解志刚；郭宁；冯健男；施明；孙瑛勋；于鸣；沈倍奋
目的: 用生物工程技术制备人源性抗-HBs Fab.方法: 将从抗体文库中筛选出的人源抗-HBs Fab基因克隆入pBAD/g ⅢA载体, 进而转化Top10大肠杆菌.对重组质粒菌发酵表达后, 利用Ni-NTA-Agarose螯合层析柱纯化周质腔可溶性Fab蛋白.对所得包涵体依次变性、溶解、纯化后, 利用透析进行复性.用Western blot检测Fab蛋白的特异性, Dot blot测定其生物学活性.结果: 经Ni-NTA-Agarose柱纯化的周质腔可溶性Fab蛋白, 有较好的生物学活性, 并且总量达到80 mg/L.对所获包涵体进行透析复性后, 也可得到少量有活性的蛋白, 但比例很小.结论: 用pBAD/g ⅢA-Top10表达系统表达人源抗-HBs Fab片段, 发酵培养后, 经有效纯化可得到生物学活性较好的可溶性蛋白, 为人源抗-HBs Fab片段的大量制备提供了有效手段.
作者：安峰；陈玉川；陆慧琦；韩焕兴 刊期： 2003年第01期
目的: 提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体在二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞株(CHO/DHFR )中表达的产量.方法: 对表达载体中DHFR基因表达调控序列进行一系列的删除突变和点突变后, 构建不同的嵌合抗体表达载体.用这些载体转染CHO细胞并以递增量的氨甲喋呤(MTX)筛选, 用ELISA法测定每个加压水平的各组细胞中抗体的表达水平.结果: 通过对表达载体中DHFR基因表达调控序列的突变, 使DHFR的基础表达水平产生了不同程度的弱化.转染CHO细胞后, 可明显提高MTX加压增加抗体表达的效果, 抗体表达水平的增加基本与DHFR基因的弱化程度呈正相关.从弱化程度高的pWS2-BDI组中, 我们筛选得到表达量达55 μg/(106细胞*24 h)的高表达细胞株, 经锌离子进一步诱导后, 表达量可达100 μg/(106细胞*24 h)以上.结论: 弱化表达载体中DHFR的表达, 可提高MTX对工程抗体表达的增加效果.
作者：白银；王琰；张海荣；周丽君；吕英谦；俞莉章 刊期： 2003年第01期
目的: 纯化可刺激人γδ+ T细胞增殖的结核杆菌耐热多肽抗原.方法: 采用快速蛋白液相色谱仪(FPLC)S-100分子筛层析柱, 对结核杆菌耐热抗原(Mtb-Ag)初步分离.将获得的结核杆菌耐热Mr低的多肽抗原(Mtb-LW-Ag)洗脱峰, 分别再经FPLC Mono Q离子交换层析柱进一步纯化, 并且采用流式细胞仪对获得的Mtb-LW-Ag进行刺激γδ+ T细胞增殖活性的测定.结果: Mtb-Ag经FPLC S-100柱可分离出1个大分子蛋白峰A和3个Mr低的多肽峰(B, C, D).Mr低的多肽峰分别经Mono Q柱层析, 鉴定出B峰含有6个主峰, C峰含有1个主峰, D峰含有8个主峰. 对Mtb-LW-Ag及其纯化多肽进行活性检测, 发现多肽峰B和C以及纯化多肽B-Ⅲ和C-主肽均可显著刺激γδ+ T细胞扩增.结论: 利用FPLC法可快速高效地从Mtb-Ag中纯化出多种Mr低的多肽, 而且其中的B-Ⅲ多肽和C-主肽可能是促进γδ+ T细胞活化增殖的主要多肽.
作者：陈勇；吕合作；胡建国；候彦强；何海辉；张海峰；李柏青 刊期： 2003年第01期
目的: 制备抗人层黏连蛋白(laminin, LN)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性. 方法: 以人LN免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备抗人的mAb; 同时采用间接ELISA法检测mAb的腹水效价及mAb的相对亲和力; 采用ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、进行表位分析及特异性鉴定.结果: 获得4株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞2A3、2C6、3G7和4H2, 其腹水mAb的效价为3.6×104～2.1×106; 4株mAb的Ig亚类为IgG1, 轻链均属κ型; 相对亲和力2C6在1012以上, 2A3、3G7和4H2在106以上; 其中2株与1个表位结合, 另2株与另外的1个表位结合. 结论: 成功地制备出抗人LN的mAb, 为进一步研究LN在一些疾病中的作用提供了工具.
