金伯泉；刘飞
鼠源性单克隆抗体(mAb)应用于人体治疗首先需对其进行基因工程化改造.目前, 常用的克隆mAb可变区基因的方法, 是利用抗体可变区内骨架区(FR)序列的保守性, 设计一组通用引物, 采用RT-PCR法扩增可变区基因[1,2].但由于引物的简并性, 克隆过程中将不可避免地改变抗体可变区两侧(FR1、FR4)的氨基酸序列, 这些改变可能导致基因工程抗体亲和力降低[3].我们对传统方法进行了改进, 采用5′-RACE(rapid amplification of cDNA end, RACE)克隆的策略, 获得了抗人CD16 mAb轻链可变区(VL)基因的真实序列.
作者：解志刚；郭宁；冯健男；施明；孙瑛勋；于鸣；沈倍奋 刊期： 2003年第01期
目的: 降低鼠源性抗血小板单克隆抗体SZ-2的免疫原性, 为其进一步研究、应用奠定基础.方法: 用Trizol试剂从SZ-2杂交瘤细胞抽提RNA, 应用RT-PCR技术, 扩增出SZ-2重链、轻链可变区基因, 克隆入载体pUCm-T, 测序分析.应用基因重组技术, 将SZ-2轻、重链可变区基因与人免疫球蛋白γ1重链CH1和κ轻链恒区基因进行拼接, 构建人-鼠嵌合Fab片段基因表达质粒pSW1-2 Fab/Hu, 并导入大肠杆菌XL1-blue诱导表达.以ELISA、Western blot和瑞斯托霉素诱导血小板聚集抑制试验, 对表达产物进行检测、验证.结果: 克隆的基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因的特征; 表达质粒pSW1-2 Fab/Hu拼接正确; 在大肠肝菌中的表达量约为180 μg/L; 表达产物具有与血小板GPIb结合的特性并可抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集.结论: 成功地克隆了SZ-2可变区基因; 并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体.
作者：戴克胜；祝怀平；江淼；阮长耿 刊期： 2003年第01期
目的: 分析anti-TCRαβ mAb、anti-TCRαβ mAb+anti-CD28 mAb诱导小鼠胸腺淋巴细胞不同亚群的凋亡及凋亡程度, 分析CD28协同刺激分子对TCR受体介导的胸腺细胞亚群凋亡的影响.方法: 新鲜分离胸腺细胞, 加入anti-TCRαβ mAb、 anti-TCRαβ mAb+anti-CD28 mAb等培养20 h, 进行多重染色, 流式细胞仪分析.结果: 与胸腺细胞自发凋亡的结果相比较: ①双信号刺激可明显增加胸腺细胞凋亡的数目, 尤其是CD4+CD8+胸腺细胞的凋亡数目.②凋亡的CD4+CD8+亚群、CD4+CD8 亚群细胞表面CD28的表达均增多.结论: CD28共刺激分子对TCR受体介导的胸腺细胞亚群凋亡的影响与细胞的成熟程度有关.CD28共刺激分子能明显增强不成熟皮质胸腺细胞的凋亡.
作者：李红梅；张华刚；王宏程；钱晓萍；孔宪涛；陈慰峰 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨钙离子载体(calcium ionophore, CI)对外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的影响.方法: 分离健康献血者外周血单核细胞, 分别加入重组人粒/单集落刺激因子(rhGM-CSF) 100 μg/L、rhGM-CSF 100 μg/L+CI 10 μg/L及rhGM-CSF+CI 各100 μg/L.体外培养40 h后, 于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志, MTT比色法检测上述分子对自体T细胞的刺激增殖作用.结果: 外周血单核细胞在GM-CSF+CI 各100 μg/L的条件下培养40 h, 就可看到典型的DC形态, 其表面CD14分子表达减少, HLA-DR、CD40、CD83及CD86分子的表达明显增高, 且具有明显刺激自体T细胞增殖的能力.结论: CI有显著加速GM-CSF诱导的外周血单核细胞向DC转化的作用.
作者：吴军；王晓怀；王捷；杨太成；赖晃文；郑文岭 刊期： 2003年第01期
人白细胞分化抗原(human leukocyte differentiation antigen, HLDA)及其单克隆抗体在免疫学研究中发挥着日益重要的作用.随着人类基因组计划的完成和细胞膜表面分子功能研究的深入, 不断有新的功能重要的白细胞分化抗原被发现.
