张雷；卢惠苹；赖国祥
目的:制备抗结肠肿瘤相关抗原的单克隆抗体(mAb)并对其进行初步的鉴定及功能研究.方法:将结肠癌细胞系或磨碎的结肠癌组织免疫小鼠,按常规方法进行细胞融合,采用活细胞周围花环形成的方法进行阳性克隆的筛选.用间接免疫荧光染色和流式细胞术分析及酶免疫组织化学的方法进行初步鉴定,并用抗体介导的补体依赖的细胞毒试验(CDC)进行初步的功能研究.结果:获得了2株分泌抗结肠肿瘤相关抗原mAb杂交瘤细胞株3A12和6A8.流式细胞仪检测,2株杂交瘤分泌的抗体均能在结肠癌细胞系中均为阳性.普通石蜡切片及组织芯片的免疫酶组织化学染色结果,显示2株mAb均在结肠肿瘤组织中有较高的阳性率.2株mAb分别与靶细胞及补体作用后,对于靶细胞的杀伤率分别为98.1%和42.4%.结论:成功地制备了2株识别结肠癌细胞表面抗原的mAb,在结肠癌的诊断和治疗中可能具有潜在的应用价值.
作者：黄海燕；朱勇；刘雪松；蓝天；宋朝君；王鑫；金伯泉 刊期： 2005年第03期
目的:提高抗肝癌靶向超抗原SEA(D227A)的产量和稳定性,构建单链二硫键稳定抗体靶向超抗原分子scdsFvSEA(D227A).方法:构建scdsFv-SEA(D227A)表达质粒,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21plusS表达.包涵体经洗涤和复性后,用Q Sepharose HP和Hiprep26/60Sephacryl S-200HR纯化.纯化蛋白经AMS烷化处理并结合PAGE电泳来检测二硫键形成情况,并通过ELISA和MTS分别检测重组蛋白与肝癌细胞的结合活性、稳定性和细胞杀伤活性.结果:重组蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上.通过复性及Q Sepharose HP离子交换柱和Hiprep 26/60Sephacryl S-200H凝胶过滤两步纯化后,获得目的蛋白,每升诱导菌液的产量高达60mg.活性测定结果表明,相比与单链抗体靶向超抗原和二硫键抗体靶向超抗原SEA,二硫键抗体靶向超抗原在不影响结合活性和杀伤效果的情况下,稳定性有了较大提高.结论:建立了一种新的稳定的免疫毒素和提高其产量的方法,为hscFv25抗体靶向超抗原的临床应用奠定了基础,同时为其他低稳定性或低产量抗体的改造提供了借鉴的方法.
作者：郝淮杰；郑玉玲；余多慰；马茹；姜永强 刊期： 2005年第03期
目的:对不同剪接形式的小鼠era基因(mera)进行克隆、原核表达,并进行纯化,检测抗人Era蛋白抗体对于两种剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后鼠Era蛋白的研究奠定基础.方法:采用两种剪接形式era基因的MBP融合表达载体(pMAL-meraW,pMAL-meraS),在大肠杆菌中进行表达,对其进行纯化,并应用Western blot鉴定了抗人Era蛋白抗体的特异性.结果:原核表达的MBP-mEraW、MBP-mEraS融合蛋白经过薄层扫描后发现其分别占菌体总蛋白的17%、19%;纯化后的融合蛋白纯度为67%和61%;用抗人Era蛋白抗体进行Western blot发现抗体特异性较好,适合两种剪接形式的鼠Era蛋白的检测.结论:利用原核系统高效表达了不同剪切形式的鼠era基因,并检测了兔抗人Era蛋白抗体对不同剪接形式鼠Era蛋白的特异性,为以后对鼠era基因的研究奠定了基础.
作者：董轲；陈苏民；纪宗玲；郑玉；陈南春 刊期： 2005年第03期
目的:构建人端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的核心启动子调控的荧光素酶报告载体,检测其在肿瘤细胞及正常细胞中表达的差异.方法:提取人HeLa细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因的核心启动子.将其插入荧光素酶报告载体中,经SacⅠ和Hind Ⅲ酶切和PCR鉴定后,转染肿瘤细胞及正常细胞,观察两种细胞中荧光素酶基因表达的差异.结果:hTERT基因的启动子调控的表达载体在肿瘤细胞中呈高效表达;而在正常细胞中的表达极低.结论:hTERT基因的启动子具有肿瘤特异性,有可能解决肿瘤基因治疗中的靶向性问题.