作者：姚敏捷；黄汉朝；攸连秀 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨人卵巢癌细胞中HLA分子及其相关基因的表达与IFN-γ诱导HLA分子表达的相互关系. 方法: 采用Western blot、免疫组化和流式细胞术, 检测卵巢癌细胞中HLA分子表达, 以RT-PCR技术, 分析卵巢癌细胞TAP、LMP和MHC II类分子反式激活蛋白(CIITA)基因表达. 结果: 被检测的11株卵巢癌细胞中, HLA-I 类分子异常的表达率达为45%.而HLA-I类分子表达的异常与TAP1、TAP2、LMP2和LMP7 4种基因表达的异常有关.卵巢癌细胞或其他肿瘤细胞HLA-II类分子的表达与CIITA基因的表达一致.组成性或诱导性表达CIITA基因的肿瘤细胞, 经IFN-γ作用后, 其HLA-I、-II类分子的表达增强; 而诱导后仍不表达CIITA基因的肿瘤细胞, 其HLA分子的表达无增强作用. 结论: 卵巢癌细胞中TAP和LMP基因表达的缺陷, 是引起HLA-I类分子表达异常的重要因素, 提示CIITA基因参与了调控肿瘤细胞HLA-I、-II类分子的表达.
作者：葛海良；张笑人；王颖；马安伦；张惠珍；王树军；周光炎 刊期： 2003年第01期
目的: 检测热灭活或紫外线(UV)灭活的EB病毒(EBV)刺激培养的人脐带血B细胞产生IgG 和IgM的效应.方法: 常规分离人脐带血单个核细胞(UBMC), 以L-亮氨酸甲酯去除法, 去除单核细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞, 以2-氨乙基硫脲溴化物(AET)处理绵羊红细胞(SRBC)的花环形成分离法, 去除T细胞以获得纯化的B细胞.分别用UV和热灭活的EBV刺激培养的B细胞后, 用夹心ELISA法检测培养上清中IgG和IgM的产生.结果: 以UV灭活的EBV刺激培养B细胞后18 d起, IgG和IgM的产生具有意义(P<0.05); 而热灭活的EBV刺激后, 各时间点均无显著差异(P>0.05).结论: UV灭活EBV具有诱导IgG和IgM产生的作用, 但有明显的时效性, 提示EBV诱导IgG和IgM 产生, 可能是通过病毒的蛋白成分实现的, 为进一步验证EBV功能蛋白诱导天然自身抗体(NAA)产生中的作用奠定了基础.
作者：张衍国；付萌；刘玉峰；高天文；潘蕾；王琳 刊期： 2003年第01期
目的: 构建蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease, TR)融合蛋白的原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达. 方法: 将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV core protein, HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin, hEDN)基因, 克隆入含PTD TAT的pTAT原核表达载体, 在大肠杆菌BL21(DE3)LysS 内, 以IPTG诱导融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定.结果: 成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体, 并在IPTG诱导下获得特异性表达. 结论: Tat-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建, 为体内应用靶向核酸酶治疗乙型肝炎奠定了基础.
作者：丁劲；刘军；薛采芳；李英辉；宫卫东 刊期： 2003年第01期
目的: 研究新城疫病毒(NDV)对肿瘤细胞的作用.方法: 采用空斑试验观察NDV对鸡胚成纤维细胞(CEF)的作用, 通过细胞抑制试验、琼脂糖凝胶电泳、TUNEL染色、细胞骨架染色及细胞唾液酸含量测定等,观察NDV对肿瘤细胞的影响.结果: NDV对CEF、HeLa及Hep-2等肿瘤细胞可产生明显的病变, 而对人的羊膜细胞(Wish细胞)无明显影响; 对Hela细胞和Hep-2细胞能产生明显的生长抑制作用, 但无量效依赖关系. NDV还可导致以凋亡为主的细胞死亡, 引起Hela细胞和Hep-2细胞的细胞骨架发生改变, 以及去除肿瘤细胞表面唾液酸的作用.结论: NDV能选择性地作用于人肿瘤细胞, 抑制肿瘤细胞的生长, 导致肿瘤细胞发生凋亡, 有望成为一种有效的抗肿瘤生物制剂.
