刘长海
目的: 原核表达野生型p53与Tat PTD (protein transduction domain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率. 方法: 利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化.以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清.将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率. 结果: 成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白,制备p53特异的抗血清,证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内.结论:Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础.
作者：丁劲；刘军；黄豫晓；李英辉；陈俊；赵亚；薛采芳 刊期： 2005年第05期
目的: 探讨白藜芦醇(Res)抗肿瘤作用的免疫学机制.方法: 用MTT比色法测定肿瘤细胞生长抑制率,流式细胞术分析其细胞周期.分别采用MTT比色法、溶血分光光度法、改良的Mayer法及双抗体夹心ELISA法,检测荷瘤小鼠的免疫功能及细胞因子的水平.结果: Res可以时间-剂量依赖的方式抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡,出现明显的凋亡峰和G0/G1期阻滞现象; 抑瘤率高可达42.76%.Res可增强NK细胞的杀伤力、 T细胞增殖、抗体的分泌及CH50活性,并呈剂量依赖性.Res还可显著提高IL-2和TGF-β1的含量; 减少IL-8和VEGF的分泌.结论: Res既可直接作用于肿瘤细胞,也可通过提高机体细胞与体液免疫应答的水平,调节细胞因子的分泌,而发挥抗肿瘤作用.
作者：李覃；胜利；范桂香；袁育康；李彤 刊期： 2005年第05期
目的: 观察复方木鸡冲剂在慢性乙型肝炎中的疗效.方法: 选择28例服用复方木鸡冲剂及护肝药物的慢性乙型肝炎患者作为治疗组,31例仅用护肝药物的患者作为对照组,观察并比较两组治疗前、治疗结束时、治疗结束3月后临床症状改善率、肝功能、血清肝纤维化指标、部分免疫学指标、血常规及超声诊断参数的变化.结果: 复方木鸡冲剂可明显改善患者多项检测参数,包括ALT、 AST、 r-GT、 HA、 LN、PCⅢ、 IgG、 r-球蛋白、 AFP、血小板、脾厚度和肝光点异常率,部分作用较为持久.结论: 复方木鸡冲剂具有保护肝细胞、抑制肝纤维化、降低AFP水平和减轻脾肿大的作用,对慢性乙肝有良好疗效.
作者：韩捷；陈海燕；沈培辰；解慧；吴振彪；王维东；冷南 刊期： 2005年第05期
目的: 建立双抗体夹心ELISA法,定量检测重组可诱导共刺激分子(ICOS)-mIg融合蛋白的分泌型表达,并对其灵敏度、特异性及线性检测范围进行评价.方法: 用分子生物学技术制备重组ICOS-mIg融合蛋白.以羊抗小鼠IgG 为包被抗体,HRP标记的马抗小鼠IgG为检测抗体,通过配对试验、方阵滴定试验及绘制mIgG浓度与A450值的标准曲线,建立定量检测重组ICOS-mIg融合蛋白的双抗体夹心ELISA法.结果: 建立了双抗体夹心ELISA法,检测的线性范围为7.8～500 μg/L,标准曲线的回归方程为: y=-0.7864+1.1635 log(x),R2=0.9911,P<0.0001.应用该方法可快速检测哺乳动物细胞表达的重组ICOS-mIg融合蛋白的分泌量.结论:建立了一种可快速定量检测重组ICOS-mIg融合蛋白分泌表达的双抗体夹心ELISA法.该法灵敏、准确、快速、实用性好,对优化ICOS-mIg融合蛋白表达细胞的筛选和大规模制备具有重要价值.