作者：金伯泉；刘飞 刊期： 2003年第01期
目的: 在大肠杆菌中融合表达人Fas配体蛋白. 方法: 应用RT-PCR技术, 从激活的人外周血淋巴细胞中提取总RNA, 扩增Fas配体 cDNA, 克隆入PCR2.1载体.测序验证后, 克隆入带有组氨酸盒的表达载体pQE-31, 在大肠杆菌中表达, 经亲和层析柱纯化后, 用SDS-PAGE和Western blot 鉴定表达产物.结果: 表达的融合蛋白为人Fas配体, 其相对分子质量(Mr)为40 000.经透析复性后, 具有诱导Jurkat细胞凋亡的作用.用该蛋白分子免疫BALB/c小鼠制备抗血清, 以间接ELISA检测了部分自身免疫病与肿瘤患者血清中可溶性FasL的含量, 结果与进口试剂盒的灵敏性相似.结论: 获得人Fas配体蛋白, 并制备出抗FasL抗血清, 为进一步研制抗FasL单克隆抗体, 深入研究FasL的应用提供了材料.
作者：李宁丽；聂红；余奇文；柏峻；马安伦；张继英；沈佰华；王利；张冬青 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨一氧化氮(NO)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(AM)中核因子κB(NF-κB)活化的影响及机制. 方法: 将大鼠AM与不同浓度的NO前体左旋精氨酸(L-Arg)或iNOS特异性抑制剂N6-(1-亚氨乙基)赖氨酸(L-NIL)及CSE共同培养, 用免疫细胞化学染色法检测NF-κB, 用Western blot检测I-κB蛋白含量, 用Griess法测定培养上清液中NO的水平.结果: CSE可使NF-κB活化细胞的百分率增加, I-κB的水平下降.加入CSE和低浓度L-Arg培养的AM, NF-κB活化细胞的百分率显著高于只加入CSE的AM; 而I-κB的水平显著低于只加入CSE的AM.加入CSE和高浓度L-Arg培养的AM, NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM, 而I-κB的水平无显著变化.加入CSE和不同浓度的L-NIL培养的AM, NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM; 而I-κB的水平则显著高于只加入CSE的AM, 并呈浓度依赖(P<0.01).结论: 内源性NO对香烟烟雾所致NF-κB的活化具有双向调控作用.
作者：杨丹蕾；徐永健；张珍祥；李超乾 刊期： 2003年第01期
目的: 研究肿瘤热休克蛋白70(HSP70)与IL-2联合应用对荷瘤小鼠的治疗作用. 方法: 用液相色谱法纯化小鼠肿瘤细胞株中的HSP70.对纯化产物用SDS-PAGE及Western blot 进行定性分析, 再用毛细管电泳鉴定其纯度.通过动物实验, 观察HSP70与IL-2单独应用及联合应用的抗肿瘤作用.结果: HSP70与IL-2联合应用较单独应用的治疗效果更明显, 但治疗作用仍以HSP70为主.单独应用IL-2只能延长小鼠的生存期限[平均为(36.6±13.0) d], 而HSP70 10 μg组可使40%荷瘤小鼠的肿瘤终全部消退, 生存期长者>90[平均生存期(>59.2±29.6) d], 与对照组相比较差异显著(P<0.01).HSP70与IL-2联合应用组可使60%荷瘤小鼠的肿瘤完全消退, 平均生存期(>70.8±26.5)d, 与对照组相比差异十分显著(P<0.01).结论: 合适剂量的HSP70与IL-2联合应用, 对荷瘤小鼠有明显的治疗作用, 可明显抑制肿瘤进展, 提高生存率.以上结果对研究人类恶性肿瘤的免疫治疗具有较大的参考价值.
作者：傅庆国；孟凡东；沈晓东；郭仁宣 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨子宫内膜癌组织中热休克蛋白(HSP)70、90的表达及意义. 方法: 用免疫组化Envision法及图象分析仪, 检测30例正常子宫内膜、30例增生过长子宫内膜和53例子宫内膜癌中HSP70、HSP90的表达. 结果: 子宫内膜癌中HSP70表达的灰度值为(209.06±5.36), 明显高于正常内膜[(145.21±4.09), P<0.01]和增生过长内膜[(148.59±4.23), P<0.01]; 子宫内膜癌中HSP90表达的灰度值为(166.98±5.71), 明显低于正常子宫内膜[(208.57±31.14), P<0.05]和增生过长子宫内膜[(249.73±4.94), P<0.01].子宫内膜癌中HSP70的表达随肿瘤病理分级的增加而增强(P<0.01), 非内膜样癌(229.90±3.77)较内膜样癌表达强[(198.37±3.15), P<0.01]; 子宫内膜癌中HSP90表达随肿瘤病理分级的升高而表达减弱, 非内膜样癌(140.21±3.22)较内膜样癌表达减弱[(176.59±2.79), P<0.01].子宫内膜癌中HSP70、90的表达与肌层浸润深度、临床分期及淋巴结转移未见显著相关性(P>0.05).结论: HSP70、 90可能与子宫内膜癌的发生及预后有关.