作者：薛立娟；金宁一；龚伟；王宏伟；孙大辉；罗琴芳；葛涛；李萍 刊期： 2003年第01期
目的: 分析anti-TCRαβ mAb、anti-TCRαβ mAb+anti-CD28 mAb诱导小鼠胸腺淋巴细胞不同亚群的凋亡及凋亡程度, 分析CD28协同刺激分子对TCR受体介导的胸腺细胞亚群凋亡的影响.方法: 新鲜分离胸腺细胞, 加入anti-TCRαβ mAb、 anti-TCRαβ mAb+anti-CD28 mAb等培养20 h, 进行多重染色, 流式细胞仪分析.结果: 与胸腺细胞自发凋亡的结果相比较: ①双信号刺激可明显增加胸腺细胞凋亡的数目, 尤其是CD4+CD8+胸腺细胞的凋亡数目.②凋亡的CD4+CD8+亚群、CD4+CD8 亚群细胞表面CD28的表达均增多.结论: CD28共刺激分子对TCR受体介导的胸腺细胞亚群凋亡的影响与细胞的成熟程度有关.CD28共刺激分子能明显增强不成熟皮质胸腺细胞的凋亡.
作者：李红梅；张华刚；王宏程；钱晓萍；孔宪涛；陈慰峰 刊期： 2003年第01期
目的: 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达载体, 并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达.方法: 利用基因克隆技术, 将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamH I和Xho I双酶切后, 再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中, 构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导, 用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞, 然后以G418筛选阳性克隆, 用免疫细胞化学鉴定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实, 重组体中已插入目的基因片段VEGF165.免疫细胞化学证实, 重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达.结论: 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165, 并在骨髓基质细胞中得到表达, 为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据.
作者：高全文；董绍忠；陈希哲；陈琰；杨连甲 刊期： 2003年第01期
目的: 探索利用DNA改组(DNA shuffling)技术, 获得更高活性tPA的可能性.方法: 以人、恒河猴及大白鼠tPA cDNA为一组基因, 进行tPA的DNA改组 (DNA family shuffling).以改组后构建的tPA多样性文库转染CHO细胞并进行克隆和筛选.结果: 得到了两株有意义的克隆:t9和t17, 其中t9克隆表达的tPA活性略高于人tPA, 初步的比活性测定结果表明, 活性约提高4倍.t17克隆表达的tPA虽然有88个氨基酸的缺失, 但仍表现出与人tPA相同的活性.两株克隆经测序证明, 为改组后的基因, 其序列以人和恒河猴的tPA cDNA序列为主, 少数序列来源于大白鼠tPA cDNA.结论: 这一探索性结果将为后续几轮的tPA DNA改组探明道路, 为终从改组后tPA多样性基因库中筛选到比较理想的重组体打下基础.
作者：黄庆生；徐静；徐俊杰；童贻刚；王海涛 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨肺泡巨噬细胞(AM)中STAT1(signal transducers and activators of transcription 1)的活化在大鼠肺间质纤维化中的作用.方法: 50只健康雌性Wistar大鼠随机分成博莱霉素(BLM)组和生理盐水(NS)组各25只, 气管内分别灌注BLM和NS.用Western-blot法测定AM中STAT1活化的动态变化; 用免疫组化染色法测定AM的ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)的表达.结果: NS组中的AM内只有少许STAT1活化, 气管内灌注BLM后1 d, AM中STAT1的活化即开始显著增高, 于第7 天达高峰, 以后逐渐下降, 但28 d后仍高于NS组(P<0.05).NS与BLM组的AM中表达ICAM-1的细胞数增高的模式, 与AM中STAT1活化的模式相同.AM中STAT1活化的程度与AM中ICAM-1的表达呈正相关(r=0.913, P<0.01), 而后者又与肺组织炎症的积分呈正相关(r=0.947, P<0.01).结论: 实验性肺间质纤维化大鼠AM中存在STAT1的异常活化, 并参与了肺泡炎和肺纤维化的形成.
