学术投稿

乙型肝炎核心抗原基因的合成及其原核表达载体的构建

王丽;刘金波;段春燕;龚舒;何涛

关键词:乙型肝炎病毒核心抗原, 基因合成, 定点突变, 原核表达
摘要:目的:合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因并构建原核表达载体.方法:根据大肠杆菌偏嗜性密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条相互重叠的寡核苷酸片段,采用PCR法扩增获得完整的HBcAg基因,经BamH I和Xho I双酶切后定向克隆到pET30a(+),得pET30a(≠)-HB-cAg,经PCR扩增、酶切及测序鉴定后,定点突变法改正错误位点.之后将重组子转入BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western Blot检测蛋白抗原性.结果:成功构建了重组质粒pET30a(≠)-HBcAg,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌表达,表达效率64%左右;Wesbern Blot显示表达产物具有较好的抗原性.结论:成功合成HBcAg基因并构建了原核表达载体.
郑州大学学报(医学版)杂志相关文献
  • 舒芬太尼靶控输注辅助颈丛阻滞甲状腺手术效果

    目的:比较舒芬太尼靶控输注(TCI)及恒速输注辅助颈丛阻滞甲状腺手术的镇痛镇静效果.方法:80例ASA I~Ⅱ级的择期甲状腺手术患者随机分为2组:舒芬太尼TCI组(A组)和舒芬太尼恒速输注组(B组),每组40例.颈丛神经阻滞后,A组手术开始前5 min启动舒芬太尼TCI,初始效应室浓度为0.15ug/L,术中随时调整目标浓度.B组手术开始前5 min给予负荷剂量舒芬太尼0.1ug/kg,然后以0.1 ug/(kg·h)起始速率恒速输注,根据患者情况调整输注速率,每次递增或递减0.02-0.03ug/(kg·h).监测2组麻醉前(T0)、颈丛阻滞后5 min(T1)、手术开始后5 min(T2)、手术开始后30 min(T3)、术中牵拉明显时(T4)及手术结束时(T5)的平均动脉压、心率、呼吸和脉搏氧饱和度,观察镇静镇痛程度.记录呼吸抑制、恶心呕吐等不良反应发生情况.结果:2组均获得满意的镇痛镇静,无不良反应发生,A组镇静评分(2.17±0.36),B组为(2.28±0.43),2组间差异无统计学意义(t=1.24,P=0.267).2组平均动脉压、心率、呼吸及脉搏氧饱和度比较差异无统计学意义(F组间=0.33、0.89、1.80和'0.01,P均>0.05),但时间点间比较除脉搏氧饱和度(F时间=0.50,P>0.05)外,平均动脉压、心率及呼吸差异均有统计学意义(F时间=3.64、6.01和4.96,P均<0.05).与T0时间点比较,2组T1时间点的平均动脉压、心率和呼吸均增高(P均<0.01);B组T2时间点的心率、T4时间点的平均动脉压、心率、呼吸仍增高,T2时间点的平均动脉压降低(P均<0.01).结论:舒芬太尼TCI辅助颈丛阻滞用于颈部手术安全有效.镇痛良好,较恒速输注血液动力学更稳定,呼吸抑制少,值得推广应用.

    作者:孙振涛;韩雪萍;王勇;徐广;田丹丹 刊期: 2009年第06期

  • 平顶山市中、小学学生血脂现状调查

    目的:了解平顶山市9~15岁学生血脂现状,为从儿童期开始心、脑血管病的早期预防积累基础资料.方法:采用全自动生化分析仪对平顶山市某中学、小学共239名学生进行血脂测定.结果:男生总胆同醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平依次为(3.44±0.84)、(0.91±0.33)、(1.12±0.26)及(1.68±0.49)mmol/L,女生依次为(3.65±0.63)、(1.02±0.30)、(1.18±0.23)和(1.88±0.68)mmol/L,女生TC、TG、LDL-C水平高于男生(t分别为2.17、2.69、2.62,P均<0.05),男女之间HDL-C水平差异无统计学意义(t=1.88,P:0.05).TG、LDL-C水平与年龄呈正相关(r:0.50、0.59,P均<0.001),HDL-C与年龄呈负相关(r=-0.55,P<0.001).结论:血脂水平与年龄有关,该地区儿童健康状况应引起重视.

