-dUTP缺口标记技术(Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling,TUNEL)的凋亡检测.结果 共30只大鼠成功完成本次实验.①血管损伤14 d,可见明显的新生内膜:损伤组和治疗组的内膜面积、内膜/中膜面积的比值较对照组增大(P<0.05);与损伤组比较,治疗组内膜/中膜面积的比值减少,管腔面积增加26%(P<0.05).②对照组血管偶可见单个散在的凋亡细胞;损伤组凋亡细胞阳性率为(12.3±1.8)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);治疗组凋亡细胞数目增多,凋亡细胞阳性率达(26.8±3.2)%,与损伤组比较,差异有统计学意义(P<0.05).凋亡细胞主要位于新生内膜.结论 瑞舒伐他汀可抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的内膜增生,可促进大鼠颈动脉球囊损伤后的细胞凋亡.瑞舒伐他汀促进细胞凋亡的作用可能与其抑制内膜增生有关.

    作者:曾春苗;董少红;刘华东;李鹏 刊期: 2009年第06期

  • 深圳市龙岗区患者痰培养细菌菌谱和耐药性研究

    目的 研究深圳市龙岗区患者痰培养细菌菌谱和耐药性,为临床合理应用抗菌药物提供依据.方法 对来自深圳市龙岗区4间医院2007年1月至2008年6月患者合格痰标本中培养的细菌药敏试验进行回顾性分析.结果 727株细菌中,革兰阴性杆菌595株,占81.8%,以鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌为主;革兰阳性球菌132株,占18.2%.以凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌为主,而且凝固酶阴性葡萄球菌株数超过金黄色葡萄球菌.药敏结果提示革兰阴性杆菌及革兰阳性球菌对相当多数的抗生素耐药率较高.结论 深圳市龙岗区患者痰培养细菌耐药情况较严重,条件致病菌菌株数比例较高.应加强药物尤其是抗菌药物的使用管理,规范应用抗生素.

    作者:岑慧;杨兵;张旭;聂郁林;郭文哲 刊期: 2009年第06期

  • 骨灵汤对绝经期前后骨质疏松患者血清IGF-1、TGFβ1与OPG/RANKL水平的影响

    目的 观察绝经期前后骨质疏松(osteoporosis,OP)患者血清胰岛素样生长因子(IGF-1)、转化生长因子(TGFβ1)与OPG-RANKL系统的关系以及骨灵汤对IGF-1和TGFβ1表达的影响.方法 将80例OP患者分为绝经前组和绝经后组.每组各40例,均给予抗OP中药骨灵汤(骨碎补、鹿角胶、菟丝子等)治疗.采用ELISA方法检测血清TGFβ1、OPG和RANKL.采用包被放免法(IRMA)检测血清IGF-1.结果 绝经后组血清IGF和RANKL的水平显著低于绝经前组(P<0.01),绝经后组血清OPG水平显著高于绝经前组(P<0.01);血清IGF-1、TGFβ1浓度与血清OPG浓度呈负相关.相关系数为r=0.003、P=-0.622和r=0.000、P=-0.713;血清IGF-1、TGFβ1浓度与血清RANKL浓度呈正相关.相关系数为r=0.012、P=0.549和r=0.001、P=0.667:绝经前妇女骨灵汤治疗后,血清IGF和TGFβ水平升高(P<0.05),OPG水平明显升高(P<0.01).RANKL浓度下降(P<0.05);绝经后妇女骨灵汤治疗后IGF、TGFβ和OPG水平升高(P<0.05),RANKL浓度下降(P<0.05).结论 骨灵汤可以通过上调IGF-1和TGFβ1的表达,影响OPG-RANKL系统,从而调节骨代谢,达到防治OP的目的 .

    作者:钱杨佩娟;庞捷;李娟 刊期: 2009年第06期

  • PDGF、FN诱导FHL1细胞增殖的P13K信号转导通路研究

    目的 探讨血小板源性生长因子(PDGF)和纤维连接蛋白(FN)诱导人胚胎肺成纤维细胞(HFL1)增殖的磷酸酰基醇-3-激酶(P13K)信号转导通路.方法 采用不同浓度的PDGF和FN分别刺激HFL1并观察P13K抑制剂wortmannin(WMN)对PDGF、FN诱导HFL1增殖作用的影响.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖情况.结果 PDGF和FN对HFL1的诱导增殖作用明显,并呈剂量依赖性升高趋势,二者均在50 ng/mL时作用显著;P13K抑制剂wortmannin可抑制PDGF和FN诱导的HFL1细胞增殖.结论 PDGF和FN诱导HFL1的细胞增殖可以通过P13K信号转导途径实现.

