学术投稿

PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

白志军;张丽芸;林佐贤;卢晓;陈政良

关键词:甘露聚糖结合凝集素, 表达载体, CHO细胞
摘要:目的构建PcDNA4/His C-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL).方法应用PCR从含有中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/His C真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性.结果从pGEM-MBL中扩增得到约750 bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5 100和750 bp片段,测序鉴定与预期的完全一致.RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58 000和87 000条带,其中29 000蛋白带可与6-His抗体反应.纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1:819 200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1:25 600.结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件.
南方医科大学学报杂志相关文献
  • L-精氨酸对兔右冠状动脉缺血再灌注时窦房结功能及房室结传导有效不应期的干预作用

    目的观察L-精氨酸(L-Arg)对兔右冠状动脉缺血再灌注(IR)窦房结(SAN)传导时间(SACT)和恢复时间(SNRT)及房室结(AVN)传导有效不应期(AVERP)的影响.方法在体成年兔右冠状动脉缺血再灌注模型分4组:正常对照组,IR(缺血90 min,再灌注90 min)+生理盐水组,IR+L-Arg组和IR+左型精氨酸甲酯(L-NAME)组.在不同时相分别测定各组心房快速起搏或程序电刺激后的SACT、SNRT和AVERP.结果IR+L-Arg组缺血期及再灌注早期3项指标均有不同程度的下降,而再灌注后期升高;IR+L-NAME组结果却基本相反(P<0.01).3组组内比,IR+L-Arg组和L-NAME组于缺血期与再灌早期3项指标均升高;再灌注后期,IR+L-Arg组无治疗意义甚至加重SAN和AVN损伤,而IR+L-NAME组3项指标下降.结论随着缺血时间延长SAN功能损伤加重;早期再灌注损伤敏感;组织内适当补充L-Arg,于缺血期和再灌早期对SAN电生理功能和AVERP恢复是有益的,于再灌注后期可能加重损伤.

    作者:王庆志;戴景兴;韩培立;原林 刊期: 2004年第08期

  • PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

    目的构建PcDNA4/His C-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL).方法应用PCR从含有中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/His C真核表达载体.经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性.结果从pGEM-MBL中扩增得到约750 bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5 100和750 bp片段,测序鉴定与预期的完全一致.RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58 000和87 000条带,其中29 000蛋白带可与6-His抗体反应.纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1:819 200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1:25 600.结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件.

    作者:白志军;张丽芸;林佐贤;卢晓;陈政良 刊期: 2004年第08期

  • P糖蛋白功能抑制对耐药肿瘤细胞MCF-7/Adr放射敏感性的影响

    目的探讨P糖蛋白(P-gp)对肿瘤细胞放射敏感性的调控效应.方法以经与未经维拉帕米处理的MCF-7/Adr细胞分别作为抑制和对照组,运用流式细胞仪检测X射线照射后不同时间点细胞凋亡率和线粒体膜电位(△ψm)的动态变化.结果抑制组细胞在X射线照射后6、12、24 h细胞凋亡率分别是25.53%±2.85%、30.43%±2.21%、39.03%±2.60%,对照组分别是16.13%±1.16%、21.73%±1.31%、27.53%±2.55%;抑制组在6、12、24 h的△ψm平均荧光强度值分别是75.27±4.90、96.47±5.59、57.77±2.55,对照组分别是54.17±4.05、62.30±5.93、39.53±2.65.各时间点抑制组的细胞凋亡率和△ψm平均荧光强度值均明显高于对照组(P<0.01).抑制组经X射线照射后24 h细胞凋亡率高(F=47.870,P=0.000).照射后12 h平均荧光强度值高(F=74.485,P=0.000).结论抑制MCF-7/Adr细胞的P-gp功能上调了细胞的放射敏感性,这可能与线粒体膜电位改变有关.

    作者:余志坚;陈俊;袁亚维;肖明星;陈春 刊期: 2004年第08期

  • 中医阴阳数字模型

    目的建立中医阴阳数字模型.方法采用计算机二进制数字语言解构和重建中医阴阳理论.结果建立了中医阴阳二进制数字模型并成功模拟了中医阴阳理论的主要内容.结论可以通过二进制数字语言对中医理论进行合理解构和重建,实现中医药理论的数字化.