    作者:赵星梅;张丽丽;张德甫 刊期: 2009年第06期

  • 无症状HIV感染者HIV共受体及其配体趋化因子的检测

    目的:检测无症状HIV感染者HIV共受体CCR5、CXCR4在T淋巴细胞表面的表达以及CCR5、CXCR4的配体MIP-1 a、RANTES和SDF-1在血清中的水平.方法:设立无症状HIV感染组(n=50)和HIV未感染对照组(n=40),采用ELISA方法检测血清中趋化因子MIP-1a、RANTES和SDF-1水平,流式细胞术分析CCR5、CXCR4在T淋巴细胞胞表面的表达情况.结果:与对照组相比,感染组血清中MIP-1a和RANTES水平升高(t分别为2.225、2.706,P<0.05),SDF-1水平无变化(t=1.832,P>0.05).感染组CD4+和CD8+T细胞表面CCR5的表达高于对照组(t分别为11.740、2.157,P<0.05),而感染组CD4+和CD8+T细胞表面CXCR4的表达下降(t分别为2.689、2.756,P0.05).结论:无症状HIV感染者HIV共受体的表达及其配体趋化因子水平均发生明显改变,2者的变化未呈明显的关联性.

    作者:沈燕;李进香;王喜英;徐翠英 刊期: 2009年第06期

  • 内皮祖细胞自体移植联合阿托伐他汀治疗大鼠急性心肌梗死效果观察

    目的:探讨内皮祖细胞(EPCs)自体移植联合阿托伐他汀治疗对急性心肌梗死(AMI)大鼠心功能的影响.方法:30只SD大鼠随机分为心肌梗死对照组(组I)、单纯EPCs移植组(组Ⅱ)和阿托伐他汀联合EPCs移植组(组Ⅲ).每组10只.大鼠无菌心脏采血,应用密度梯度离心法分离单个核细胞,体外培养,获得较纯的EPCs.3组大鼠均结扎左冠状动脉前降支,制造大鼠AMI模型.组Ⅱ、组Ⅲ在模型制备后,于梗死周边庆注射5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的EPCs,组I注射等量培养液.24 h后.组III以阿托伐他汀50 mg/(kg·d)灌胃.8周后观察大鼠心功能及血流动力学指标的改变,并以免疫组化方法检测心肌组织内EPCs及修复情况.结果:8周后,3组左室短轴缩短率、射血分数、左室收缩压、左室舒张末压及压力变化速率大值比较,差异均有统计学意义(F分别为95.7、296.5、844.9、67.6、127.0,P均<0.001).组Ⅲ大鼠心功能及血流动力学指标较组Ⅱ和组I改善(P均<0.05),缺血区域的移植细胞部分分化为血管内皮细胞.组I大鼠心肌组织结构紊乱,心肌细胞被瘢痕组织替代;组Ⅱ和组III心肌结构排列明显有序.结论:EPCs移植联合阿托伐他汀治疗AMI效果优于单纯EPCs移植.

    作者:梁鹍;牛颖;魏经汉 刊期: 2009年第06期

  • 获得性凝血因子XⅢ缺乏症2例治疗体会

    获得性凝血因子XⅢ(F XⅢ)缺乏是一种罕见的出血性疾病,常规的筛选试验如血小板计数(PLT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血小板功能试验、纤维蛋白原测定(Fbg)、凝血酶凝固时间和血管性假血友病(vW病)的检查结果都在正常范围[1].