作者：王健；沈茜 刊期： 2005年第05期
目的: 研究胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠关节中局部浸润的T细胞TCR Vβ克隆型.方法:用II型胶原(CII)诱导Lewis大鼠发生关节炎后,经流式细胞术分析大鼠外周血CD4+和CD8+细胞的变化.提取CIA大鼠关节组织的总RNA,通过RT-PCR/SSCP方法分析大鼠两后肢足关节中TCR Vβ克隆型的一致率.将CIA大鼠脾淋巴细胞转移至同系正常大鼠,观察发病情况.结果:从注射CII的第30天起,大鼠后爪出现红、肿等症状.流式细胞术分析显示,与正常大鼠相比较,CIA大鼠外周血CD8+T细胞的降低有显著性意义(P<0.01),CD4+ T/CD8+ T的比值大于2(P<0.01),提示CIA大鼠体内存在T淋巴细胞亚群的比例失调.CIA大鼠两后肢足关节中聚集的TCR Vβ克隆型的一致率,以TCR Vβ5.2和8.2高,分别为78.89%和72.23%.脾淋巴细胞转移试验显示,受者发病的大鼠关节中,出现与供者CIA大鼠一致的TCR Vβ克隆型条带,表明关节局部聚集的TCR Vβ克隆型与关节炎(RA)的发病有关.结论: CIA大鼠关节局部存在以TCR VVβ5.2和8.2为主的致病性的T细胞TCR Vβ克隆型,可将其作为治疗CIA的靶物质,进行实验动物RA治疗的研究.
作者：张新梅；赵文明；李蕴；刘振龙 刊期： 2005年第05期
目的: 研究在异基因骨髓细胞移植中葡萄球菌肠毒素B(SEB)诱导的耐受强度和细胞学特征.方法: 选用C57BL/J小鼠作为受体,BALB/c小鼠作为供体.所有受体小鼠在接受6×107骨髓细胞前均接受6.0Gy 60Coγ射线的照射,随机分成3组: 组1为只接受6.0Gy 60Coγ射线照射的对照组(照射对照组,RI);组2为照射后注射生理盐水(移植对照组,Tran.); 组3为照射后注射60 μg SEB(SEB组).180 d后由组2和组3实验鼠获得两组C57BL/L-BALB/c嵌合体小鼠.用流式细胞术分析移植后30～180d受体小鼠体内CD4+ T、 CD8+ T、 CD3+/NK1.1+ NKT淋巴细胞亚群的数量和MHC H-2Kb、 H-2Kd抗原表达的百分率,用MLR方法测定嵌合体小鼠淋巴细胞对ConA和异源性抗原的反应性.结果: (1)接受大剂量骨髓细胞移植后,注射SEB和注射生理盐水的两组小鼠均可存活180 d以上,SEB组小鼠呈现出BALB/c供体小鼠的颜色特征(白色);Tran.组小鼠呈现出其灰白色.(2)SEB组嵌合体小鼠对ConA的反应性明显低于RI组和Tran.组;对异源性抗原的应答高于Tran.组.(3)SEB组小鼠外周血中CD4+ T细胞的数量在移植后30～60 d明显下降,随后增加; CD8+T细胞的数量不变.CD3+/NK1.1+ NKT细胞的数量,从接受移植后30 d开始增加,随着时间的延长而递增,到180d达到5.71%.存活180 d的嵌合体小鼠,体内供体小鼠特有的MHC H-2Kd抗原的表达率高达80.95%,自体MHC H-2Kb抗原表达的百分率只占1.45%.(4)与SEB组相反,Tran.组小鼠CD8+ T细胞的数量持续下降; CD3+/NK1.1+NKT细胞的数量的增加只在移植后180 d上升达到5.07%.结论: 在异基因骨髓细胞移植中,SEB诱导的耐受性比单纯骨髓移植诱导的耐受性强.SEB诱导的耐受性与移植早期特异性CD4+ T细胞数量的减少和NKT细胞数的持续增加有关.反应性的降低表现为T细胞对ConA反应性的下降.
作者：陈钰；潘志强；彭虹；徐亮 刊期： 2005年第05期
目的: 构建人Toll 样受体-9(hTLR-9)基因5′端序列的表达质粒,在大肠杆菌中表达,并以表达的hTLR-9-N免疫小鼠制备抗体.方法: 构建 hTLR-9 基因5′端(707～1 167 bp)的硫氧还蛋白(thioredoxin)融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N.将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.5 mmol/L IPTG诱导下表达.表达产物用SDS-PAGE 进行鉴定.以8 mol/L 尿素溶解的包涵体作为免疫原,免疫昆明种小鼠制备抗hTLR-9-N的抗体.结果:融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N在E.coli BL21 (DE3)中以相对分子质量(Mr)为31 000的包涵体形式表达;Western blot分析证明hTLR-9-N在大肠杆菌中得到正确表达.表达的目的蛋白初步纯化后的纯度达90%以上;以hTLR-9-N为抗原制备的抗血清效价为1∶25 600; 该抗血清可以与转染后稳定表达全长hTLR-9的HEK293细胞产生结合反应.结论:成功地在大肠杆菌中表达hTLR-9 N末端蛋白,制备的抗hTLR-9-N抗体可特异性结合表达全长hTLR-9的真核细胞.