作者：韩明鲲；张惠中；成诗银 刊期： 2005年第03期
目的:制备抗人RANTES分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定,为研究RANTES分子的组织分布和功能提供实验手段.方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备小鼠源性抗人RANTESmAb.用ELISA法鉴定腹水mAb的效价.用QFastFlow阴离子交换柱纯化mAb.用Western blot鉴定mAb的抗原结合活性.用免疫组化染色法,对RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠移植肠组织中的分布进行鉴定.结果:获得4株分泌抗RANTESmAb的杂交瘤细胞株.间接ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6,3株mAb为IgG1亚类(κ),1株为IgG2b(κ).Western blot的结果显示,3株mAb与人RANTES均有良好的结合活性.用3株mAb进行免疫组化染色的结果显示,RANTES分子在进行小肠移植术的大鼠小肠腺上皮细胞胞质中呈高表达.结论:获得4株能特异性识别天然RANTES分子的mAb.大鼠小肠移植后其肠上皮细胞中可高水平地表达RANTES.
作者：康振华；王为忠；陈冬利；王春艳；朱参胜；杜俊峰；金伯泉 刊期： 2005年第03期
目的:构建鸡白细胞介素-2(IL-2)真核重组表达质粒,体外鉴定其能否表达.方法:将鸡IL-2cDNA(RT-PCR法获得),克隆入真核高效表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA-IL-2重组表达质粒.PCR和双酶切的方法鉴定克隆的正确性.然后构建pcDNA-IL-GFP重组表达质粒(即GFP基因与IL-2的一段上游基因融合表达),PCR方法鉴定克隆的正确性.脂质体法转染COS-1细胞,荧光显微镜下观察荧光.结果:正确构建了真核重组表达质粒pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-GFP.荧光显微镜下可观察到很强的绿色荧光.结论:鸡IL-2克隆和表达成功.为下一步用重组质粒pcDNA-IL-2免疫BALB/c小鼠,研制鸡IL-2单克隆抗体奠定了基础.
作者：提金凤；郝贵杰；张艳梅；邵卫星；彭大新；刘秀梵 刊期： 2005年第03期
目的:研究识别不同PTA1/CD226分子结构域的mAb与刺激血小板活化的关系.方法:采用识别不同结构域的抗PTA1/CD226的mAb(FMU1-7),应用免疫荧光染色、流式细胞术和血小板凝集试验,研究识别不同结构域mAb对血小板的活化作用.结果:识别CD226第1个结构域的3株mAb(FMU1、2和3)可以与血小板结合,并可刺激血小板发生凝集,而识别CD226第2个结构域的mAb FMU6、FMU7以及识别两个结构域之间序列的FMU4和FMU5既不能与皿小板表面天然的CD226分子结合,也不能刺激血小板活化.结论:抗PTA1/CD226mAb刺激血小板活化与抗体识别的结构域有关.
作者：菅金龙；张新海；贾卫；李琦；曹云新；金伯泉 刊期： 2005年第03期
目的:观察接种以膜蛋白形式表达屋尘螨抗原Derp2基因的重组BCG(rBCG),对BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的影响.方法:以生理盐水为对照,分别将rBCG和BCG经腹腔注射接种于6～8wk龄和新生BALB/c小鼠,用ELISA法测定小鼠血清、脾脏T细胞培养上清(STLCS)中IL-4、IFN-γ水平,用双色荧光标记-流式细胞仪法测定脾脏细胞Th细胞亚群.结果:接种rBCG和BCG后,成年和新生小鼠血清和STLCS中IL-4水平较对照组显著降低、IFN-γ水平显著升高;无论成年鼠还是新生鼠,在CD4+的脾脏细胞中,IFN-γ+细胞的比例明显升高,而IL4+细胞比例明显降低;此外,在两个年龄组小鼠,接种rBCG者脾细胞均产生了较BCG组更高水平的IFN-γ;同时,用rBCG免疫的两组小鼠脾脏CD4+IFN-γ+的细胞比例也明显高于BCG免疫各组.结论:无论rBCG还是BCG通过腹腔注射免疫,均可诱导不同年龄BALB/c小鼠产生Th1免疫应答;表达在rBCG细胞壁上的Der p2被当成BCG的成分,为机体免疫系统所识别,抗原再次接触进一步刺激了Der p2特异性的Th1应答.这些结果表明,胞壁型抗原重组BCG可作为有效的疫苗,特异性地调节Th1/Th2平衡.