    作者:马跃文;柏广涛;张美侠 刊期: 2009年第06期

  • HE4基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞HO8910生长侵袭的影响

    目的 探讨卵巢癌基因HE4对卵巢癌细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 构建针对HE4基因的PcDNA3.1/HFA载体,脂质体法介导PcDNA3.1/HE4载体转染人浆液性卵巢癌细胞系HO8910,WESTERN-BLOT检测转染前后细胞内HE4蛋白的表达效果.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆形成实验观察HE4基因对细胞增殖能力的影响,经细胞粘附实验、体外侵袭力实验比较转染前后细胞侵袭能力的变化.结果 Western-blot结果显示PcDNA3.1/HFA载体成功转染HO8910细胞并显著提高该细胞HE4基因的表达,细胞增殖能力较前无明显变化,侵袭能力明显下降.结论 通过增强HEA基因表达,可降低其侵袭能力,有望成为卵巢癌基因治疗的新的候选基因.

    作者:陈瑶;牟霞;王穗海;杜红延;吴英松;李明 刊期: 2009年第06期

  • 广州市超市自制食品卫生状况调查与分析

    目的 了解目前广州市不同规模超市自制食品的卫生状况.方法 采用分层抽样的方法,抽取大型超市18间、中型超市4间、小型超市14间作为调查对象.采用现场监督检查、询问和填写调查表的方法进行调查.结果 对不同规模超市生熟交叉污染、预进间的设置、空气消毒设备和空调设置等方面进行了比较,大型、中型超市成品区域的设施方面都比小型超市成品区域设施规范,差异均有统计学意义(P<0.05).超市中自制食品存在安全隐患,尤以小型超市为甚.结论 应重点加强对小型超市自制食品卫生状况的监管.

    作者:黄亮宇;许晓晖;许斌 刊期: 2009年第06期

  • 血浆对臭氧在水介质中杀菌效果影响的研究

    目的 探索血浆对臭氧在水介质中杀菌作用的干扰效应,为医用臭氧对腹水等体液中细菌杀灭作用研究摸索臭氧作用的浓度及时间参数.方法 在含不同浓度血浆的生理盐水中加人大肠埃希菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923),悬液定量法计算高浓度臭氧(90 μg/mL)对其杀菌率;臭氧作用于含10.0%血浆的生理盐水,摸索臭氧有效杀菌的浓度和作用时间参数.结果 臭氧杀菌效果随生理盐水中血浆浓度的提高而降低,血浆含量大于10.0%后杀菌效果显著降低(P<0.05),90μg/mL臭氧作用20 min(流速12 ml/min)对含10.0%血浆的生理盐水中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌杀菌率可分别达到100%、99.05%.不同浓度组(40 μg/mL、60 μg/mL、90μg/mL)的臭氧杀菌效果有显著性差异(P<0.05),臭氧作用不同时间(5 min、10min、20 min)杀菌效果亦有显著性差异(P<0.05),以浓度为90 μg/mL臭氧作用20 min杀菌效果好.结论 血浆可干扰臭氧在生理盐水中的杀菌作用,血浆含量在10.0%以下时影响作用较小,提高臭氧浓度、延长作用时间可提高杀菌率.

    作者:孙婧;骆训武;张亚莉;万铁林;张明霞;郭亚兵 刊期: 2009年第06期

  • 脑寄生虫病的影像学表现

    脑寄生虫病临床表现复杂多样,病原学诊断困难,影像学检查对诊断可提供重要的辅助作用.本文通过对目前常见的几种脑部寄生虫病的影像学表现要点作一总结,为脑寄生虫病的鉴别与正确诊断提供有效的资料.

    作者:顾福祥;顾金保;陈晓光 刊期: 2009年第06期

  • 2123例男性泌尿生殖道标本的病原学分析

    目的 了解男性泌尿生殖道感染的病原学分布,为男性泌尿生殖道感染的预防和治疗提供可靠依据.方法 对2123例男性泌尿生殖道标本的微生物学检验进行回顾性分析.结果 2123例男性泌尿生殖道标本中共检出病原菌1082株,检出率为50.96%,其中解脲支原体检出率高,为24.30%;所有送检标本中,尿道拭子标本的病原菌检出率高,为60.09%,混合感染率为12.74%;精液标本中无乳链球菌检出率明显高于前列腺液(P<0.05).结论 解脲支原体是男性泌尿生殖道感染的主要病原菌;男性泌尿道标本的病原学检查以尿道拭子为宜;男性不孕是否与无乳链球菌的感染有关还有待进一步研究.

