张衍国；付萌；刘玉峰；高天文；潘蕾；王琳
目的: 构建蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease, TR)融合蛋白的原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达. 方法: 将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV core protein, HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin, hEDN)基因, 克隆入含PTD TAT的pTAT原核表达载体, 在大肠杆菌BL21(DE3)LysS 内, 以IPTG诱导融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定.结果: 成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体, 并在IPTG诱导下获得特异性表达. 结论: Tat-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建, 为体内应用靶向核酸酶治疗乙型肝炎奠定了基础.
作者：丁劲；刘军；薛采芳；李英辉；宫卫东 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨子宫内膜癌组织中热休克蛋白(HSP)70、90的表达及意义. 方法: 用免疫组化Envision法及图象分析仪, 检测30例正常子宫内膜、30例增生过长子宫内膜和53例子宫内膜癌中HSP70、HSP90的表达. 结果: 子宫内膜癌中HSP70表达的灰度值为(209.06±5.36), 明显高于正常内膜[(145.21±4.09), P<0.01]和增生过长内膜[(148.59±4.23), P<0.01]; 子宫内膜癌中HSP90表达的灰度值为(166.98±5.71), 明显低于正常子宫内膜[(208.57±31.14), P<0.05]和增生过长子宫内膜[(249.73±4.94), P<0.01].子宫内膜癌中HSP70的表达随肿瘤病理分级的增加而增强(P<0.01), 非内膜样癌(229.90±3.77)较内膜样癌表达强[(198.37±3.15), P<0.01]; 子宫内膜癌中HSP90表达随肿瘤病理分级的升高而表达减弱, 非内膜样癌(140.21±3.22)较内膜样癌表达减弱[(176.59±2.79), P<0.01].子宫内膜癌中HSP70、90的表达与肌层浸润深度、临床分期及淋巴结转移未见显著相关性(P>0.05).结论: HSP70、 90可能与子宫内膜癌的发生及预后有关.
作者：白晓霞；陈亚琼；辛晓燕；王文栋 刊期： 2003年第01期
目的: 获得具有生物学活性的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)模拟肽.方法: 以噬菌体扩增及PEG沉淀法, 大量制备展示十二肽P1、P2的噬菌体.采用ELISA、竞争抑制试验及免疫组化染色法, 分别鉴定P1、P2模拟ICAM-1分子的结合特性及生物学活性.结果: 噬菌体展示肽P1、P2能与抗ICAM-1单克隆抗体(mAb)15.2特异性结合.该结合作用可被ICAM-1分子竞争性抑制, P1、P2能模拟ICAM-1分子与LFA-1结合的功能.结论: 噬菌体展示的短肽P1、P2具有天然ICAM-1的生物学活性.
作者：郝文波；徐伟文；陈白虹；王萍；董文其；李明 刊期： 2003年第01期
目的: 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达载体, 并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达.方法: 利用基因克隆技术, 将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamH I和Xho I双酶切后, 再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中, 构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导, 用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞, 然后以G418筛选阳性克隆, 用免疫细胞化学鉴定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实, 重组体中已插入目的基因片段VEGF165.免疫细胞化学证实, 重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达.结论: 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165, 并在骨髓基质细胞中得到表达, 为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据.
作者：高全文；董绍忠；陈希哲；陈琰；杨连甲 刊期： 2003年第01期
目的: 观察人截短型AIF基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用.方法: 用RT-PCR法分段克隆全长人AIF基因.经改造截去其N-端线粒体定位信号及部分Spacer区域(1～120位氨基酸)的编码序列, 从而获得人截短型AIF(AIF△1-120)基因.将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体, 用脂质体法转染HeLa细胞, 通过荧光显微镜观察、免疫组织化学检测、间接免疫荧光检测、电镜观察等方法, 检测目的基因在转染细胞中的表达, 以及对转染细胞的形态及生长状况的影响.结果: 成功地构建了人截短型AIF(AIF△1-120)基因的真核表达载体.转染HeLa细胞后, 可检测到人截短型AIF分子的表达.随着转染后时间的延长, 可观察到表达人截短型AIF分子的HeLa细胞呈现典型的凋亡特征.结论: 人截短型AIF基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡.