作者：范贤明；王曾礼；李振华 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨一氧化氮(NO)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的大鼠肺泡巨噬细胞(AM)中核因子κB(NF-κB)活化的影响及机制. 方法: 将大鼠AM与不同浓度的NO前体左旋精氨酸(L-Arg)或iNOS特异性抑制剂N6-(1-亚氨乙基)赖氨酸(L-NIL)及CSE共同培养, 用免疫细胞化学染色法检测NF-κB, 用Western blot检测I-κB蛋白含量, 用Griess法测定培养上清液中NO的水平.结果: CSE可使NF-κB活化细胞的百分率增加, I-κB的水平下降.加入CSE和低浓度L-Arg培养的AM, NF-κB活化细胞的百分率显著高于只加入CSE的AM; 而I-κB的水平显著低于只加入CSE的AM.加入CSE和高浓度L-Arg培养的AM, NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM, 而I-κB的水平无显著变化.加入CSE和不同浓度的L-NIL培养的AM, NF-κB活化细胞的百分率显著低于只加入CSE的AM; 而I-κB的水平则显著高于只加入CSE的AM, 并呈浓度依赖(P<0.01).结论: 内源性NO对香烟烟雾所致NF-κB的活化具有双向调控作用.
作者：杨丹蕾；徐永健；张珍祥；李超乾 刊期： 2003年第01期
目的: 获得具有生物学活性的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)模拟肽.方法: 以噬菌体扩增及PEG沉淀法, 大量制备展示十二肽P1、P2的噬菌体.采用ELISA、竞争抑制试验及免疫组化染色法, 分别鉴定P1、P2模拟ICAM-1分子的结合特性及生物学活性.结果: 噬菌体展示肽P1、P2能与抗ICAM-1单克隆抗体(mAb)15.2特异性结合.该结合作用可被ICAM-1分子竞争性抑制, P1、P2能模拟ICAM-1分子与LFA-1结合的功能.结论: 噬菌体展示的短肽P1、P2具有天然ICAM-1的生物学活性.
作者：郝文波；徐伟文；陈白虹；王萍；董文其；李明 刊期： 2003年第01期
目的: 观察Th1、Th2样细胞因子对外周血CD158+细胞比率的调节作用, 为寻找干细胞移植免疫耐受的方法提供论理依据.方法: 将Th1样细胞因子(IL-2、IFN-γ)和Th2样细胞因子(IL-4、IL-6), 单独或联合与人外周血单个核细胞(PBMC)培养72 h, 用流式细胞法分析总CD158a+、CD158b+细胞及CD3+、CD4+、CD8+和CD16+CD56+细胞亚群中CD158a+、CD158b+细胞的比率.结果: ①细胞因子对CD3+、CD4+、CD8+细胞及CD16+CD56+细胞的影响: IL-2和IFN- γ均可增加上述细胞的百分率(P＜0.05), 但IL-2的作用大于IFN- γ (P＜0.05). IL-2+IFN-γ联合处理的效应高于IFN-γ单独处理(P＜0.05). IL-4+IL-6可降低上述细胞的百分率(P＜0.05). IL-2+IL-4对上述细胞百分率的影响, 高于IL-4(P＜0.05)但低于IL-2(P＜0.05). ②细胞因子对CD158a+/b+细胞的影响: IL-2可增加总的CD158a+/b+细胞及CD3+、CD4+、CD8+和CD16+CD56+细胞中的CD158a+/b+细胞的百分比率(P＜0.05); IL-2+IFN-γ可增加CD158a+/b+细胞的百分率(P＜0.05), 但与IL-2单独处理无明显区别, IL-4+IL-6可降低CD158a+/b+细胞的百分率(P＜0.05).IL-2+IL-4可增加总的CD158a+/b+细胞及各亚群中CD158a+/b+细胞的百分率(P＜0.05), 但低于IL-2单独处理(P＜0.05) .结论: IL-2有促进CD158基因表达或使CD158a+、CD158b+细胞增殖的作用, 而IL-4、IL-6则对CD158a+、CD158b+细胞的增值起下调作用, IL-4对IL-2调节CD158a+、CD158b+细胞调节起拮抗作用.
作者：潘兴华；郭坤元；宋久刚；李江琪；庞荣清 刊期： 2003年第01期
目的: 在大肠杆菌中融合表达人Fas配体蛋白. 方法: 应用RT-PCR技术, 从激活的人外周血淋巴细胞中提取总RNA, 扩增Fas配体 cDNA, 克隆入PCR2.1载体.测序验证后, 克隆入带有组氨酸盒的表达载体pQE-31, 在大肠杆菌中表达, 经亲和层析柱纯化后, 用SDS-PAGE和Western blot 鉴定表达产物.结果: 表达的融合蛋白为人Fas配体, 其相对分子质量(Mr)为40 000.经透析复性后, 具有诱导Jurkat细胞凋亡的作用.用该蛋白分子免疫BALB/c小鼠制备抗血清, 以间接ELISA检测了部分自身免疫病与肿瘤患者血清中可溶性FasL的含量, 结果与进口试剂盒的灵敏性相似.结论: 获得人Fas配体蛋白, 并制备出抗FasL抗血清, 为进一步研制抗FasL单克隆抗体, 深入研究FasL的应用提供了材料.