作者：李军；赵文忠；江海燕；朱平；富宁 刊期： 2005年第05期
目的: 克隆细胞因子midkine(MK)基因,表达其融合蛋白,制备抗MK单克隆抗体(mAb)并检测MK在肿瘤细胞中的表达.方法:利用MK基因的特异性引物,通过RT-PCR从人肾癌组织mRNA中扩增人MK cDNA分子.将其定向克隆于原核表达载体中,在大肠杆菌中表达MS2-MK融合蛋白.以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用传统的杂交瘤技术,进行细胞融合、筛选、克隆化并制备mAb腹水.用ELISA法分析其Ig亚类,用免疫细胞化学染色法检测MK在肿瘤细胞中的表达.结果:成功地克隆出MK基因并表达了MS2-MK融合蛋白.通过免疫和筛选,获得2株分泌小鼠抗人MK mAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb的Ig亚类分别为IgG1和IgG2a.免疫细胞化学染色显示,2株mAb与人胃癌细胞株MGC803和胃癌组织呈强阳性反应.结论:在原核细胞中获得MS2-MK融合蛋白的表达,并制备出抗MK的mAb,为研究MK的生物学活性提供了条件.
作者：张青云；杨敏；王雅明；徐建军 刊期： 2005年第05期
SARS冠状病毒(SARS-CoV)严重威胁人类的健康,对其深入研究具有重要的现实意义.许多研究表明,SARS-CoV的S糖蛋白(spike glycoprotein)为其主要抗原,在病毒与宿主细胞表面受体结合并介导病毒经膜融合进入细胞中起关键作用.
作者：秦宇；李梅；刘中华；石立莹；毛乃颖；许文波；李晓眠 刊期： 2005年第05期
目的:比较磺基罗丹明B(SRB)法与二苯基溴化四氮盐(MTT)比色法细胞计数的灵敏性和稳定性.方法: 取4种不同类型对数生长期的细胞,调整细胞的密度为1×106/L,并按比例稀释为0.039×105～10×105个细胞的梯度.(1)用SRB法与MTT比色法测定各细胞梯度相应A值,分别分析两种方法测到的A值与相应细胞梯度细胞数的相关性.(2)SRB法与MTT比色法各随机取100个A值,测量其在2、 16、 24 h及7d后的A值,比较这两种方法的稳定性.结果:SRB法和MTT比色法测定的A值与不同细胞系的细胞数目均有极好的相关性.SRB法测定的结果几乎不随时间而变化;而MTT法测定的结果受时间影响较大.结论: SRB法与MTT比色法相比较更适于进行大规模的细胞计数.
作者：周思朗；屈艳妮；张健；汪森明；张积仁 刊期： 2005年第05期
目的: 研究外源质粒DNA经胃肠道途径对小鼠免疫基因表达的调控作用.方法: 给BALB/c小鼠灌胃质粒pcDNA3 200 μg,分别在灌胃后4 h和18 h分离脾脏,提取脾脏总RNA.利用Affymetrix基因表达谱芯片对灌胃质粒pcDNA3后的BALB/c小鼠脾脏进行基因表达谱研究.采用Genmmapp和MAPPFinder软件进行功能聚类分析.结果:灌胃质粒pcDNA3后,大量与免疫应答相关的基因发生上调,这些基因包括转录因子、细胞因子和细胞因子受体、主要组织相容性基因、蛋白酶体基因、补体分子基因和细胞凋亡相关基因;下调的基因主要是免疫球蛋白基因.MAPPFinder分析结果显示大量免疫应答过程发生上调.结论:外源质粒DNA通过胃肠道途径可调控大量免疫基因的表达,对相关基因及免疫应答过程的研究有助于在分子水平上深入了解外源质粒DNA的胃肠道作用机制.