    作者:秦建增;陈宝田 刊期: 2004年第08期

  • 指尖离断再植32指报告

    目的介绍指尖离断再植的手术方法和治疗经验.方法根据指尖的解剖学特点和离断指尖血管的损伤情况,对26例32指灵活采用同时吻合动静脉、仅吻合动脉、静脉动脉化及动静脉转流的方法进行再植,并对再植手指进行一体化功能康复治疗.结果32指共成活29指,成活率为90.06%.经4个月~5年的随访,29指外形与功能良好,按照中华医学会手外科学会断指再植功能评定试用标准评定均为优.结论采用正确的手术方法并进行一体化功能康复治疗,不仅可使指尖再植获得较高的成活率,而且可恢复良好的外形与功能.

    作者:任高宏;裴国献;顾立强;郭钢 刊期: 2004年第08期

  • 大肠埃希菌所致泌尿生殖系感染的细菌耐药分析

    目的对导致泌尿生殖系感染的大肠埃希菌对抗菌素的耐药趋势进行调查分析.方法应用纸片扩散法(K-B法)对分离的148株大肠埃希菌进行药敏测试与分析,并用纸片扩散法对β-内酰胺酶(ESBLs)菌株作确认试验.结果对28种抗生素的耐药检测结果显示,大肠埃希菌对青霉素类和喹诺酮类抗生素耐药率达73.6%~86.4%;对一代、二代头孢菌素(头孢拉啶、头孢唑啉、头孢克洛)耐药率在44%以上;对三代头孢菌中的头孢他啶耐药率低,为10.1%;对哌拉西林、头孢哌酮和氨苄西林的耐药率为84.5%、44.6%、83.0%;对含酶抑制剂的复合β-内酰胺类抗生素的耐药率(哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和氨苄西林/舒巴坦为4.1%、10.8%和52.0%)要明显低于单剂型的同种抗生素,抗菌敏感率均有不同程度的提高(P<0.001).148株大肠埃希菌中,产ESBLs菌株有38株(25.7%),不产ESBLs菌株有110株(74.3%).产ESBLs菌株对多种抗生素的耐药率显著高于不产ESBLs的菌株(P<0.05).结论对于治疗因大肠埃希菌引起的泌尿生殖系感染,应该根据实验室的药敏和ESBLs的检测结果来指导合理用药,以提高治疗效果.呋南妥因和含酶抑制剂的β-内酰胺类抗生素比较有效.

    作者:崔伟历;徐德兴;李文玲;王露霞 刊期: 2004年第08期

  • 鼻咽癌调强放疗和常规放疗受照剂量对比分析

    目的研究鼻咽癌常规放疗和调强放疗(IMRT)受照剂量的差异.方法用放疗计划系统分别进行鼻咽癌常规放疗和调强放疗计划设计,计算肿瘤量70 Gy时正常组织受照剂量-体积直方图和所需照射的总跳数.用X射线能量为6MV的加速器实施放疗计划.根据方野散射线和漏射线剂量率的测量值和总跳数,估算射野外不同距离正常组织所受辐射剂量.结果调强放疗射野内正常组织受照剂量低于28 Gy的体积是常规放疗的1.43~1.81倍,而高于35 Gy时,受照体积仅为常规放疗的0.73~0.30倍;射野外正常组织所受散射线和漏射线照射剂量的估计值约为常规放疗的2倍.结论鼻咽癌常规放疗与调强放疗相比,正常组织受照剂量和受照体积具有成倍差异,调强放疗漏射线和散射线是常规骀放疗的2倍.

    作者:张书旭;徐海荣;林生趣;李文华 刊期: 2004年第08期

  • 高压交变电磁场对脑卒中康复的影响

    目的探讨高压交变电磁场对脑卒中病人康复治疗的临床治疗的效果及机制.方法选择脑卒中病人115例,分为治疗组55例和对照组60例,对比分析治疗前后患者血清脂蛋白及其亚组分和血液流变学指标的变化,以Barthel指数和功能独立性评定法(FIM)进行康复评定.结果治疗组显效29例;好转24例,无效2例,与对照组比较P<0.05;治疗后血清甘油三酸酯(TG)、总胆固醇(Tc)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)降低,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)浓度升高,Tc/HDL-c、LDL-c/HDL-c比率降低,降低了全血和血浆粘度,与对照组比较P<0.01;治疗组患者的Barthel指数增加了(38.4±5.3),与对照组比较P<0.05;治疗组患者的FIM评分与对照组比较增加了(34.7±5.3),与对照组比较P<0.0l;治疗组患者一年内脑卒中再发率下降明显,与对照组比较P<0.05.结论高压交变电磁场能改善脂蛋白代谢,改变血液流变学性质,提高脑卒中患者ADL能力及功能独立性,对脑血管疾病有显著的防治作用.