    作者:刘延方;赵丽颖;赵晓明;张晓丽 刊期: 2009年第06期

  • 膳食因素与肺癌关系的病例对照研究

    目的:探讨膳食及其相关因素与肺癌的关系.方法:应用病例对照研究的方法,选取开封县原发性肺癌病例130例,按性别、年龄1:1配对选取正常对照,问卷调查收集研究对象的一般情况、膳食摄入及相关情况,应用秩和检验和X2检验进行单因素分析,应用logistic回归进行多因素分析,计算OR值及其95%可信区间(CI),筛选出肺癌的主要相关因素.结果:单因素分析发现8个暴露因素与肺癌发生有关;多因素分析发现饮食不规律(OR=5.032.95%CI 1.516-16.640)、肿瘤家族史(OR=8.569,95%CI 0.852-82.189)可能是肺癌的危险因素,经常摄人大米(OR:0.390,95%CI 0.156-0.977)、体质指数大(OR=0.323,95%CI 0.122-0.879)及家庭月人均收入高(OR=0.394,95%CI 0.164-0.945)为肺癌的保护因素.结论:膳食及其相关因素中肺癌的保护因素和危险因素并存,合理膳食、规律饮食、保持理想的BMI和发展经济有助于降低肺癌的发生.

    作者:刘艳华;王玲;王彦平;耿振新;马师;陆维权;吕全军 刊期: 2009年第06期

  • 儿童左室假腱索48例分析

    目前认为,左室假腱索(LVFT)为一种心内正常解剖结构的变异或心脏正常结构的一部分,而与各种器质性心脏病无确切的关系,其超声检出率各家报道不一,可高达75%[1-2],造成差异的原因可能与检查者的操作技术、应用仪器的分辨率和年龄有关.

    作者:张强;乔鹏;杨丽红;苑小壮;王艳;肖海萍 刊期: 2009年第06期

  • 郑州市某体检人群血脂异常相关因素分析

    目的:调查分析血脂异常相关因素.方法:对郑州市某体检人群263人进行血脂测定及膳食和生活习惯问卷调查,对调查结果进行单因素分析及logistic回归分析.结果:血脂异常率为45.2%,不同年龄组血脂异常率不同(X2=8.467,P=0.014);每目饮酒量、体质指数(BMI)不同组之问血脂异常率不同(X2=12.550,P<0.001;X2=11.182,P<0.001);logistic回归分析结果显示,BMI≥24 kg/m2、过量饮酒及年龄≥45岁为血脂异常的危险因素.结论:可通过调整膳食、控制体质量、建立良好的生活方式,减少血脂异常的发生.

    作者:曹磊;韩洁;吕全军 刊期: 2009年第06期

  • 结肠癌组织中canstatin mRNA的表达

    目的:检测canstatin mRNA在结肠癌组织中的表达情况.方法:采用RT-PCR检测结肠癌、相应癌旁和远癌组织各40例中canstatin mRNA的表达情况.结果:癌组织中canstatin mRNA相对表达量为(0.47±0.14),低于癌旁组织的(0.58±0.18)和远癌组织的(0.62±0.21)(F=4.075,P=0.03);canstatin mRNA在低分化癌组织中的相对表达量为(0.44±0.20),低于中分化组织的(0.59±0.25)和高分化组织的(0.63±0.09)(F=3.121,P=0.04),canstatin mRNA表达与结肠癌Dukes分期、淋巴结有无转移、患者性别及年龄均无关(F或t分别为1.012、1.961、1.661和2.011,P均>0.05).结论:canstatin mBNA在结肠癌组织中低表达,町能在结肠癌的发生发展中发挥重要作用.

    作者:于泳;唐芙爱;马军;卢高峰;刘霞;李智;张健;ZHANG Jian 刊期: 2009年第06期

  • 河南汉族人群血小板膜糖蛋白I ba基因Kozak序列多态性与缺血性脑血管病的关联性

    目的:探讨河南地区汉族人群血小板膜精蛋白(GP)I ba Kozak序列基因多态性与缺血性脑血管病的关联性.方法:采用PCR-RFLP方法对缺血件脑血管病组(228例)和健康对照组(235例)进行Kozak序列多态性分析.结果:缺血性脑血管病组CC基冈型频率为8.8%,C等位基因频率为29.2%,均高于对照组的4.3%和23.2%(X2=3.896,P=0.048;X2=4.281,P=0.039).结论:GP I ba基冈Kozak序列多态性可能与河南汉族人群缺血性脑血管病的发生相关.