作者：刘建文；乐国伟；施用晖 刊期： 2005年第05期
目的: 探讨P38MAPK和MCP-1的关系及其在糖尿病动脉粥样硬化中的作用以及硒的作用机制.方法: 分别以高葡萄糖、糖基化终末产物(AGE)、胰岛素或过氧化氢体外孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并以Westernblot法或RT-PCR法检测P38MAPK和MCP-1在HUVEC的表达.检测并比较有无P38MAPK特异抑制剂SB203580或硒预处理,以上4种因素对P38MAPK和MCP-1在HUVEC表达的影响.结果: 高葡萄糖、 AGE、胰岛素或过氧化氢均可独立激活P38MAPK,并增加MCP-1在HUVEC的表达.SB203580显著抑制MCP-1的表达.硒抑制P38MAPK的活化并减少MCP-1的表达.结论:P38MAPK是MCP-1的上游信号分子,表明P38MAPK可能是糖尿病动脉粥样硬化发生的始动信号之一.硒可能通过抑制P38MAPK磷酸化而抑制MCP-1表达,有预防动脉粥样硬化作用.
作者：李艳波；李为民；韩君勇 刊期： 2005年第05期
为了探讨血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和抗结核杆菌抗体(TB-Ab)在结核病病情转归中的意义,我们对60例痰菌阳性的初治肺结核患者和30例健康人血清中的TNF-α和TB-Ab分别进行了定量及定性检测,并对检测的结果做了评价.
作者：闫伯强；胡天勇；杨宜平 刊期： 2005年第05期
目的: 制备并鉴定抗GST、His×6及FLAG的单克隆抗体(mAb).方法: 分别以含GST、 His×6及FLAG标签的融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备抗相应标签蛋白的mAb.用Western blot检测mAb对变性融合蛋白的反应性.用流式细胞术(FCM)检测抗FLAGmAb对细胞膜表面融合蛋白的反应性.结果: 共获得12株可稳定分泌抗3种标签蛋白mAb的杂交瘤细胞(其中5株可分泌抗GST mAb,5株可分泌抗His×6 mAb,2株可分泌抗FLAG mAb).11株mAb均可用于相应融合蛋白的Western blot检测.1株抗FLAGmAb检测细胞膜表面融合蛋白的阳性率,与商品化的mAb M2相接近.用1株抗His×6 mAb制备亲和层析柱,并用于纯化IL-8-His融合蛋白,也获得较满意的结果.结论: 成功地制备了抗GST、抗His×6及抗FLAG的mAb,为含标签的融合蛋白的研究和应用提供了重要的工具.
作者：徐竹蔚；刘莹；户义；朱参胜；张圆；宋朝君；许晓光；金伯泉 刊期： 2005年第05期
目的: 探索细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在无血清体系中的增殖规律、表型变化及其抗瘤活性.方法: 不同培养基培养CIK细胞,采用活细胞计数法观察CIK细胞的增殖,流式细胞仪检测CIK细胞的表型,CytoTox96非放射性细胞毒试剂盒检测CIK细胞的细胞毒活性.结果:经过细胞因子和抗体刺激后,CIK细胞能明显增殖,无血清培养基加自体血浆组高可扩增473.28±27.53倍,无血清培养基组可扩增218.24±16.86倍,而RPMI1640加FCS只扩增11.52±1.04倍.CD3++CD8+、CD3++CD56+、CD226++CD11a+和CD305++CD11a+细胞随着培养时间的延长而增加,而CD3++CD4+细胞则明显减少.CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用明显高于LAK细胞(P<0.01),且其细胞毒活性随着培养时间的延长而增高.结论: CIK细胞在体外扩增能力强,对肿瘤细胞的杀伤活性高,有望成为新一代抗肿瘤过继免疫细胞制剂而应用于临床.
作者：曹建平；姜志明；张晓晨；蔺迪；陈伟；孙英慧；马东初 刊期： 2005年第05期
抗金葡菌多肽(PH-SA)是利用金黄色葡萄球菌信息素(pheromone)和大肠杆菌Ia(colicin)人工合成的新的蛋白质工程多肽(pheromonicin),主要是针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methecillinresistant Staphylococcus aureus,MRSA)及其他致病菌的新型生物信息导向抗菌药物.