    作者:邓爱文;袁雪光;魏东;张建宏;冉春风;王敏 刊期: 2004年第08期

  • 洛拉曲克对胸苷酸合成酶蛋白质表达水平的动态影响

    目的研究洛拉曲克作用后不同细胞胸苷酸合成酶(TS)蛋白质表达水平的动态变化有无差异.方法时间曲线中,LoVo、Lo2细胞分别用浓度为10、75μmo1/L(接近各自的IC90值)的洛拉曲克处理0~60h.剂量曲线中,洛拉曲克作用时间36h,LoVo细胞剂量范围0~40μmol/L.Lo2细胞剂量范围0~125μmol/L.分别以流式细胞术法、Westemblot法检测两种细胞TS蛋白表达水平.结果两种细胞在经过洛拉曲克处理后,TS表达的时间和剂量曲线具有显著不同的动态规律.在时间曲线中,LoVo细胞TS蛋白的表达水平与对照相比呈持续升高的趋势,Lo2细胞TS蛋白的表达水平与对照相比先降低,24 h后TS蛋白表达水平逐渐回升,但至60 h尚未恢复至对照水平.在剂量曲线中,LoVo细胞TS蛋白的表达水平的变化呈峰形,以IC90值附近为高,Lo2细胞TS蛋白的表达水平,在低于IC90值的剂量点TS蛋白水平降低程度相似,高于IC90值的剂量处理后TS水平随剂量的升高而下降.结论洛拉曲克可以产生TS诱导现象,不同细胞在洛拉曲克作用后TS动态表达的差异是细胞耐药性不同的原因之一.

    作者:李亦蕾;吴曙光 刊期: 2004年第08期

  • 人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

    目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子.方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coli B121(Gold)中,诱导表达survivin蛋白.通过DEAE SepharoseFastFlow离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白.用Western blotting检测表达产物.结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coli B121(Go1d)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在.通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上.Western blotting证明表达产物具有特异性.结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具.

    作者:别俊;孙茂盛;孙强明;郑建平;孙雯佳 刊期: 2004年第08期

  • 亚低温对颅脑损伤颅内压及脑氧代谢影响的研究

    目的探讨重型脑损伤患者亚低温(33~35℃)治疗前后颅内压(ICP)、脑组织氧分压(PO2)的变化及临床意义.方法32例重型颅脑损伤患者分为亚低温组及对照组,放置ICP脑组织PO2光纤探头,持续监测ICP及脑组织PO2.结果亚低温治疗24h后ICP逐渐下降,脑组织PO2逐渐上升,与对照组比较差异有显著性(P<0.05).结论亚低温治疗能明显降低重型颅脑损伤患者ICP,改善脑组织氧代谢,使患者死亡率及致残率降低.

    作者:林源泉;贾军;刘文锋;张浚 刊期: 2004年第08期

  • 高龄患者人工髋关节置换术前评估

    采用回顾性分析对31例75岁以上高龄人工髋关节置换术患者进行术前常规检查和特殊检查,对合并其他脏器疾病的情况进行分类汇总,予以相应的术前内科治疗.结果表明,对高龄患者进行准确的术前评估,积极控制其并发疾病,使人工髋关节置换术取得良好疗效.