    作者:石磊;许予明;王五洲;宋波;王海珍;杜冉;张华;郑红 刊期: 2009年第06期

  • 氟甲砜霉素人工抗原的合成与鉴定

    目的:制备氟甲砜霉素(FF)的佳人工抗原并鉴定.方法:采用琥珀酸酐将FF的羟基活化后制备出半抗原氟甲砜霉素半琥珀酸(FF-HS),并经质谱(MS)鉴定合成成功.采用碳二亚胺法将FF-HS与牛血清白蛋白(BSA)偶联,采用混合酸酐法将FF-HS与卵清白蛋白(OVA)偶联,采用羰基二咪唑法将FF直接与BSA偶联,制备了3种人工抗原(FF-HS-BSA、FF-HS-OVA和FF-BSA).采用紫外吸收光谱分析和动物免疫实验(3种偶联物选择前2种分别作为免疫原与包被原进行抗血清制备及ELISA实验)鉴定3种人工抗原.结果与结论:紫外吸收光谱分析初步证实3种人工抗原合成成功.在动物免疫实验中FF-HS-BSA与FF-HS-OVA得到了效价较高的特异性抗体,IC50分别为150、300ug/L.FF-BSA免疫原免疫效果不理想.

    作者:曾华金;李楠;屈凌波;孙武勇;师明霞 刊期: 2009年第06期

  • 志贺菌6种毒力基因的多重PCR检测

    目的:建立志贺菌6种毒力基因[志贺菌肠毒素I基因(setl)、志贺菌肠毒素2基因(sen)、侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、侵袭相关蛋白基因(ial)、志贺毒素1基因(stxl)及调控基因(virA)]的多重PCR鉴定方法,实现多基因的同时检测.方法:选掸志贺菌的6种毒力基因作为靶基因,以A群和C群4株标准及B群和D群4株临床分离株为模型,应用降落PCR方法在1个反应管中同时进行扩增,根据扩增片段大小定性判断结果.通过样本倍比稀释检验多重PCR的灵敏性,并在NCBI网站上用BLAST检索各引物的特异性.另选取河南省2001年至2007年115株志贺菌进行多重PCR检测,以验证多重PCR的可行性.结果:多重PCR能同时检测上述6种毒力基因,与单基因PCR分别检测6种毒力基因相比具有相近的灵敏度与特异性.应用多重PCR方法检测115株志贺菌,除stxl外,其余5种毒力基因的阳性率均在85%以上.结论:多重PCR鉴定志贺菌毒力基因具有简便、快速的特点,适用于毒力基因鉴定和流行病学调查研究.

    作者:徐兰英;许汴利;马宏 刊期: 2009年第06期

  • 尼可刹米对新生大鼠海马神经元钠通道的影响

    目的:观察尼可刹米对新生大鼠海马神经元电压依赖性钠通道的影响.方法:制备大鼠海马脑组织切片,灌流含5 mg/L尼可刹米的人工脑脊液,应用全细胞膜片钳技术记录给药前、给药后10 min脑组织切片海马神经元电压依赖性钠电流,绘制给药前后钠通道的钠电流一测试电压(I-V)曲线、稳态激活曲线和稳态失活曲线.结果:尼可刹米在脑电位-50-+20 mV范围内增大钠电流.尼可刹米使钠通道稳态激活曲线中钠通道半数激活电压由(-34.6±3.07)mV变为(-37.63±3.37)mV(t=3.38,P=0.02),曲线向超极化方向变化;尼可刹米使钠通道的稳态失活曲线中钠通道半数失活电压由(-43.36±3.06)mV变为(-33.24±2.05)mV(t=6.13,P=0.002),曲线向去极化方向变化.结论:增加电压依赖性钠电流可能是尼可刹米兴奋中枢神经元的作用机制之一.