作者：肖毅；梅其炳；侯颖；周四元；丘小庆 刊期： 2005年第05期
目的: 明确天然角蛋白反应性B细胞的亚群及解剖定位,初步分析其分泌天然抗角蛋白自身抗体(anti-keratinautoantibody,AK auto Ab)的能力.方法: 取SPF级C57BL/6小鼠的脾细胞和腹腔细胞,荧光抗体染色后用流式细胞仪分析角蛋白反应性B细胞亚群.将脾脏和腹腔淋巴细胞体外培养后,用ELISA分析AK auto Ab的滴度,用ELISPOT法分析分泌AK auto Ab的B细胞数.结果: 腹腔中几乎所有结合角蛋白的B细胞均为B-1a细胞,脾脏中结合角蛋白的B细胞以边缘带B细胞为主.腹腔细胞中分泌AK auto Ab的细胞数显著多于脾细胞,其培养上清中AK autoAb的滴度显著高于脾细胞.结论: 角蛋白反应性B细胞存在于3个成熟B细胞亚群: B-1细胞、滤泡B细胞和边缘带B细胞,其中CD5+的B-1a细胞具有活跃的分泌AK auto Ab的能力.
作者：邢影；李巍；付萌；韩骅；王刚；刘玉峰 刊期： 2005年第05期
目的: 制备特异性的抗人类微小病毒B19单克隆抗体(mAb)杂交瘤.方法:采用PCR从B19病毒感染患者的血清标本中扩增编码VP2蛋白的基因,经克隆、测序确认后,再分别亚克隆至原核表达载体和真核表达载体.以从SDS-PAGE凝胶中回收的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,制备可分泌特异性B19mAb的杂交瘤细胞.以真核表达载体转染CHO细胞后,筛选单细胞表达克隆,将真核表达产物与用原核表达产物为免疫原制备的mAb反应.结果:从患者血清标本中扩增出了1 665 bp长的DNA,测序结果证实为vp2基因.将该基因克隆至原核表达载体中后,在大肠杆菌中获得了表达.表达产物经SDS-PAGE后,在Mr约为6 000处可见1条明显的表达带.Western blot的结果表明,该电泳带与B19患者的血清呈特异性免疫反应.以从SDS-PAGE凝胶中回收的表达产物为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、克隆化,获得2株分泌特异性的抗VP2 mAb的杂交瘤细胞.以这2株杂交瘤细胞制备的腹水可与SDS-PAGE凝胶Mr 6000的蛋白条带也出现很强的免疫反应.用ELISA证明以Vp2基因真核表达载体转染的CHO培养上清,也与筛选到的mAb呈阳性反应.结论:成功地制备抗VP2的mAb,为进一步研制可用于B19病毒感染早期免疫诊断试剂盒奠定了基础.
作者：黄庆生；薛小平 刊期： 2005年第05期
目的: 分析纯化前后正常人血清IgG类抗角蛋白自身抗体对角蛋白的反应型式,探讨血清非IgG成分对自身AK autoAbs结合特性的影响.方法: 用间接ELISA检测正常人血清IgG类AK auto Abs纯化前后的滴度,Westernblot检测全血清和纯化IgG对自身角蛋白的反应特征.结果: 纯化前不同个体血清中IgG类AK auto Ab的滴度差异很大,反应型式高度异质;纯化后IgG的AK auto Ab滴度较纯化前明显升高.Western blot分析显示纯化后的IgG类AK autoAb识别的角蛋白成分条带增加,反应性增强,且个体之间的反应型式趋于一致.结论: 血清中IgG类AK autoAbs的反应型式受一些非IgG成分不同程度的影响; 个体之间高度一致的反应型式提示产生IgG类AK autoAbs的B细胞在发育过程中可能受正常机体一组自身抗原(角蛋白)的选择,而与机体接触的外来抗原无关.
作者：党育平；李巍；李承新；夏汝山；孙林潮；刘玉峰 刊期： 2005年第05期
目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响.方法:①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达.②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量.结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24 h、 48 h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、 5.64%)(P<0.05).②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8 h、 24 h、 48h释放PDGF的量(1 593、 2 625、 2 175 ng/L)明显高于正常孕妇组(235、 405、 133.5ng/L)差异显著(P<0.01).③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24 h、 48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3 266、 2 360 ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05).结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放.
作者：李常玲；许瑞环；张洪德；尹学念 刊期： 2005年第05期
细胞与分子免疫学杂志
主管:中国免疫学会；第四军医大学
主办：陕西省免疫学会,中国免疫学会