作者：于翠娟；孟艳玲；赵晶；王智；王成济；杨安钢 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨肺泡巨噬细胞(AM)中STAT1(signal transducers and activators of transcription 1)的活化在大鼠肺间质纤维化中的作用.方法: 50只健康雌性Wistar大鼠随机分成博莱霉素(BLM)组和生理盐水(NS)组各25只, 气管内分别灌注BLM和NS.用Western-blot法测定AM中STAT1活化的动态变化; 用免疫组化染色法测定AM的ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)的表达.结果: NS组中的AM内只有少许STAT1活化, 气管内灌注BLM后1 d, AM中STAT1的活化即开始显著增高, 于第7 天达高峰, 以后逐渐下降, 但28 d后仍高于NS组(P<0.05).NS与BLM组的AM中表达ICAM-1的细胞数增高的模式, 与AM中STAT1活化的模式相同.AM中STAT1活化的程度与AM中ICAM-1的表达呈正相关(r=0.913, P<0.01), 而后者又与肺组织炎症的积分呈正相关(r=0.947, P<0.01).结论: 实验性肺间质纤维化大鼠AM中存在STAT1的异常活化, 并参与了肺泡炎和肺纤维化的形成.
作者：范贤明；王曾礼；李振华 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨钙离子载体(calcium ionophore, CI)对外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的影响.方法: 分离健康献血者外周血单核细胞, 分别加入重组人粒/单集落刺激因子(rhGM-CSF) 100 μg/L、rhGM-CSF 100 μg/L+CI 10 μg/L及rhGM-CSF+CI 各100 μg/L.体外培养40 h后, 于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志, MTT比色法检测上述分子对自体T细胞的刺激增殖作用.结果: 外周血单核细胞在GM-CSF+CI 各100 μg/L的条件下培养40 h, 就可看到典型的DC形态, 其表面CD14分子表达减少, HLA-DR、CD40、CD83及CD86分子的表达明显增高, 且具有明显刺激自体T细胞增殖的能力.结论: CI有显著加速GM-CSF诱导的外周血单核细胞向DC转化的作用.
作者：吴军；王晓怀；王捷；杨太成；赖晃文；郑文岭 刊期： 2003年第01期
目的: 研究新城疫病毒(NDV)对肿瘤细胞的作用.方法: 采用空斑试验观察NDV对鸡胚成纤维细胞(CEF)的作用, 通过细胞抑制试验、琼脂糖凝胶电泳、TUNEL染色、细胞骨架染色及细胞唾液酸含量测定等,观察NDV对肿瘤细胞的影响.结果: NDV对CEF、HeLa及Hep-2等肿瘤细胞可产生明显的病变, 而对人的羊膜细胞(Wish细胞)无明显影响; 对Hela细胞和Hep-2细胞能产生明显的生长抑制作用, 但无量效依赖关系. NDV还可导致以凋亡为主的细胞死亡, 引起Hela细胞和Hep-2细胞的细胞骨架发生改变, 以及去除肿瘤细胞表面唾液酸的作用.结论: NDV能选择性地作用于人肿瘤细胞, 抑制肿瘤细胞的生长, 导致肿瘤细胞发生凋亡, 有望成为一种有效的抗肿瘤生物制剂.
作者：薛立娟；金宁一；龚伟；王宏伟；孙大辉；罗琴芳；葛涛；李萍 刊期： 2003年第01期
目的: 提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体在二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞株(CHO/DHFR )中表达的产量.方法: 对表达载体中DHFR基因表达调控序列进行一系列的删除突变和点突变后, 构建不同的嵌合抗体表达载体.用这些载体转染CHO细胞并以递增量的氨甲喋呤(MTX)筛选, 用ELISA法测定每个加压水平的各组细胞中抗体的表达水平.结果: 通过对表达载体中DHFR基因表达调控序列的突变, 使DHFR的基础表达水平产生了不同程度的弱化.转染CHO细胞后, 可明显提高MTX加压增加抗体表达的效果, 抗体表达水平的增加基本与DHFR基因的弱化程度呈正相关.从弱化程度高的pWS2-BDI组中, 我们筛选得到表达量达55 μg/(106细胞*24 h)的高表达细胞株, 经锌离子进一步诱导后, 表达量可达100 μg/(106细胞*24 h)以上.结论: 弱化表达载体中DHFR的表达, 可提高MTX对工程抗体表达的增加效果.