    作者:千智斌;姬明丽;宋晓荣 刊期: 2009年第06期

  • 豫医无毛小鼠无毛基因突变部位的定位和分析

    目的:研究豫医无毛小鼠(YYHL)突变的分子机制.方法:对豫医无毛小鼠和昆明小鼠的基因组DNA进行PCR扩增,对扩增片段克隆后测序,并与Mus muscnlus进行同源性分析.结果:共测出YYHL DNA序列1 824bp和昆明小鼠DNA序列1816 bp,其不同之处有27处,变异方式包括插入、缺失和点突变.其中在12外显子中有一无义突变(G→A),导致该部位由编码色氨酸的UGG转变为终止密码子UGA.结论:YYHL无毛性状的产生可能与基因组的变异有关.

    作者:臧文巧;杨璇;王涛;轩小燕;李敏;杜英 刊期: 2009年第06期

  • 雷帕霉素靶蛋白RNA干扰联合雷帕霉素对人食管癌移植瘤生长和移植瘤组织中雷帕霉素蛋白基因表达的影响

    目的:探讨RNA干扰技术联合雷帕霉素对人食管癌裸鼠移植瘤生长和移植瘤组织中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因表达的影响.方法:①构建裸鼠食管癌ECI细胞移植瘤模型,待肿瘤长出1周后,将荷瘤小鼠随机分为雷帕霉素治疗组[(腹腔注射雷帕霉素,50ug/(kg·次)]、mTOR小分子干扰RNA(siRNA)治疗组[腹腔注射mTOR siRNA,3ug/次]和联合治疗组(先腹腔注射mTOR siRNA,第2天腹腔注射雷帕霉素),另设空白对照组(腹腔注射PBS代替药物)和顺铂治疗组[腹腔注射常规化疗药顺铂,1 mg/(kg·次)];每组各5只.连续治疗2周,治疗结束取瘤组织,分析治疗前后移植瘤体积的变化.②采用免疫组化及原位杂交技术观察各组瘤组织中mTOR蛋白及mRNA的表达.结果:①单用雷帕霉素(F=185.00,P<0.001)或mTOR siRNA(F=199.01,P<0.001)均能降低裸鼠移植瘤体积;雷帕霉素和mTOR siRNA有交互作用(F=30.30,P<0.001),2者联合应用后,裸鼠移植瘤体积有更大幅度的下降.顺铂治疗后,裸鼠移植瘤体积与联合治疗的效果差异无统计学意义(t=0.426,P:0.682).②单用雷帕霉素(F=395.76,F=550.04,P均<0.001)或mTOR siRNA(F=367.58,F=573.39.P均<0.001)均能降低裸鼠移植瘤组织中mTOR蛋白及mRNA的表达;雷帕霉素和mTOR siRNA有交互作用(F=11.68,P=0.004:F=10.23,P=0.006),2者联合应用后,裸鼠移植瘤组织中mTOR蛋白及mRNA的表达有更大幅度的下降.顺铂治疗后,裸鼠移植瘤组织中mTOR蛋白(7.15±0.56)及mRNA(6.88±0.59)的表达与联合治疗的效果差异无统计学意义(t=0.622,P=0.551;t=0.572,P=0.583).结论:应用RNA干扰技术沉默mTOR基因及应用雷帕霉素治疗均可有效抑制肿瘤的生长,下调裸鼠食管癌移植瘤组织中mTOR蛋白及mRNA的表达,且2者联合效果佳.

    作者:陈玉;亚国伟;张威;陈奎生 刊期: 2009年第06期

  • 乙型肝炎核心抗原基因的合成及其原核表达载体的构建

    目的:合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因并构建原核表达载体.方法:根据大肠杆菌偏嗜性密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条相互重叠的寡核苷酸片段,采用PCR法扩增获得完整的HBcAg基因,经BamH I和Xho I双酶切后定向克隆到pET30a(+),得pET30a(≠)-HB-cAg,经PCR扩增、酶切及测序鉴定后,定点突变法改正错误位点.之后将重组子转入BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western Blot检测蛋白抗原性.结果:成功构建了重组质粒pET30a(≠)-HBcAg,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌表达,表达效率64%左右;Wesbern Blot显示表达产物具有较好的抗原性.结论:成功合成HBcAg基因并构建了原核表达载体.