    作者:禹旭 刊期: 2004年第08期

  • 广东地区围绝经期妇女健康状况和需求调查

    目的了解广东地区围绝经期妇女的健康状况和健康需求,从而进一步探索围绝经期、老年期保健模式和方法,为政府部门提供决策依据.方法采取分层整群抽样的方法,将广东省按地理地貌分为5层,共抽取了5个地级市(代表城市)和4个县级市(代表农村).对40~65岁的4 500个围绝经期妇女进行调查.结果广东地区妇女自然绝经年龄48.6岁,其中城市48.9岁、农村48.3岁.现患病率39%,其中城市38.5%、农村39.5%,两者比较无显著性差异.前6位现患疾病的顺位是骨关节疾病(12.5%)、高血压(9.2%)、子宫肌瘤(6.8%)、胃或十二指肠溃疡(5.2%)、心脏病(2.7%)和糖尿病(2.2%).骨关节疾病中膝关节疾病(34.3%)、腰椎疾病(32.8%)是高发病,骨折患病率2.5%.围绝期综合征的患病率为68.1%,为痛苦的症状是失眠、肌肉骨关节疼痛、烦躁、头晕,以心理症状(86.8%)和躯体症状(86.0%)为主;出现围绝经期综合征未就医者占71.2%,到妇产科就医者仅20.5%,以服用中药为主(53.9%),应用性激素疗法者1.4%(城市1.8%、农村1.0%).无健康体检者37.8%,有过健康体检者62.2%,其中城市80.4%、农村44.4%,城市明显高于农村.结论围绝经期综合征及相关疾病严重地影响围绝经期妇女的身心健康,这一人群的保健、医疗存在广泛需求,应该全方位地进行防治.

    作者:田丰莲;杨冬梓;张小庄;赵庆国;詹新林;李容汉;穆荔;江雪芳;李洁明 刊期: 2004年第08期

  • 湿热环境猫颅脑火器伤早期脑微循环及血脑屏障的变化

    目的研究湿热环境对猫颅脑火器伤早期脑微循环的影响,为临床治疗提供实验依据.方法24只成年猫用改良Carey法制作猫颅脑火器伤模型后,随机分为两组,每组12只,放入温度和相对湿度分别为25℃和50%,35℃和85%仿真模拟气候舱.通过脑微血管形态学及通透性和周围组织病理变化的观察,测定生命体征代偿指标、微血管中流动血液流变学特征和血脑屏障的变化来反应脑微循环的变化.结果全部动物无死亡.两组动物在脑微血管形态学及通透性和周围组织病理变化显著;在生命体征指标、血液流变学特征和血脑屏障的损害程度上存在显著差异.结论湿热环境对颅脑火器伤的早期脑微循环有显著影响,是颅脑火器伤的二次创伤.

    作者:马德选;徐如祥;朱红胜 刊期: 2004年第08期

  • 恶性腹膜间皮瘤的诊治体会

    目的探讨恶性腹膜间皮瘤的诊治方法.方法回顾分析16例恶性腹膜间皮瘤临床表现、实验检查及治疗方法.结果16例中术前确诊3例,剖腹探查10例,急诊手术1例,腹腔镜探查2例.随访12例,半年内死亡2例,2年内死亡7例,1例生存超过2年.另2例为近1年内患者,继续治疗中.结论恶性腹膜间皮瘤无特异性症状,诊断困难,误诊率高.诊断主要依据脱落细胞检查、腹腔穿刺活检、腹腔镜及剖腹探查.预后差,综合治疗有望延长患者生存期.

    作者:王浩;厉周;黄宗海 刊期: 2004年第08期

  • 1,25-二羟维生素D3对高危角膜移植急性排斥反应及角膜新生血管的影响

    目的研究药物1,25-二羟基维生素D3(二羟维D3)在高危角膜移植模型中对免疫排斥反应及新生血管生长情况的影响,揭示1,25-二羟维D3作为免疫抑制剂在角膜移植中的治疗作用及机制.方法建立大鼠高危角膜移植模型,按不同浓度的1,25-二羟维D3(1×10-5和1×10-7mol/L)及环孢霉素A(CsA)分组,连续用药2周,观察移植物排斥情况并于术后4、7、14 d取材行原位杂交等实验,分析各组细胞因子:白介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA水平的变化情况.结果在1,25-二羟维D3作用下,高危角膜移植物的存活时间明显延长;新生血管生长受抑制;合用CsA后效果更明显.原位杂交实验证实1,25-二羟维D3能显著抑制植片IL-1α、TNF-αmRNA表达(P<0.01);对VEGF表达无直接影响.结论1,25-二羟维D3能有效地抑制新生血管生长及角膜移植急排期的免疫哌排斥反应,机制可能包括对前炎症因子(IL-1α、TNF-α)生成的抑制作用,而对VEGF无明显直接作用.