作者：白晓霞；陈亚琼；辛晓燕；王文栋 刊期： 2003年第01期
目的: 检测热灭活或紫外线(UV)灭活的EB病毒(EBV)刺激培养的人脐带血B细胞产生IgG 和IgM的效应.方法: 常规分离人脐带血单个核细胞(UBMC), 以L-亮氨酸甲酯去除法, 去除单核细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞, 以2-氨乙基硫脲溴化物(AET)处理绵羊红细胞(SRBC)的花环形成分离法, 去除T细胞以获得纯化的B细胞.分别用UV和热灭活的EBV刺激培养的B细胞后, 用夹心ELISA法检测培养上清中IgG和IgM的产生.结果: 以UV灭活的EBV刺激培养B细胞后18 d起, IgG和IgM的产生具有意义(P<0.05); 而热灭活的EBV刺激后, 各时间点均无显著差异(P>0.05).结论: UV灭活EBV具有诱导IgG和IgM产生的作用, 但有明显的时效性, 提示EBV诱导IgG和IgM 产生, 可能是通过病毒的蛋白成分实现的, 为进一步验证EBV功能蛋白诱导天然自身抗体(NAA)产生中的作用奠定了基础.
作者：张衍国；付萌；刘玉峰；高天文；潘蕾；王琳 刊期： 2003年第01期
目的: 探索利用DNA改组(DNA shuffling)技术, 获得更高活性tPA的可能性.方法: 以人、恒河猴及大白鼠tPA cDNA为一组基因, 进行tPA的DNA改组 (DNA family shuffling).以改组后构建的tPA多样性文库转染CHO细胞并进行克隆和筛选.结果: 得到了两株有意义的克隆:t9和t17, 其中t9克隆表达的tPA活性略高于人tPA, 初步的比活性测定结果表明, 活性约提高4倍.t17克隆表达的tPA虽然有88个氨基酸的缺失, 但仍表现出与人tPA相同的活性.两株克隆经测序证明, 为改组后的基因, 其序列以人和恒河猴的tPA cDNA序列为主, 少数序列来源于大白鼠tPA cDNA.结论: 这一探索性结果将为后续几轮的tPA DNA改组探明道路, 为终从改组后tPA多样性基因库中筛选到比较理想的重组体打下基础.
作者：黄庆生；徐静；徐俊杰；童贻刚；王海涛 刊期： 2003年第01期
目的: 制备抗人层黏连蛋白(laminin, LN)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性. 方法: 以人LN免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗人的mAb; 同时采用间接ELISA法检测mAb的腹水效价及mAb的相对亲和力; 采用ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、进行表位分析及特异性鉴定.结果: 获得4株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞2A3、2C6、3G7和4H2, 其腹水mAb的效价为3.6×104～2.1×106; 4株mAb的Ig亚类为IgG1, 轻链均属κ型; 相对亲和力2C6在1012以上, 2A3、3G7和4H2在106以上; 其中2株与1个表位结合, 另2株与另外的1个表位结合. 结论: 成功地制备出抗人LN的mAb, 为进一步研究LN在一些疾病中的作用提供了工具.
作者：姚敏捷；黄汉朝；攸连秀 刊期： 2003年第01期
目的: 检测降钙素基因相关肽(CGRP) 、促肾上腺皮质激素 (ACTH)、 5-羟色胺(5-HT) 在正常人淋巴结中的表达, 并探讨它们对免疫系统的影响. 方法: 采用免疫组织化学SABC染色法, 检测35例正常人淋巴结(包括反应性增生淋巴结)中CGRP、ACTH、5-HT的表达. 结果: 35例正常人淋巴结中, CGRP、 ACTH及5-HT表达阳性率依次为: 88.5%(31/35)、85.4%(30/35)及94.2%(33/35).3种标记物在淋巴结中的分布大致相同, 主要分布在副皮质区的T细胞、淋巴滤泡生发中心B细胞及巨噬细胞等部位. 结论: 人外周淋巴结中CGRP、ACTH、5-HT的表达率很高, 且其分布与免疫细胞的分布基本一致.