作者：史皆然；张新海；师长宏；曹云新；吴昌归；李元；范雄林；戚好文 刊期： 2005年第03期
全套抗体库为制备抗任意抗原的人源抗体提供了来源,且具有重要的基础研究和应用价值.因此,构建高质量的抗体库一直是抗体工程研究的热点.全合成抗体库技术以其可控性、可操作性强,组成成分明确,设计灵活并能满足高通量筛选的要求等特点,得以迅速发展和广泛应用[1].随着对抗体结构和功能认识的深人,人们越来越多地利用蛋白质工程手段进行优化设计,来提高抗体库中抗体分子的表达能力和稳定性,通过提高抗体库中功能性抗体的比例,从而有效地提高抗体库的质量.
作者：王尚资；尹长城；林正红；王祥斌；刘晶；管华诗；黄华樑 刊期： 2005年第03期
目的:在大肠杆菌中表达ESP30蛋白,并制备兔抗ESP30抗体.方法:从嗜水气单胞菌基因组中扩增ESP30基因序列,并克隆入非融合表达载体pDH2中,在温度诱导下,表达目的蛋白,以表达的ESP30作为免疫原免疫家兔制备抗ESP30抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Westernblot法鉴定.结果:在大肠杆菌中高效表达相对分子质量(Mr)约为66000的ESP30蛋白.ELISA法检测抗血清的效价可达到1:128000,Western blot分析抗血清可与原核表达的ESP30蛋白特异结合.结论:成功地制备兔抗ESP30的抗血清,为进一步研究ESP30蛋白的结构和功能奠定了基础.
作者：张莹莹；李福洋；张文红；张健；黄勇；刘新平；药立波 刊期： 2005年第03期
目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)的抗体检测方法.方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果.分析FITC标记的合成肽抗原在不同浓度时的FP值,用FP技术分析抗原表位的抗原性以及不同稀释比例的血清样品对FP检测的影响.分别应用FPIA法和ELISA法,对126例样品进行Hp感染检测,对FPIA的检测数据进行受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析.结果:UreB的单表位抗原肽具有较强的抗原性和免疫原性;1.0nmoL/L的FITC标记肽可用于FPIA检测,血清样品做1:25稀释时可明显区分阳性和阴性检测结果.与ELISA方法检测的结果相比较,用基于UreB单表位合成肽抗原的FPIA法检测Hp感染的灵敏度为85.7%,特异度为98%.结论:应用UreB单表位合成肽抗原,可对抗UreB的抗体进行快速FPIA检测,用此法检测抗体在疾病的临床诊断中具有广阔的应用前景.
作者：张文红；王琰；郭慧芳；白玉杰；阎小君 刊期： 2005年第03期
目的:探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白及其mRNA在妊高征和正常妊娠胎盘组织中的表达的差异.方法:应用Western blot检测10例妊高征和10例年龄匹配的正常妊娠的胎盘组织中HIF-1α蛋白表达的水平;应用实时定量PCR,检测两种组织中HIF-1αmRNA表达的水平.结果:与正常妊娠胎盘组织相比较,妊高征胎盘组织中HIF-1α蛋白和mRNA的表达水平明显增加(P＜0.05).结论:HIF-1α在妊高征胎盘组织中表达增高,可能与妊高征的病因及病理生理有关.
作者：吴维光；姚元庆；李东红；于月成；范小斌；张伟 刊期： 2005年第03期
用培养的细胞进行免疫组化染色时,可采用两种方法:细胞爬片和石蜡切片.虽然细胞爬片具有方便、快捷等优点,但也受到一定的限制.如抗体的结合部位位于细胞核时,由于细胞膜的障碍、穿透效果不佳;贴壁不牢的细胞在染色振洗过程中可发生脱落.这样不仅可降低检测的敏感性,甚至可出现假阴性的结果.而用细胞石蜡切片则可克服上述缺点,扩大检测的范围.本研究中,我们将培养的肝癌细胞株HepG2分别制作成细胞爬片和石蜡切片,用抗HCV核心蛋白的mAb做免疫组化染色,检测了HCV核心蛋白的表达,并对两种标本片检测的结果进行了比较.