    作者:汤学夫;张水兰;何琴;蔡毅华 刊期: 2009年第06期

  • 日本血吸虫紫外线致弱尾蚴免疫小鼠攻击感染后的组织细胞反应

    目的 观察日本血吸虫紫外线致弱尾蚴疫苗(UVC)免疫动物攻击感染后的局部组织免疫病理变化.方法 将70只C57BL/6小鼠随机分为疫苗免疫组和感染对照组.疫苗组小鼠接种紫外线致弱日本血吸虫尾蚴后5周,再经腹部皮肤攻击感染正常日本血吸虫尾蚴(800±50)条;感染对照组经皮肤感染同量尾蚴.于攻击感染后6~120 h的不同时间点各剖杀小鼠5只,取攻击部位皮肤及/或肺组织,进行病理学观察.结果 UVC疫苗免疫小鼠攻击感染日本血吸虫尾蚴后,皮肤炎症反应较感染对照出现早、反应强烈、持续时间长,EOS百分比高,但肺部出血斑点出现时间(72 h)迟于感染对照组(48 h).72~120 h,疫苗组小鼠肺部局灶性炎症明显,肉芽肿样结节形成,肺泡壁多正常.而感染对照组小鼠肺组织炎症轻,但肺泡壁水肿明显,且有较多红细胞渗出.结论 紫外线致弱尾蚴疫苗免疫增强了小鼠皮肤及肺组织的细胞反应及其杀虫作用.

    作者:陈家旭;刘述先;曹建平;徐裕信;宋光承;郭俭 刊期: 2009年第06期

  • 建立快速检测淋巴细胞内磷酸化信号传导及转录激活子的方法

    目的 建立淋巴细胞内磷酸化信号传导及转录激活子(STAT)的快速检测方法.方法 人单个核细胞或外周静脉血淋巴细胞用IL-6、IL-4和IFN-α1体外刺激15 min,运用流式细胞术检测胞内STAT3(pY705)、STAT6(pY641)和STAT1(pY701)磷酸化水平,并比较不同破膜剂对它的影响.结果 与0.2%皂素、90%甲醇比较,Purm buffer Ⅲ破膜剂破膜后,能够显著地提高淋巴细胞内STAT3的磷酸化水平(P<0.01).结论 经Perm buffer Ⅲ破膜后,运用流式细胞术可快速检测磷酸化STAT3、STAT6和STAT1.

    作者:莫建福;罗宇维;孙尔维 刊期: 2009年第06期

  • 揭阳市2004-2008年乙型肝炎流行特征

    目的 了解揭阳市乙型肝炎(简称乙肝)的发病情况,为制订有效的防制措施提供科学依据.方法 从<中国疾病预防控制信息系统>中导出数据库,用SPSS13.0的χ2检验进行数据处理,采用描述性流行病学方法对揭阳市2004-2008年乙肝疫情和流行特征进行分析.结果 揭阳市2004-2008年共报告乙肝病例3680例,年均发病率为12.54/10万,发病无明显季节性,病例主要集中于20~59岁的青壮年,占总报告数的76.74%,男性发病率明显高于女性(χ2=657.92,P=0.0047),各县区发病率无明显差别(χ2=0.86845,P=0.9290),职业以农民、家务及待业为主,两者占总数的56.79%.结论 揭阳市乙肝发病率低于全省的平均水平,但近年有上升趋势,应继续采取以免疫接种提高易感人群免疫力为主的综合防制措施,在做好儿童常规乙肝疫苗接种的同时,提高其他易感人群的乙肝疫苗接种率.

    作者:林伟波;李惠莲;邱志远 刊期: 2009年第06期

  • 脂蛋白和C反应蛋白对单核细胞趋化蛋白-1的影响

    目的 探讨单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及其受体趋化因子受体2(CCR-2)经动脉粥样硬化相关因素刺激后表达量的变化情况.方法 密度梯度离心法从健康成人外周血中分离获得单个核细胞,体外培养48 h.给予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、C反应蛋白(CRP)及高密度脂蛋白(HDL)进行干预.干预后用实时荧光定量RT-PCR技术检测单核细胞MCP-1 mRNA和CCR2 mRNA的含量,ELISA法检测MCP-1蛋白含量.结果 ox-LDL+CRP组、ox-LDL、CRP处理组MCP-1和CCR2 mRNA表达水平和MCP-1蛋白含量明显高于对照组(P<0.05).而经HDL处理的单核细胞表达MCP-1和CCR2 mRNA水平下调,MCP-1蛋白含量低于对照组(P<0.05).结论 在体外培养的条件下.CRP和ox-LDL可以促进MCP-1和CCR2 mRNA表达,继而导致MCP-1含量增加,增强炎症反应的范围和强度.HDL可以有效的抑制MCP-1的表达.