作者：王舟；纪祥瑞；李继锋；高继发；梁桂华 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨人卵巢癌细胞中HLA分子及其相关基因的表达与IFN-γ诱导HLA分子表达的相互关系. 方法: 采用Western blot、免疫组化和流式细胞术, 检测卵巢癌细胞中HLA分子表达, 以RT-PCR技术, 分析卵巢癌细胞TAP、LMP和MHC II类分子反式激活蛋白(CIITA)基因表达. 结果: 被检测的11株卵巢癌细胞中, HLA-I 类分子异常的表达率达为45%.而HLA-I类分子表达的异常与TAP1、TAP2、LMP2和LMP7 4种基因表达的异常有关.卵巢癌细胞或其他肿瘤细胞HLA-II类分子的表达与CIITA基因的表达一致.组成性或诱导性表达CIITA基因的肿瘤细胞, 经IFN-γ作用后, 其HLA-I、-II类分子的表达增强; 而诱导后仍不表达CIITA基因的肿瘤细胞, 其HLA分子的表达无增强作用. 结论: 卵巢癌细胞中TAP和LMP基因表达的缺陷, 是引起HLA-I类分子表达异常的重要因素, 提示CIITA基因参与了调控肿瘤细胞HLA-I、-II类分子的表达.
作者：葛海良；张笑人；王颖；马安伦；张惠珍；王树军；周光炎 刊期： 2003年第01期
目的: 研究新城疫病毒(NDV)对肿瘤细胞的作用.方法: 采用空斑试验观察NDV对鸡胚成纤维细胞(CEF)的作用, 通过细胞抑制试验、琼脂糖凝胶电泳、TUNEL染色、细胞骨架染色及细胞唾液酸含量测定等,观察NDV对肿瘤细胞的影响.结果: NDV对CEF、HeLa及Hep-2等肿瘤细胞可产生明显的病变, 而对人的羊膜细胞(Wish细胞)无明显影响; 对Hela细胞和Hep-2细胞能产生明显的生长抑制作用, 但无量效依赖关系. NDV还可导致以凋亡为主的细胞死亡, 引起Hela细胞和Hep-2细胞的细胞骨架发生改变, 以及去除肿瘤细胞表面唾液酸的作用.结论: NDV能选择性地作用于人肿瘤细胞, 抑制肿瘤细胞的生长, 导致肿瘤细胞发生凋亡, 有望成为一种有效的抗肿瘤生物制剂.
作者：薛立娟；金宁一；龚伟；王宏伟；孙大辉；罗琴芳；葛涛；李萍 刊期： 2003年第01期
目的: 观察Th1、Th2样细胞因子对外周血CD158+细胞比率的调节作用, 为寻找干细胞移植免疫耐受的方法提供论理依据.方法: 将Th1样细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2样细胞因子(IL-4、IL-6), 单独或联合与人外周血单个核细胞(PBMC)培养72 h, 用流式细胞法分析总CD158a+、CD158b+细胞及CD3+、CD4+、CD8+和CD16+CD56+细胞亚群中CD158a+、CD158b+细胞的比率.结果: ①细胞因子对CD3+、CD4+、CD8+细胞及CD16+CD56+细胞的影响: IL-2和IFN- γ均可增加上述细胞的百分率(P＜0.05), 但IL-2的作用大于IFN- γ (P＜0.05). IL-2+IFN-γ联合处理的效应高于IFN-γ单独处理(P＜0.05). IL-4+IL-6可降低上述细胞的百分率(P＜0.05). IL-2+IL-4对上述细胞百分率的影响, 高于IL-4(P＜0.05)但低于IL-2(P＜0.05). ②细胞因子对CD158a+/b+细胞的影响: IL-2可增加总的CD158a+/b+细胞及CD3+、CD4+、CD8+和CD16+CD56+细胞中的CD158a+/b+细胞的百分比率(P＜0.05); IL-2+IFN-γ可增加CD158a+/b+细胞的百分率(P＜0.05), 但与IL-2单独处理无明显区别, IL-4+IL-6可降低CD158a+/b+细胞的百分率(P＜0.05).IL-2+IL-4可增加总的CD158a+/b+细胞及各亚群中CD158a+/b+细胞的百分率(P＜0.05), 但低于IL-2单独处理(P＜0.05) .结论: IL-2有促进CD158基因表达或使CD158a+、CD158b+细胞增殖的作用, 而IL-4、IL-6则对CD158a+、CD158b+细胞的增值起下调作用, IL-4对IL-2调节CD158a+、CD158b+细胞调节起拮抗作用.