作者：王文勇；邓南生；张志培；赵一岭；马福成 刊期： 2005年第03期
目的:探讨磷酸二酯酶(PDE)抑制剂对慢性阻塞性肺疾病(cOPD)患者外周血单个核细胞(PBMC)IL-8mRNA表达的影响及机制.方法:采集20例急性发作期COPD患者(A组)和15例正常人(B组)的PBMC.A组的每份PBMC分4组培养:A1组为空白对照,A2组和A3组分别加入100μmol/L及1mmol/L的非选择性PDE抑制剂茶碱,A4组加入选择性PDEⅣ抑制剂Rolipram.应用RT-PCR检测IL-8mRNA的表达,以免疫组化法检测NF-κB阳性细胞的百分率,用Western blot检测I-κB蛋白的含量.结果:(1)A1组PBMC中IL-8mRNA的表达及NF-κB阳性细胞的百分率,均显著高于B组;I-κB的水平显著低于B组(P＜0.01).(2)与A1组比较,A2组和A3组的PBMC中IL-8mRNA的表达无显著差异(P＞0.05);A4组IL-8mRNA的表达明显下降(P＜0.01).(3)与A1组比较,A2组NF-κB阳性细胞的百分率及I-κB的水平无显著差异(P＞0.05);而A3组的PBMC中NF-κB阳性细胞的百分率下降(P＜0.05),I-κB蛋白的水平无显著变化(P＞0.05).A4组PBMC中,NF-κB阳性细胞的百分率较A1组明显下降,I-κB蛋白的水平明显增加(P＜0.01).结论:COPD患者PBMC中IL-8mRNA的表达较正常增高,提示IL-8参与了COPD的发病过程;选择性PDEⅣ抑制剂Rolipram可抑制IL-8基因的表达,其作用机制可能与NF-κB阳性细胞百分率的下降有关.非选择性PDE抑制剂茶碱对IL-8基因的表达无明显影响.
作者：杨丹蕾；徐永健；李超乾；张珍祥；倪望 刊期： 2005年第03期
目的:在大肠杆菌中分别表达3种Red蛋白,并制备兔抗Red蛋白的抗体.方法:从λ噬菌体基因组中,通过PCR分别扩增gam、bet和exo DNA的全长序列.将PCR产物克隆入非融合表达载体pDH2中,构建Red蛋白的高表达工程菌.通过温敏诱导表达3种Red蛋白(Bet、Exo和Gam),用PACTE薄层扫描检测目的蛋白含量.用3种Red蛋白分别免疫家兔制备抗血清,并以Western blot鉴定抗体的效价和特异性.结果:大肠杆菌中表达的Bet、Exo和Gam蛋白,分别占菌体总蛋白量的40.3%、49.2%和73.4%.3种抗血清的效价约为1:2000.Western blot分析显示抗血清具有较好的特异性.结论:成功地获得Bet、Exo和Gam3种蛋白,并分别制备了相应的抗血清.使用这3种抗血清,检测了3种蛋白在真核细胞中的表达和定位,为研究Red蛋白的同源重组奠定了基础.
作者：张晓楠；陈苏民；罗二平；黄勇；柴玉波；李云峰；陈南春 刊期： 2005年第03期
目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性.方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a(+)中.以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测.采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白.结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白.目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%.表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性.结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖.
作者：安家泽；宋振顺；窦科峰；李开宗；韩骅 刊期： 2005年第03期
目的:探讨神经细胞形成的体外微环境,诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell,BMSC)向神经元分化的机制.方法:从SD大鼠骨髓中提取BMSC进行体外培养、扩增,并用免疫组化染色进行鉴定.以绿色荧光染料PKH67标记BMSC后,将BMSC与神经细胞共培养以及用双层培养皿联合培养8d后,用免疫荧光检测BMSC是否分化为神经元.结果:将BMSC与神经细胞共培养后,BMSC出现神经元的形态特点,且有(32.72±2.56)%的神经元表达特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE),与BMSC自然分化组(对照组)相比较差异非常显著(P＜0.05);但用双层培养皿联合培养时,只有(4.87±0.79)%的BMSC表达NSE,与对照组相比较差异不显著(P＞0.05),但与BMSC和神经细胞共培养组相比较差异显著(P＜0.05).结论:体外培养时,神经细胞形成的局部微环境可促进BMSC向神经元方向分化,并且细胞间的紧密接触是诱导BMSC向神经元分化的重要条件.