作者：李宁丽；聂红；余奇文；柏峻；马安伦；张继英；沈佰华；王利；张冬青 刊期： 2003年第01期
目的: 克隆小鼠的p27Kip1基因, 并以此为探针分析p27Kip1在外周血B细胞中的表达, 以及其在抗原受体和CD40介导的抑制和促进增殖信号中的作用.方法: 从培养的B细胞中提取总RNA, 用RT-PCR扩增并克隆p27Kip1基因.用流式细胞仪检测B细胞凋亡.用Northern blot观察p27Kip1mRNA的表达水平.结果: 成功地克隆了小鼠的p27Kip1基因.发现抗原受体交联在引起外周血B细胞凋亡之前, 出现p27Kip1表达上调, 若同时激活CD40则使p27Kip1表达降低, B细胞也免于凋亡.用针对p27Kip1的反义寡核苷酸处理, 可阻断抗原受体交联引起的外周血B细胞凋亡.结论: p27Kip1可能在抗原受体信号介导的B细胞凋亡和CD40信号介导的B细胞生存中发挥一定的作用.
作者：王骊丽；韩骅 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨钙离子载体(calcium ionophore, CI)对外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的影响.方法: 分离健康献血者外周血单核细胞, 分别加入重组人粒/单集落刺激因子(rhGM-CSF) 100 μg/L、rhGM-CSF 100 μg/L+CI 10 μg/L及rhGM-CSF+CI 各100 μg/L.体外培养40 h后, 于光镜及电镜下观察细胞的形态、流式细胞仪检测细胞的表面标志, MTT比色法检测上述分子对自体T细胞的刺激增殖作用.结果: 外周血单核细胞在GM-CSF+CI 各100 μg/L的条件下培养40 h, 就可看到典型的DC形态, 其表面CD14分子表达减少, HLA-DR、CD40、CD83及CD86分子的表达明显增高, 且具有明显刺激自体T细胞增殖的能力.结论: CI有显著加速GM-CSF诱导的外周血单核细胞向DC转化的作用.
作者：吴军；王晓怀；王捷；杨太成；赖晃文；郑文岭 刊期： 2003年第01期
目的: 探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果.方法: 以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠.末次免疫7 d后, 收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液, 用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体.结果: rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高, 与对照组相比较差异显著(P<0.01).20 μg剂量组与10 μg剂量组相比较, 仅血清特异性IgG水平增高, 其它黏膜特异性IgA的水平未见增高.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强, 卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平.结论: CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂.Hp rUreB鼻黏膜接种, 不仅可诱导血清特异性抗体反应, 而且能引起多个黏膜部位的免疫应答, 是一种方便、有效、廉价的免疫途径.
作者：高志刚；邹全明；郭刚；郭桐生；曾韦锟；解庆华 刊期： 2003年第01期
目的: 研究肿瘤热休克蛋白70(HSP70)与IL-2联合应用对荷瘤小鼠的治疗作用. 方法: 用液相色谱法纯化小鼠肿瘤细胞株中的HSP70.对纯化产物用SDS-PAGE及Western blot 进行定性分析, 再用毛细管电泳鉴定其纯度.通过动物实验, 观察HSP70与IL-2单独应用及联合应用的抗肿瘤作用.结果: HSP70与IL-2联合应用较单独应用的治疗效果更明显, 但治疗作用仍以HSP70为主.单独应用IL-2只能延长小鼠的生存期限[平均为(36.6±13.0) d], 而HSP70 10 μg组可使40%荷瘤小鼠的肿瘤终全部消退, 生存期长者>90[平均生存期(>59.2±29.6) d], 与对照组相比较差异显著(P<0.01).HSP70与IL-2联合应用组可使60%荷瘤小鼠的肿瘤完全消退, 平均生存期(>70.8±26.5)d, 与对照组相比差异十分显著(P<0.01).结论: 合适剂量的HSP70与IL-2联合应用, 对荷瘤小鼠有明显的治疗作用, 可明显抑制肿瘤进展, 提高生存率.以上结果对研究人类恶性肿瘤的免疫治疗具有较大的参考价值.
作者：傅庆国；孟凡东；沈晓东；郭仁宣 刊期： 2003年第01期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