作者：潘兴华；郭坤元；宋久刚；李江琪；庞荣清 刊期： 2003年第01期
目的: 研究新型的特异性类胰蛋白酶抑制剂双苯甲脒, 对肥大细胞稳定性的影响.方法: 扁桃体组织经酶消化后, 将细胞成分用全HEPES缓冲盐溶液(HBSS)重新悬浮.肥大细胞激发和抑制剂作用的试验在试管中37℃条件下完成.类胰蛋白酶水平用ELISA法测定.结果: 同时加入扁桃体细胞悬液中的双苯甲脒, 可以剂量依赖的方式抑制抗IgE诱导的类胰蛋白酶释放.仅1 mg/L(1.54 μmol/L)的双苯甲脒, 即可抑制肥大细胞释放类胰蛋白酶达52%, 10 mg/L则能抑制76%的释放.将预培养时间延长30 min, 对双苯甲脒的抑制作用无明显影响.在培养到45 min时, 双苯甲脒可抑制高达47%的基础类胰蛋白酶释放.与细胞培养15 min后, 抗IgE抗体(1 g/L)或钙离子导入剂(CI, 1 μmol/L)引起的类胰蛋白酶释放的量, 分别为基础分泌量的3.2和2.6倍.但是, 当细胞与全HBSS预培养超过10 min后, 肥大细胞对抗IgE抗体或CI的反应性明显降低.结论: 双苯甲脒能够抑制人类扁桃体肥大细胞的IgE依赖性类胰蛋白酶释放.因此, 有望开发成为一种新型的肥大细胞稳定剂.
作者：谢华；何韶衡 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨PD98059对慢性髓细胞白血病信号转导的作用及其作用机制.方法: 将PD98059加入慢性髓细胞白血病细胞系K562细胞中, 通过细胞活力、DNA合成、集落形成和MAPK活性的变化, 观察PD98059对慢性髓细胞白血病信号转导的作用.结果: PD98059可明显抑制K562细胞活力、DNA合成、集落形成和MAPK活性(与对照组比较, P<0.05), 其抑制作用具有浓度依赖性.结论: PD98059可通过阻断Ras-MAPK信号通路而发挥其抑制作用.Ras-MAPK通路极有可能成为 CML治疗的新靶点.
作者：尚振川；孙秉中；陈志南；王晶；冯琦；王玮；王莎；张涛 刊期： 2003年第01期
目的: 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达载体, 并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达.方法: 利用基因克隆技术, 将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamH I和Xho I双酶切后, 再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中, 构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导, 用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞, 然后以G418筛选阳性克隆, 用免疫细胞化学鉴定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实, 重组体中已插入目的基因片段VEGF165.免疫细胞化学证实, 重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达.结论: 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165, 并在骨髓基质细胞中得到表达, 为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据.
作者：高全文；董绍忠；陈希哲；陈琰；杨连甲 刊期： 2003年第01期
目的: 分析丙肝患者血清中抗HCV抗体的抗原表位.方法: 制备Protein A亲和层析柱, 从丙肝患者血清中纯化、制备抗HCV多克隆抗体; 并以此为筛选配基, 对噬菌体表面展示的随机15肽库进行亲和筛选.结果: 三轮筛选的投入产出比逐轮升高至3.3×10-3, 假阳性率逐轮降低至0.2%, 提示具有良好的富集效果.对从第3轮挑选出的16个克隆进行结合试验, 发现9个克隆只与HCV抗体有较强的结合力而不与正常人血清起反应.测序表明, 8个克隆的外源肽含有核心序列WPWS.用阳性噬菌体克隆检测20例丙肝患者血清, 有程度不等的阳性反应.结论: 用多克隆抗体从噬菌体随机肽库中, 筛选到有一定功能的模拟表位.
作者：柯屾；朱继萍；温新宇；赵平；施明；贺永怀；姚志建；沈倍奋 刊期： 2003年第01期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