    作者:党森涛;陆晓和;周瑾;白浪 刊期: 2004年第08期

  • 对专业不同满意程度军校医学生的心理健康状况及个性特征研究

    目的了解对专业不同满意程度军校医学生的心理健康状况及其人格特征.方法采用自编大学生一般情况调查问卷(其中一项是调查被试对录取专业的满意度)、症状自评量表(SCL-90)、艾森克个性问卷(EPQ),对4294名军校医学生进行测试和评定.结果对专业不同满意程度军校医学生在个性和心理健康水平上存在显著差异.军校医学生对专业的满意程度与个性因素和心理健康水平存在一定相关关系.结论人格特征表现为较内向、高神经质、高精神质的军校医学生更容易对专业不满意;对所学专业越不满意的军校医学生则表现出越多相应的心理问题.

    作者:刘欢欢;张小远;肖蓉;冯现刚 刊期: 2004年第08期

  • 日本血吸虫8k CaBP基因启动子区的克隆与分析

    目的克隆日本血吸虫8k CaBP(Sj8CaBP)基因启动子区并对该序列进行分析.方法提取日本血吸虫基因组DNA,并按ClontechUniversal Genome WalkerTM Kit的操作手册说明,建立日本血吸虫基因组DNA文库.根据手册要求及Sj8CaBP基因的cDNA序列,设计合成该基因染色体步移的特异性引物与试剂盒提供的端子引物进行巢式PCR.将得到的PCR产物克隆测序,测序结果用启动子区的分析软件及与其cDNA序列比对进行分析.结果得到的Sj8CaBP基因长度为1 079 bp(GenBank登录号AY262018),该基因包含Sj8CaBP基因完整的开放阅读框(ORF),包括1个内含子及2个外显子,在其5'端UTR区具有明显的启动子区,包括TATA盒及CAAT盒,没有发现GC盒及一些血吸虫基因启动子区所常见的AP-1(Active protein 1)结合位点.结论从日本血吸虫基因组文库中获得一个长1 079bp的Sj8CaBP基因片段(GenBank登录号为AY262018),经分析证明,该片段包含一个启动子区,具有TATA盒及CAAT盒的结构及1个内含子2个外显子.

    作者:彭鸿娟;陈晓光;周晓红;沈树满 刊期: 2004年第08期

  • 新生儿紫绀型先天性心脏病的彩超诊断价值

    目的探讨彩超对新生儿紫绀型先天性心脏病的诊断价值.方法对149例青紫的新生儿进行彩超检查,诊断紫绀型先心病25例并分析其疾病类型.结果25例紫绀型先心病中存在大动脉转位、法乐四联症、单心室、永存动脉干等复杂畸形,其中大动脉转位多见,其次为法乐四联症,单心室位居第3.结论彩超可作为青紫新生儿先心病的常规筛查手段.

    作者:李彬;龙振荣;刘卓华 刊期: 2004年第08期

  • 猫颅脑火器性伤早期软脑膜血管管径及血流量变化

    目的研究猫在低速弹所致火器性颅脑损伤(CMW)后软脑膜微循环的改变.方法用气枪制作猫CMW模型,观察损伤前后软脑膜微血管的管径(D)、血流速度(V)、血流量(Q)及脑组织的病理学变化.结果(1)软脑膜细动脉Da、Va和Qa在伤后5~20 min期间明显降低,45 min后逐渐恢复,并且Qa和Da超过伤前水平.(2)伤后软脑膜细静脉Dv即超过伤前水平,而Vv伤后一直偏低,Qv在45min后升高超过伤前呈淤血状态.结论(1)CMW后出现微循环障碍,导致脑缺血缺氧,引起神经功能障碍;(2)CMW45 min后挫伤区、震荡区脑微循环出现代偿性微血管血流量增加,进一步导致缺血后再灌流损伤.

    作者:王凡;陈长才;毛伯镛;游潮;徐如祥 刊期: 2004年第08期

南方医科大学学报杂志

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主管:广东省教育厅

主办:南方医科大学