作者：白银；王琰；张海荣；周丽君；吕英谦；俞莉章 刊期： 2003年第01期
目的: 研究通痹灵(TBL)总碱对活化的小鼠T淋巴细胞表达CD69的影响及其可能的免疫调控机制.方法: 培养小鼠淋巴细胞, 加入不同浓度的TBL总碱预孵1h后, 再加佛波醇酯(PDB)或刀豆蛋白(ConA), 24 h后, 用流式细胞术检测T淋巴细胞CD69的表达率.结果: 不同质量浓度的TBL总碱对PDB或ConA激活的T淋巴细胞表达CD69, 均有明显的下调作用(对ConA激活的T淋巴细胞的作用要强于PDB激活的T淋巴细胞), 呈明显的量效关系.结论: TBL总碱可明显抑制活化的小鼠T淋巴细胞CD69的表达, 为其用于类风湿性关节炎的治疗提供了实验依据.
作者：陈纪藩；陈光星；李晓娟；全世明；曾耀英；胡英杰；黄可儿；刘晓玲 刊期： 2003年第01期
目的: 研究新型的特异性类胰蛋白酶抑制剂双苯甲脒, 对肥大细胞稳定性的影响.方法: 扁桃体组织经酶消化后, 将细胞成分用全HEPES缓冲盐溶液(HBSS)重新悬浮.肥大细胞激发和抑制剂作用的试验在试管中37℃条件下完成.类胰蛋白酶水平用ELISA法测定.结果: 同时加入扁桃体细胞悬液中的双苯甲脒, 可以剂量依赖的方式抑制抗IgE诱导的类胰蛋白酶释放.仅1 mg/L(1.54 μmol/L)的双苯甲脒, 即可抑制肥大细胞释放类胰蛋白酶达52%, 10 mg/L则能抑制76%的释放.将预培养时间延长30 min, 对双苯甲脒的抑制作用无明显影响.在培养到45 min时, 双苯甲脒可抑制高达47%的基础类胰蛋白酶释放.与细胞培养15 min后, 抗IgE抗体(1 g/L)或钙离子导入剂(CI, 1 μmol/L)引起的类胰蛋白酶释放的量, 分别为基础分泌量的3.2和2.6倍.但是, 当细胞与全HBSS预培养超过10 min后, 肥大细胞对抗IgE抗体或CI的反应性明显降低.结论: 双苯甲脒能够抑制人类扁桃体肥大细胞的IgE依赖性类胰蛋白酶释放.因此, 有望开发成为一种新型的肥大细胞稳定剂.
作者：谢华；何韶衡 刊期： 2003年第01期
目的: 通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体, 研究其生物学活性, 并用于基因治疗诱导心脏移植耐受.方法: 通过基因重组技术, 将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中. 然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组, 经过293细胞包装, 构建CTLA4Ig腺病毒载体.用RT-PCR、SDS-PAGE及Western blot等技术, 检测包装的病毒感染293细胞后CTLA4Ig蛋白的表达及分泌, 通过体外实验, 观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应( MLR)的抑制作用.通过大鼠体内实验, 检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后, CTLA4Ig在体内的表达.结果: CTLA4Ig腺病毒载体构建成功.体外实验证实, CTLA4Ig腺病毒感染的293细胞上清液, 能够抑制异基因脾细胞的单向MLR.体内实验表明, 经过静脉途径给予受体大鼠CTLA4Ig腺病毒载体, 能够诱导移植耐受, 延长心脏移植物的存活.结论: 构建的CTLA4Ig腺病毒载体, 体外感染293细胞能够分泌CTLA4Ig蛋白.该蛋白可抑制T细胞的活化, CTLA4Ig腺病毒载体可用于体内基因治疗诱导移植耐受.