    作者:何非;陈爱华;宋旭东;张琼 刊期: 2009年第06期

  • 保留肾单位手术治疗肾血管平滑肌脂肪瘤的疗效观察

    目的 探讨保留肾单位手术(NSS)治疗肾血管平滑肌脂肪瘤(RAML)的安全性及有效性.方法 对56例采用NSS治疗的RAML患者的临床资料回顾性分析,其中肿瘤剜除术35例,肾部分切除21例,4例患者术前行选择性肾动脉栓塞术.结果 术中切除肿瘤平均直径(5.6±2.7)cm,术中平均失血量(140±75)ml,术后无大出血、尿瘘.51例患者获得随访,平均随访36月(6~120月),术后肾功能相对稳定,未见肿瘤复发.结论 保留肾单位手术是治疗RAML的较好方法,有效地控制出血和保护肾脏功能是手术成功的关键.

    作者:余新立;廖勇彬;庞健;陈立新;黄晓生;吴荣海;程洲平;黄黎明;林绮平;孙明 刊期: 2009年第06期

  • C反应蛋白与酶修饰低密度脂蛋白对树突状细胞成熟的影响

    目的 探讨在动脉粥样斑块硬化进程中C反应蛋白(CRP)和酶修饰低密度脂蛋白(E-LDL)对外周血中树突状细胞(DC)分化成熟的影响.方法 梯度离心法分离人外周血单核细胞,用含rhGM-CSF和rhIL-4的Cellgro培养液培养5 d,使其分化为DC.分别用CRP、E-LDL及CRP加E-LDL刺激DC 48 h后,采用流式细胞术检测DC表型(CD1a、CD80、CD86、HLA-DR)的表达,ELISA法检测DC上清液中IL-12、TNFα、IL-2和IL-10的含量,并进行比较.结果 CRP抑制DC的CD1a、CD80表达及IL-12、TNFα分泌,E-LDL促进DC的CD1a、CD80、CD86和HLA-DR表达及IL-12、TNFα分泌,CPR加E-LDL结果与E-LDL类似.结论 CRP抑制DC的活化,E-LDL可促进DC的分化成熟,E-LDL激活DC的作用强于CRP的抑制作用.

    作者:何威;陈爱华;宋旭东 刊期: 2009年第06期

  • 德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

    目的 构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体.方法 应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western.blot检测多抗的效价及特异性.结果 从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000 Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白.将纯化、复性的重组蛋白免疫 9,得到了滴度高于1:10<'6>的高效价多克隆抗体.Western-blot显示此多抗能与32000 Mr的重组蛋白特异结合.并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白.结论 利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性.制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具.

    作者:赵霞;张仁利;耿艺介;黄达娜;高世同;李晓恒;胡章立 刊期: 2009年第06期

  • 巫溪县燃煤型氟中毒防治现状

    目的 了解巫溪县燃煤型氟中毒病情和防治措施落实进度及发展趋势,为制定防治燃煤型氟中毒措施提供依据.方法 运用Dean's法检查该县所有病区村8~12岁儿童氟斑牙(GB16396-1996)和检查16岁以上成人氟骨症(WS192-1999),计算氟斑牙检出率和成人氟骨症检出率.调查2005-2008年中央转移支付地方公共卫生地氟病防治项目改炉改灶现状,计算炉灶改造率、改炉改灶合格率、改炉改灶正确使用率.2005-2008年在改炉改灶前后分别检测儿童尿氟,计算几何均数.结果 儿童氟斑牙检出率为46.21%,成人氟骨症检出率为0,炉灶改造率为59.52%,合格率为97.16%,正确使用率为97.76%,尿氟几何均数改炉改灶前后均呈下降趋势.结论 巫溪县燃煤型氟中毒病区呈轻微流行,2005-2008年结合中央转移支付地方公共卫生地氟病防治项目进行了大规模的改炉改灶工作,要达到国家75%的目标还需改炉改灶3600余户.

    作者:何伟;廖映旭;晏维 刊期: 2009年第06期

  • 奉节县2004-2008年居民户碘盐监测结果分析

    目的 全面、准确地掌握奉节县居民食用合格碘盐的情况,确保碘缺乏病防治措施的有效实施,为持续消除碘缺乏病工作提供科学依据.方法 按照<重庆市碘盐监测方案>规定的抽样方法及盐碘测定方法对居民户食用盐进行监测.结果 2004-2008年监测居民户家庭食用盐每年360份,共1800份,碘含量均数为30.75 mg/kg.变异系数为21.06,年份间碘含量差异有统计学意义(F=13.755,P<0.05),呈明显线性下降趋势(R=0.12,P<0.05);碘盐覆盖率为99.39%,碘盐合格率为94.69%,合格碘盐食用率为94.11%,非碘盐率为0.61%,年份间差异均无统计学意义(P>0.05).结论 奉节县实现基本消除碘缺乏病阶段目标后,居民合格碘盐食用率保持在90%以上,成果巩固.各级政府应持续重视.完善监督监测机制,确保碘盐质量,以实现消除碘缺乏病的目标.

    作者:雷兵;刘学刚;廖和平 刊期: 2009年第06期

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主管:广东省科学技术协会

主办:广东省寄生虫学会 中华预防医学会