作者：闰彬彬；王莉莉；乔俊峰；鹏海生；曹京艳；李呼伦；金连弘 刊期： 2005年第03期
目的:建立甲基苯基四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病模型小鼠,检测血浆IL-6和IL-1的水平,并探讨其与脑不对称的关系.方法:利用区分行为不对称的伸爪取食试验,将C57BL/6J小鼠区分为反映脑不对称的左利小鼠和右利小鼠.给小鼠腹腔注射MPTP25mg/kg,每日1次,连续5日,建立小鼠帕金森病模型,对照组注射等体积的生理盐水.后1次注射MPTP后1、3、14d杀鼠取血,采用ELISA检测各时间点小鼠血浆IL-6和IL-1的水平.结果:正常对照组血浆IL-6水平很低,而模型组小鼠在末次注射MPTP后14d,血浆IL-6的水平显著升高(P＜0.01).而且第14天右利小鼠血浆IL-6的水平高于左利小鼠IL-6水平(P＜0.05).正常对照组小鼠血浆IL-1的水平也较低,而模型组小鼠在末次注射MPTP后3d,血浆IL-1的水平显著升高(P＜0.05),而且左利小鼠的水平明显高于右利小鼠(P＜0.01).结论:IL-6和IL-1可能参与了MPTP诱导的C57BL/6J小鼠帕金森病的发生发展,并与脑不对称有关.
作者：申延琴；李康生；P.J.Neveu 刊期： 2005年第03期
目的:建立从小鼠腹水中纯化抗gp130单克隆抗体(mAb)B-S12的一步层析方法.方法:小鼠mAb腹水样品经离心后,进行阳离子交换层析柱纯化.检查了上样缓冲液的pH值和洗脱液的离子强度梯度对mAb纯度的影响.纯化后mAb的生物学活性用MTT比色法检测.结果:在pH4.0、20mmol/LHEPES缓冲液条件下上样,用0～1.0mol/L的NaCl梯度洗脱,可获得纯度超过90%的mAb B-S12,回收率为52%.纯化后的mAb对XG-2细胞有明显的促增殖作用.结论:建立的一步纯化方法操作简便,所得mAb的纯度高及生物学活性好.
作者：马泓冰；庄羽美；徐颖；郁健锋；刘琳；李文香；张学光 刊期： 2005年第03期
目的:观察重组人白细胞介素-2(rhIL-2)与阿霉素长循环热敏脂质体(ALTSL)联合靶向治疗荷H22瘤小鼠的协同作用,并探讨其抑瘤作用的机制.方法:以荷H22瘤小鼠的瘤重为指标,评价药物的抑瘤活性.以荷H22瘤小鼠的存活天数计算生命延长率.以乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞的杀伤活性.以MTT比色法检测淋巴细胞的转化率.以流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡及p53、Fas、FasL和caspase-3的表达.用RT-PCR法测定IL-2mRNA及IL-12mRNA的表达.镜下观察荷H22瘤小鼠肿瘤、心、肝及肾脏组织的病理变化.结果:rhIL-2+ALTSL的抑瘤率显著高于单用ALTSL,分别为73.5%和67.0%;ALTSL和rhIL-2+ALTSL均可显著延长荷瘤小鼠的存活时间(P＜0.05～P＜0.01)与对照组和游离阿霉素(FADM)组相比较,ALTSL组NK细胞的杀伤活性显著增加,rhIL-2+ALTSL组NK细胞的杀伤活性更高.与FADM组比较,rhIL-2+ALTSL组淋巴细胞的转化率明显提高(P＜0.01).应用ALTSL组和rhIL-2+ALTSL组均可增强脾细胞中IL-2mRNA和IL-12mRNA的表达,但后者的增强作用高于前者.病理切片检查显示,热敏脂质体配合肿瘤局部加热,使肿瘤细胞凝固坏死,联合应用rhIL-2肿瘤组织溶解,细胞破碎,可见大量的淋巴细胞浸润.结论:ALTSL能提高ADM的抑瘤效果,降低ADM心肺的毒性.rhIL-2+ALTSL可诱导肿瘤细胞凋亡,激活并增强T细胞和NK细胞的杀伤活性,发挥协同作用.
作者：董兰凤；梅和珊；宋淑霞；吕占军 刊期： 2005年第03期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