作者：张庆殷；金永柱；张海滨；谢蜀生 刊期： 2003年第01期
目的: 纯化可刺激人γδ+ T细胞增殖的结核杆菌耐热多肽抗原.方法: 采用快速蛋白液相色谱仪(FPLC)S-100分子筛层析柱, 对结核杆菌耐热抗原(Mtb-Ag)初步分离.将获得的结核杆菌耐热Mr低的多肽抗原(Mtb-LW-Ag)洗脱峰, 分别再经FPLC Mono Q离子交换层析柱进一步纯化, 并且采用流式细胞仪对获得的Mtb-LW-Ag进行刺激γδ+ T细胞增殖活性的测定.结果: Mtb-Ag经FPLC S-100柱可分离出1个大分子蛋白峰A和3个Mr低的多肽峰(B, C, D).Mr低的多肽峰分别经Mono Q柱层析, 鉴定出B峰含有6个主峰, C峰含有1个主峰, D峰含有8个主峰. 对Mtb-LW-Ag及其纯化多肽进行活性检测, 发现多肽峰B和C以及纯化多肽B-Ⅲ和C-主肽均可显著刺激γδ+ T细胞扩增.结论: 利用FPLC法可快速高效地从Mtb-Ag中纯化出多种Mr低的多肽, 而且其中的B-Ⅲ多肽和C-主肽可能是促进γδ+ T细胞活化增殖的主要多肽.
作者：陈勇；吕合作；胡建国；候彦强；何海辉；张海峰；李柏青 刊期： 2003年第01期
目的: 探索利用DNA改组(DNA shuffling)技术, 获得更高活性tPA的可能性.方法: 以人、恒河猴及大白鼠tPA cDNA为一组基因, 进行tPA的DNA改组 (DNA family shuffling).以改组后构建的tPA多样性文库转染CHO细胞并进行克隆和筛选.结果: 得到了两株有意义的克隆:t9和t17, 其中t9克隆表达的tPA活性略高于人tPA, 初步的比活性测定结果表明, 活性约提高4倍.t17克隆表达的tPA虽然有88个氨基酸的缺失, 但仍表现出与人tPA相同的活性.两株克隆经测序证明, 为改组后的基因, 其序列以人和恒河猴的tPA cDNA序列为主, 少数序列来源于大白鼠tPA cDNA.结论: 这一探索性结果将为后续几轮的tPA DNA改组探明道路, 为终从改组后tPA多样性基因库中筛选到比较理想的重组体打下基础.
作者：黄庆生；徐静；徐俊杰；童贻刚；王海涛 刊期： 2003年第01期
目的: 分析anti-TCRαβ mAb、anti-TCRαβ mAb+anti-CD28 mAb诱导小鼠胸腺淋巴细胞不同亚群的凋亡及凋亡程度, 分析CD28协同刺激分子对TCR受体介导的胸腺细胞亚群凋亡的影响.方法: 新鲜分离胸腺细胞, 加入anti-TCRαβ mAb、 anti-TCRαβ mAb+anti-CD28 mAb等培养20 h, 进行多重染色, 流式细胞仪分析.结果: 与胸腺细胞自发凋亡的结果相比较: ①双信号刺激可明显增加胸腺细胞凋亡的数目, 尤其是CD4+CD8+胸腺细胞的凋亡数目.②凋亡的CD4+CD8+亚群、CD4+CD8 亚群细胞表面CD28的表达均增多.结论: CD28共刺激分子对TCR受体介导的胸腺细胞亚群凋亡的影响与细胞的成熟程度有关.CD28共刺激分子能明显增强不成熟皮质胸腺细胞的凋亡.