    作者:王丽;刘金波;段春燕;龚舒;何涛 刊期: 2009年第06期

  • 吻合器痔上黏膜环切术前肠道准备方法改良90例观察

    吻合器痔上黏膜环切术(procedure for prolapse and hemorrhoids,PPH)是目前治疗重度痔的首选方法.肠道清洁程度直接关系到PPH能否顺利完成及其手术效果.

    作者:冯江雪;武玉娟;石玉兰;陈爱霞 刊期: 2009年第06期

  • 小鼠Ar18a基因逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a的构建

    目的:克降小鼠Ar18a(mAr18a)cDNA,构建带有检测标签的逆转录病毒载体系统,并检测由该病毒系统介导的mAr18a基因在骨髓来源树突状细胞中的表达.方法:从培养的小鼠骨髓来源树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出mAr18a基因片段,再将其克隆入pDrive克隆载体并测序.然后将mAr18a目的基因插入逆转录病毒载体MSCV-GFP中,以磷酸钙法转染294T包装细胞,收集病毒卜清感染树突状细胞后,通过流式细胞术检测mAr18a的表达.结果与结论:成功克隆了mAr18a的cDNA,并成功构建其重组逆转录病毒载体MSCV-GFP-Ar18a,该载体可有效将Ar18a基因转移到骨髓米源的树突状细胞中,转染效率达28.3%.

    作者:唐蓓 刊期: 2009年第06期

  • 腺病毒介导的干扰素-β基因对SMMC-7721细胞凋亡的影响

    目的:观察腺病毒介导的干扰素-β(IFN-β)基因能否诱导人肝癌SMMC-7721细胞体外凋亡.方法:用HEK293A细胞扩增重组腺病毒介导的人干扰素-β(AdhlFN-β)基因,经纯化后用空斑形成实验法测定病毒滴度;分别用AdhIFN-β基因和重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白(AdGFP)基因转染人肝癌SMMC-7721细胞.并设空白对照组.应用免疫细胞化学方法检测hIFN-β基因的表达,应用Hochest 33342荧光染色法和流式细胞术检测转染重组AdhIFN-β基因组、空载体组和对照组细胞的凋亡情况.结果:重组腺病毒经HEK293A细胞扩增、纯化后滴度可达2×1011 pfu/mL,且40 MOI的腺病毒即可获得95%以上的转染效率;免疫细胞化学法检测到外源性hIFN-β基因在SMMC-7721细胞中的蛋白表达产物;荧光染色法检测到重组AdhIFN-β基因组细胞明显发生了凋亡,而重组AdGFP组和空白对照组细胞凋亡不明显;流式细胞术检测到转染重组AdhIFN-β基因组细胞凋亡率[(28.27±4.21)%]高于转染空载体组[(2.08±0.89)%]和对照组[(1.53 4±0.70)%](F=377.625,P<0.001),后2组细胞凋亡率比较差异无统计学意义.结论:腺病毒介导的hIFN-β基因能诱导体外肝癌细胞发生凋亡.

    作者:高红伟;李印;郭长青;马军;张丽荣;曹新广;于泳 刊期: 2009年第06期

  • 颞骨外段面神经干的解剖学定位

    目的:探讨颢骨外段面神经干的定位方法.方法:对10例(20侧)成人头颅湿标本用上颈段侧方入路进行逐层解剖,观测颢骨外段面神经干与周围结构的毗邻关系.结果:颞骨外段面神经干位置恒定、暴露清晰,外耳道软骨尖距离面神经干(9.60±1.64)mm,鼓乳切迹内侧(12.26 4±2.14)mm为面神经干.结论:外耳道软骨尖、鼓乳切迹、二腹肌后腹及腮腺后上缘可作为颞骨外段面神经干的定位标志.

    作者:韩云志;娄卫华;游言文;陈四清 刊期: 2009年第06期

郑州大学学报(医学版)杂志

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