作者：李红梅；张华刚；王宏程；钱晓萍；孔宪涛；陈慰峰 刊期： 2003年第01期
目的: 研究口腔颌面部恶性肿瘤细胞系内源性PTEN蛋白的表达, 比较高转移性癌细胞系与亲本细胞PTEN蛋白表达的差异.方法: 应用ABC免疫组化染色法, 检测8例癌细胞系PTEN蛋白的表达, 包括舌癌细胞系Tca8113和HSC-3、口底癌细胞系 HSC-2、颊癌细胞系BcaCD885、粘液表皮样癌细胞系MEC-1、腺样囊性癌细胞系SACC83以及高转移性舌癌细胞系Tb-TLP和高转移性粘液表皮样癌细胞系M3SP2.结果: 5/8例癌细胞系PTEN蛋白的表达呈阳性, PTEN蛋白定位于靠近细胞核周围的细胞质中.3/8例癌细胞系PTEN蛋白的表达呈阴性, 即BcaCD885细胞及高转移性Tb-TLP和M3SP2细胞.结论: PTEN蛋白表达缺失与癌细胞转移可能有一定的关系.
作者：刘斌；吴军正；段小红；李洁；李焰 刊期： 2003年第01期
目的: 研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用.方法: 以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠. 免疫完成6 wk后, 用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染. 同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞, 并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠, 立即用105 CFU 的MTB 毒株经小鼠尾静脉攻击感染.4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷.结果: 与生理盐水对照组相比较, pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少, 分别为0.645(log10CFU, P<0.01)和0.839(log10CFU, P<0.001); 而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少.经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞, 过继免疫的正常BALB/c小鼠, 对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用.结论: pTB30s免疫的BALB/c小鼠, 对MTB H37Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫, 有望进一步用于结核病的防治研究.
作者：范雄林；徐志凯；李元；李别虎；薛莹；柏银兰；白光春；贾向志 刊期： 2003年第01期
目的: 制备抗人层黏连蛋白(laminin, LN)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性. 方法: 以人LN免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗人的mAb; 同时采用间接ELISA法检测mAb的腹水效价及mAb的相对亲和力; 采用ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、进行表位分析及特异性鉴定.结果: 获得4株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞2A3、2C6、3G7和4H2, 其腹水mAb的效价为3.6×104～2.1×106; 4株mAb的Ig亚类为IgG1, 轻链均属κ型; 相对亲和力2C6在1012以上, 2A3、3G7和4H2在106以上; 其中2株与1个表位结合, 另2株与另外的1个表位结合. 结论: 成功地制备出抗人LN的mAb, 为进一步研究LN在一些疾病中的作用提供了工具.
作者：姚敏捷；黄汉朝；攸连秀 刊期： 2003年第01期
人白细胞分化抗原(human leukocyte differentiation antigen, HLDA)及其单克隆抗体在免疫学研究中发挥着日益重要的作用.随着人类基因组计划的完成和细胞膜表面分子功能研究的深入, 不断有新的功能重要的白细胞分化抗原被发现.
作者：金伯泉；刘飞 刊期： 2003年第01期
目的: 用生物工程技术制备人源性抗-HBs Fab.方法: 将从抗体文库中筛选出的人源抗-HBs Fab基因克隆入pBAD/g ⅢA载体, 进而转化Top10大肠杆菌.对重组质粒菌发酵表达后, 利用Ni-NTA-Agarose螯合层析柱纯化周质腔可溶性Fab蛋白.对所得包涵体依次变性、溶解、纯化后, 利用透析进行复性.用Western blot检测Fab蛋白的特异性, Dot blot测定其生物学活性.结果: 经Ni-NTA-Agarose柱纯化的周质腔可溶性Fab蛋白, 有较好的生物学活性, 并且总量达到80 mg/L.对所获包涵体进行透析复性后, 也可得到少量有活性的蛋白, 但比例很小.结论: 用pBAD/g ⅢA-Top10表达系统表达人源抗-HBs Fab片段, 发酵培养后, 经有效纯化可得到生物学活性较好的可溶性蛋白, 为人源抗-HBs Fab片段的大量制备提供了有效手段.
作者：安峰；陈玉川；陆慧琦；韩焕兴 刊期： 2003年第01期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
